Estudio In Vivo del metabolismo de glucosa en ratones alimentados con dieta alta en grasas mediante prueba de tolerancia a la glucosa Oral (OGTT) y prueba de tolerancia a insulina (ITT)

El objetivo general de estos procedimientos es caracterizar el fenotipo metabólico general de ratones y evaluar específicamente las alteraciones en el metabolismo de la glucosa in vivo. Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo del metabolismo. Son herramientas representativas y poderosas para investigar la influencia de factores genéticos, farmacológicos o dietéticos en el metabolismo de la glucosa in vivo.

La principal ventaja de estas técnicas es que son relativamente fáciles de realizar. El día antes de la prueba de tolerancia oral a la glucosa, transfiera a los ratones a una jaula con ropa de cama fresca y agua potable, pero sin comida para ayunarlos durante la noche antes de la prueba. Al día siguiente, prepare 10 mililitros de solución de glucosa al 20% diluyendo 45%D-glucosa en agua destilada.

A continuación, prepare una placa para la recolección de plasma añadiendo cinco microlitros de EDTA sódico por punto de tiempo para cada ratón a los pocillos de una placa de 96 pocillos. Durante el experimento, guarde este plato en hielo. A continuación, mida el peso corporal de todos los ratones y marque sus colas con un marcador permanente para que los ratones se distingan fácilmente.

Para recolectar sangre para la toma de muestras de referencia, use tijeras afiladas para cortar cuidadosamente uno o dos milímetros de la punta de la cola. Limpie la primera gota de sangre para evitar la hemólisis o la contaminación con líquido tisular antes de tomar nuevas muestras de sangre para la determinación de la glucosa en sangre. Extraiga una pequeña muestra de sangre para medir el nivel basal de glucosa en sangre con el glucómetro.

A continuación, recoja una muestra de sangre más grande con un tubo capilar nuevo. Vacíe el tubo capilar con una pipeta colocando la punta de la pipeta en la parte superior del extremo del tubo capilar y empujando con cuidado la sangre recolectada en un pocillo de la placa de 96 pocillos evitando las burbujas de aire. Preparar 20%D-glucosa disuelta en agua destilada.

Para administrar una solución de glucosa, primero sujete al ratón agarrándolo firmemente por el pescuezo. Aplique suficiente firmeza a la piel alrededor del cuello para evitar que el ratón se tuerza y para inclinar la cabeza hacia atrás. Asegúrese de que el ratón pueda respirar correctamente.

Luego, dirija con cuidado la aguja de alimentación a través de la boca hacia el esófago. Deja que el ratón trague la aguja. Después de que la aguja se hunda en la parte inferior del esófago del ratón, inyecte la solución de glucosa.

Inicie el temporizador inmediatamente después de la primera sonda y administre glucosa a todos los demás ratones en intervalos de un minuto. Una vez que se inicia la administración de glucosa, es muy importante una buena gestión del tiempo. Después de 15 minutos, mida los niveles de glucosa en sangre con el glucómetro como antes.

Y luego tomar otra muestra de sangre de 30 microlitros de cada ratón en el mismo orden en que se inyectaron. La extracción de sangre debe repetirse 30, 45, 60, 90, 120, 150 y 180 minutos después de la administración de glucosa. Asegúrese de que los ratones tengan acceso a agua potable durante este tiempo.

Cuando terminen las mediciones, regrese a los ratones a sus jaulas domésticas equipadas con comida y agua. A continuación, centrifugar las muestras de sangre a 2.500 veces G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera el sobrenadante de plasma a los pocillos vacíos de la placa de 96 pocillos.

Y luego almacene la placa a menos 20 grados centígrados hasta el análisis. Al menos una semana después de la prueba de tolerancia a la glucosa, ayune los ratones durante un mínimo de dos horas antes de la inyección de insulina para asegurarse de que los ratones tengan acceso al agua potable. Diluir la solución madre de insulina de uno a mil con cloruro de sodio al 0,9% y preparar la glucosa al 20% de D-glucosa disuelta en agua destilada para administrarla si los ratones se vuelven hipoglucémicos.

Después de pesar a los ratones y marcar sus colas, calcule el volumen de insulina necesario para administrar 0,75 unidades de insulina por kilogramo de peso corporal. Luego, corte la punta de la cola con unas tijeras afiladas y mida los niveles basales de glucosa en sangre como antes. Para inyectar insulina por vía intraperitoneal, sujete al ratón por el método del pescuezo e incline la cabeza del ratón hacia abajo en un ligero ángulo para exponer el lado ventral del animal.

Coloque la jeringa llena en un ángulo de 30 grados en el cuadrante inferior derecho del abdomen del animal e inyecte el volumen con el bisel de la aguja estéril de calibre 30 girada hacia arriba. Inicie el temporizador inmediatamente después de inyectar el primer mouse. Mida los niveles de glucosa en sangre en puntos de tiempo seleccionados.

Después de los últimos puntos de tiempo, vuelva a colocar a los ratones en sus jaulas caseras preparadas con abundante comida y agua. La prueba de tolerancia oral a la glucosa se empleó para comparar el fenotipo metabólico de ratones alimentados con una dieta alta en grasas durante 12 semanas con ratones alimentados con una dieta baja en grasas. En los ratones LFD tolerantes a la glucosa, el nivel máximo de glucosa en sangre de aproximadamente 240 miligramos por decilitro se alcanzó aproximadamente 15 minutos después de la administración de glucosa e inmediatamente seguido por una disminución hacia el nivel basal que indica una eliminación adecuada de glucosa.

En contraste, los ratones HFD alcanzaron un máximo de aproximadamente 320 miligramos por decilitro de glucosa y casi no mostraron eliminación de glucosa. Debido a que los niveles de glucosa en sangre entre los dos grupos difieren en el estado de ayuno, se realizó un cálculo del área bajo la curva por encima de la glucosa basal, y esto validó los resultados anteriores. Además, los niveles de insulina en sangre se determinaron mediante un ELISA de insulina.

Los ratones alimentados con HFD mostraron niveles elevados de insulina en ayunas en comparación con el grupo de control, así como una mayor respuesta a la insulina, lo que indica hiperinsulinemia compensatoria inducida por HFD. Para medir la sensibilidad a la insulina en los ratones alimentados con HFD, se realizó una prueba de tolerancia a la insulina una semana después de la prueba de tolerancia oral a la glucosa. En comparación con el grupo de control alimentado con LFD, los ratones alimentados con HFD mostraron una reducción alterada de los niveles de glucosa en sangre después de la administración de insulina, lo que sugiere resistencia a la insulina.

Al intentar este procedimiento, es especialmente importante mantener una buena gestión del tiempo, así como reducir los niveles de estrés de los ratones al mínimo para generar resultados sólidos y reproducibles. Las diferencias en la tolerancia a la glucosa, los niveles de insulina y la sensibilidad a la insulina, que se obtienen por el porcentaje de métodos, pueden ayudar a combinar los siguientes pasos complejos. Esto puede incluir, por ejemplo, afirmaciones hiperglucémicas o hiperinsulinémicas o experimentos con islotes pancreáticos aislados.