Distinción simultánea de monoespecíficas y patrones mixtos DFS70 durante la proyección de ANA con un sustrato de la novela nocaut en ELITE/DFS70 HEp-2

El objetivo general de este procedimiento es demostrar un ensayo inmunofluorescente indirecto mejorado que utiliza un sustrato knockout 70 denso moteado fino 70 de HEp-2 para detectar autoanticuerpos antinucleares y confirmar simultáneamente patrones 70 monoespecíficos y mixtos de moteado fino denso. El sustrato Novel HEp-2 utiliza un procedimiento estándar de inmunofluorescencia indirecta y criterios de interpretación para el cribado de anticuerpos antinucleares clínicamente relevantes, que también se conocen como ANA. La principal ventaja es la capacidad de distinguir el patrón 70 moteado fino denso de los patrones mixtos asociados a la enfermedad, homogéneos o mixtos desafiantes en el paso de detección.

La comprobante del procedimiento estará a cargo de Sofia Badanin, técnica de nuestro laboratorio de control de calidad. Para los portaobjetos de sustrato, utilice portaobjetos de vidrio con 12 pocillos en cada portaobjetos, que contengan las células HEp-2 convencionales o una mezcla de células HEp-2 convencionales y densas de 70 células HEp-2 de moteado fino. Permita que las bolsas que contienen los portaobjetos de sustrato se equilibren a temperatura ambiente para obtener un rendimiento óptimo y evitar la condensación de humedad en la superficie del portaobjetos antes de la adición de la muestra.

Esto debería tomar entre 10 y 15 minutos. Una vez que esté equilibrado a temperatura ambiente, retire con cuidado los portaobjetos del sustrato con los dedos, evitando el contacto entre los portaobjetos y los lados de la bolsa. Etiquete los portaobjetos y colóquelos en una cámara de incubación que haya sido forrada con toallas de papel humedecidas para evitar que los portaobjetos se sequen durante la incubación de muestras y conjugados.

Dispensar aproximadamente 50 microlitros de los controles negativos y positivos, así como los sueros diluidos del paciente, en pocillos de portaobjetos individuales antes de colocar los portaobjetos en la cámara de incubación. La prueba de ANA es el primer paso en la detección de una enfermedad autoinmunitaria. Es fundamental que se evite la contaminación cruzada de las muestras de pacientes en el portaobjetos para minimizar los resultados falsos positivos o falsos negativos.

Para evitar la contaminación cruzada de los pozos, evite llenar en exceso los pozos. Coloque la tapa en la cámara de incubación e incube los portaobjetos durante 30 minutos a temperatura ambiente. Si hay algún ANA presente en el suero del paciente, se unirá a las células presentes en cada voluntad durante este tiempo.

Una vez finalizado el período de incubación, retire el portaobjetos de la cámara de incubación. Sostenga el portaobjetos en el extremo de la lengüeta y enjuague suavemente durante 10 a 15 segundos con aproximadamente 10 mililitros del tampón de lavado salino tamponado con fosfato reconstituido. Transfiera el portaobjetos inmediatamente a un frasco Coplin con tampón de lavado PBS y remoje durante 10 minutos.

Repite el proceso con todas las diapositivas restantes. Retire solo un portaobjetos a la vez del frasco Coplin. Para eliminar el exceso de tampón de lavado PBS del portaobjetos, golpee suavemente o seque el portaobjetos con una toalla de papel.

En cada pocillo, aplique suavemente una gota de isotiocianato de fluoresceína, conjugado fluorescente anti-IgG humano marcado. A continuación, incube los portaobjetos en la cámara de incubación de tinción cerrada durante 30 minutos. Una vez finalizado el período de incubación, retire el portaobjetos de la cámara de incubación.

Sostenga el portaobjetos en el extremo de la lengüeta y enjuague suavemente como antes, con aproximadamente 10 mililitros de tampón de lavado PBS. Transfiera el portaobjetos inmediatamente a un frasco Coplin con tampón de lavado PBS y remoje durante 10 minutos. Coloque los cubreobjetos que se proporcionan en el kit sobre una toalla de papel seca.

En el borde inferior del cubreobjetos, aplique entre 3 y 4 gotas de los medios de montaje en línea. A continuación, saque una diapositiva a la vez del frasco Coplin que contiene el tampón de lavado. Para eliminar el exceso de tampón de lavado, golpee suavemente o seque el portaobjetos en la toalla de papel.

Evite dejar una cantidad excesiva de tampón de lavado en la corredera, aplicar demasiada presión sobre el cubreobjetos o introducir burbujas de aire. Todo esto puede afectar la morfología celular, los patrones fluorescentes resultantes y la intensidad de las reacciones. Baje el portaobjetos suavemente sobre el cubreobjetos, colocando el borde inferior del portaobjetos en el borde del cubreobjetos.

Esto permite que los medios de montaje presentes en el cubreobjetos fluyan hacia el borde superior del portaobjetos y minimiza la formación de burbujas de aire, que pueden interferir con la lectura de cada pocillo. Vea los portaobjetos con un microscopio fluorescente, utilizando un conjunto de filtros de isotiocianato de fluoresceína ubicado en un cuarto oscuro. Examine la muestra en busca de fluorescencia verde brillante específica bajo el microscopio a un aumento de 200 veces o más para hacer la interpretación final con respecto a la positividad y el patrón.

Observe los controles positivos y negativos. El control positivo mostrará una fluorescencia verde brillante en el núcleo. El control negativo no mostrará ninguna fluorescencia verde específica bajo un microscopio de fluorescencia.

Registre el resultado positivo o negativo de cada pozo e incluya el patrón de ANA para los casos positivos. El sustrato knockout denso y moteado fino 70 de HEp-2 conserva todos los principales patrones nucleares y citoplasmáticos. El patrón denso y fino moteado se caracteriza por la presencia de tinción moteada uniformemente distribuida en todo el núcleo de la interfase y la cromatina en la fase mitótica.

La presencia de células HEp-2 convencionales que expresan un antígeno 70 denso y fino moteado y células HEp-2 diseñadas sin el antígeno facilita la distinción precisa del patrón 70 denso y fino moteado, al tiempo que conserva todas las ventajas de los sustratos HEp-2 convencionales. Los sueros positivos para los patrones de ANA asociados a enfermedades importantes se mezclaron con un suero denso y fino moteado 70 patrón positivo en proporciones iguales y se probaron tanto en sustratos convencionales de HEp-2 como en sustratos HEp-2 densos y finos moteados 70 knockout. Aquí, las flechas rojas indican células en fase mitótica.

Las flechas amarillas indican los núcleos HEp-2 convencionales y las flechas azules indican los núcleos HEp-2 diseñados. Para todas las combinaciones de reacciones representadas, el sustrato de 70 knockout denso y moteado finamente muestra una clara diferencia de intensidad entre las células no modificadas y las células modificadas en el mismo campo de visión. Esto ayuda a distinguir las reacciones monoespecíficas y mixtas, densas, finas, moteadas 70.

Los autoanticuerpos contra antígenos nucleares y citoplasmáticos son altamente prevalentes en las enfermedades autoinmunes sistémicas. Se ha informado que el patrón denso y moteado fino resultante de los autoanticuerpos contra DFS70, también conocida como proteína PSIP1, es altamente prevalente en poblaciones sanas. Además, estos autoanticuerpos DFS70 se producen tanto de forma aislada como con otros ANA asociados a la enfermedad.

Esto hace que sea fundamental que los laboratorios clínicos distingan con precisión este patrón de otros patrones asociados a enfermedades. Por ejemplo, en el patrón moteado homogéneo mixto, que se asocia con lupus, podría interpretarse erróneamente como un patrón DFS70 que requiere múltiples ensayos confirmatorios. El método de inmunofluorescencia indirecta que utiliza sustratos de HEp-2 se considera el método de cribado de referencia para las ANA.

Sin embargo, la precisión depende en gran medida de la habilidad del técnico, la ejecución cuidadosa de los pasos individuales y la interpretación precisa de los patrones resultantes. Por el contrario, la evaluación comparativa de los sustratos knockout convencionales HEp-2 y DFS70 demuestra la utilidad de este nuevo sustrato para distinguir el patrón DFS70 con alta confianza, mientras se seleccionan las ANA. La interpretación posterior de los patrones DFS70 monopositivos y mixtos se simplificó relativamente utilizando este sustrato HEp-2 mejorado.

El nuevo sustrato utiliza un protocolo estándar de inmunofluorescencia indirecta y criterios de interpretación establecidos para todos los patrones de ANA clínicamente relevantes.