Name: El empleo de la gotita de PCR digital para detectar mutaciones BRAF V600E en embebidos en parafina líneas celulares de referencia estándar fijos-formalina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Aprende a detectar mutaciones BRAF V600E en muestras FFPE mediante PCR digital en gotitas. Este método automatizado permite aislar ADN de alta calidad de líneas celulares estándar para aplicaciones clínicas en oncología molecular.

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Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación y Desarrollo para la Sociedad de la Fundación Nacional de Investigación (NRF), financiado por el Ministerio de Ciencia, TIC y planificación de futuro (Grant No. 2013M3C8A1075908).

1. Extracción de ADN de líneas celulares FFPE norma de referencia Nota: Para este procedimiento, la extracción de ADN se realizó a partir de líneas celulares FFPE estándar de referencia (HD598, HD593, HD617, HD273 y de tipo salvaje (WT)) con el kit de aislamiento de ADN de tejidos FFPE como se describe en el protocolo a continuación. Extracción de ADN automatizada se logró siguiendo las instrucciones del fabricante para el aislamiento de ADN total. <ol><li> Usando un microtomo y el bloque de FFPE original, preparar manualmente secciones frescas antes de la extracción y el análisis de ADN, de acuerdo con los procedimientos establecidos. Asegúrese de que la muestra de entrada para la sección (s) tejido analizado no exceda un espesor total combinado de 10 micras y que el área superficial no excede de 600 mm 2 para una sola sección. </li></ol> 1.2 protocolo de TPS Nota: Los volúmenes mostrados en la Tabla 1 corresponden al mínimo requerido para procesar 48 muestras, y el procedimiento demostrado es de conformidad con las directrices de TPS. Antes de iniciar el experimento asentarse las muestras FFPE en la dirección de tubo por centrifugación a 600 xg, para evitar la pérdida de las muestras durante el programa automatizado. <ol><li> Encienda el instrumento de aislamiento de ADN automático y el ordenador. Abra el software de control de ejecución e inserte una bandeja de carga automática en el área de la cubierta de carga TPS. </li><li> Dispensar reactivos en sus correspondientes canales como se muestra en la Figura 1. <ol><li> Colocar las 4 muestras (BRAF WT, BRAF V600E 50%, 5% y 1%) en los bastidores de soporte de la muestra. </li><li> Coloque las cajas de propina en los valles en las columnas 2 y 3 y comprobar los consejos para la presencia de más de un filtro por la punta, lo que abortar la ejecución. </li><li> Asegurar una mezcla adecuada del tampón de lisis y tampón de lavado mediante la inversión de ellos 3-5 veces y cargarlos en las respectivas depresiones en la columna 4 (Figura 1). </li><li> Después de invertir para el par de veces o vort leveexing, cargue el tampón de elución, perlas magnéticas, y tampón FFPE en las canaletas en la columna 5, dejando 1 ranura vacía que se indique (Figura 1, Tabla 1). </li><li> Cargue una placa de pozo profundo 2 ml (DWP) sobre la placa de soporte (Figura 1). </li></ol></li><li> Lleve a cabo los siguientes pasos finales antes de iniciar una carrera: <ol><li> Destape todos los tubos y valles de reactivos. Confirme que suficiente capacidad disponible en la botella de residuos líquidos. Confirme que la botella de residuos sólidos está vacía y forrado con una bolsa de riesgo biológico. Confirme que la placa de expulsión de punta se centra en la asamblea de residuos. </li><li> Cierre la cubierta frontal. </li></ol></li><li> Inicie el software. Abra el archivo NA_Prep_Main_MLSTARlet.med. </li><li> Haga clic en &quot;Start&quot;. El estado del instrumento cambiará desde el ralentí hasta correr. </li><li> Introduce el número de muestras para esta ejecución. Elegir el método deseado para esta ejecución (ADN = 0). Introduzca la posición de la primera alta volume punta, la selección de &quot;1&quot; si todas las bandejas están llenas. Introduzca la posición del primer consejo de volumen estándar, la selección de &quot;1&quot; si todas las bandejas están llenas. Nota: El instrumento se ejecutará a través de pasos automatizados sin intervención del usuario. Un flujo de trabajo detallado se muestra en la Figura 2. Una vez que se terminó el experimento, los residuos de reactivos y consejos se inyectan en el conjunto de residuos. </li><li> Cuantificar el ADN genómico purificado mediante el uso de un método fluorométrico. Nota: las muestras de ADN que contienen una concentración mínima de 3,3 ng / l se someten a análisis ddPCR (sección 2). </li></ol> 2. ADN Mutación Profiling: Protocolo ddPCR Nota: El protocolo para el perfilado mutación del ADN consta de 3 pasos principales: 1) la generación de gotas, 2) amplificación por PCR convencional, 3) la lectura de la gotita y 4) de perfiles de mutación del ADN. 2.1. Generación Gotita Nota: ddPCR supermix esrecomendado para ddPCR, ya que esta mezcla contiene los reactivos necesarios para la generación de gotitas. <ol><li> Para evitar la contaminación, siga las precauciones estándar, tales como el uso de guantes, con una capucha limpia PCR, pipetas limpias, y los tubos de unión de baja en proteínas. </li><li> Asegúrese de que la concentración mínima de muestra de ADN genómico humano es de 3,3 ng / l. Nota: La cantidad de concentración de la muestra de ADN purificado variará basado en el análisis de detección de frecuencia% mutación. </li><li> Montar mezclas de reacción de PCR en placas de 96 pocillos. Descongelar y equilibrar los componentes de la reacción a RT. Preparar las reacciones de PCR mediante la combinación de 2X ddPCR Supermix (10 l) y 20 cebadores (directo e inverso, 900 nM) y la sonda (250 nM) con cada muestra de ADN purificado (66ng / 2 l) hacer hasta 20 l con agua destilada (como se por el protocolo generador de gotitas) </li><li> Vórtex con la mezcla a fondo para asegurar la homogeneidad y centrifugar brevemente para recoger el contenido en la parte inferior del tubo antes de la dispensación. Cargar 20 &amp; #181; l en el cartucho para la formación de gotas. </li><li> El funcionamiento del generador de gotas, según el protocolo recomendado por el fabricante <ol><li> Insertar el cartucho en el soporte con la muesca en el cartucho situado en el lado superior izquierdo del soporte. Añadir 20 l de mezcla de reacción que contiene muestras en el medio, y 70 l de aceite de generador en los pocillos de fondo. </li><li> Coloque la junta en la parte superior del cartucho. Asegúrese de que la junta esté firmemente enganchado en ambos extremos del titular; de lo contrario, no se logrará una presión suficiente para la generación de gotitas. </li><li> Abra el generador de gotas pulsando el botón verde en la parte superior del instrumento e inserte el cartucho. Cuando el soporte está en la posición correcta, tanto el poder (de izquierda a la derecha) y el soporte (centro derecha) luces indicadoras son de color verde. </li><li> Presione el botón superior en el instrumento de nuevo para cerrar la puerta e iniciar la generación de gotas. Nota: Después de pulsar el button, a sí mismo múltiples posiciones en los pozos de salida, dibujo petróleo y las muestras a través de los canales de microfluidos, donde se crean gotas. Las gotas fluyan hacia la gota así, donde se acumulan. La luz indicadora de gota (a la derecha) parpadea en verde después de 10 segundos para indicar que la generación de gotas está en curso. </li><li> Cuando la generación de gotas es completa, los 3 indicadores luminosos cambian de color verde; abrir la puerta pulsando el botón y retire el soporte de la unidad. Retire la junta desechable del soporte y descartarlo. Nota: Los pocillos superiores del cartucho contienen gotitas, y los pocillos medio e inferior son casi vacío, con una pequeña cantidad de aceite residual. </li></ol></li></ol> 2.2. Preparación para la PCR <ol><li> Para cada muestra, pipetear a cabo 40 l de los contenidos de gotitas desde la parte superior así los cartuchos en un solo pocillo de una placa de 96 pocillos PCR recomendadas tal como se indica en el protocolo del fabricante del instrumento. Sinte: Con una pipeta multicanal es ideal para la transferencia de las emulsiones de gotitas. Se recomienda la aspiración lenta y suave de gotas para minimizar esquila de gota durante los traslados. </li><li> Selle la placa de PCR con papel inmediatamente después de la transferencia de las gotas para evitar la evaporación. Utilice sellos de placa lámina perforables que son compatibles con el sellador de placas PCR y las agujas en el lector de gotas. Siga las instrucciones del manual de instrucciones sellador de placas PCR. </li><li> Ajuste la temperatura de la placa selladora a 180 ° C y el tiempo de 5 seg. </li><li> Toque la flecha para abrir la puerta de la bandeja. Coloque el bloque de soporte en la bandeja con la cara de 96 pocillos para arriba. Coloque la placa de 96 pozos en el bloque de ayuda y asegurarse de que todos los pocillos de la placa están alineados con el bloque de soporte. </li><li> Cubra la placa de 96 pocillos con 1 hoja de papel de aluminio sellado perforable. Una vez que la placa de 96 pocillos se fija en el bloque de soporte y se cubre con el sello de aluminio que se puede perforar, toque el botón del sello. La bandeja se cerraráy termosellado iniciará. </li><li> Cuando termosellado es completa, la puerta se abre de forma automática; retire la placa del bloque de calor de ciclos térmicos y luego retire el bloque de calor. </li><li> Asegúrese de que todos los pozos de la placa están sellados comprobando que las depresiones en la lámina son evidentes sobre cada pocillo. Una vez sellado, el plato está listo para el ciclo térmico. </li><li> Una vez que se eliminan las gotas, presione los pestillos en el soporte del cartucho para abrirla. Retire el cartucho vacío y deséchelo. </li><li> Realizar la amplificación por PCR convencional siguiendo los parámetros detallados en la Tabla 2. </li></ol> 2.3 la lectura de la gotita (según el protocolo recomendado por el fabricante) Nota: Después de la amplificación por PCR del ácido nucleico diana en las gotitas, el instrumento lector de gotita analiza cada gotita de forma individual utilizando un sistema de detección de 2 colores 13. Normalmente nos propusimos detectar un FAMfluoróforos reportero d VIC. <ol><li> Haga clic en &quot;sistema Flush&quot; para cebar el lector de gota y que quede listo para el análisis ddPCR. </li><li> Cargue la placa en el lector de la gotita y haga clic en &quot;start&quot;. El lector gotita aspira cada muestra, singulariza las gotas, y los arroyos en fila junto a un detector de 2 colores. El detector lee las gotitas para enumerar muestras positivas y negativas. </li><li> Cuando la lectura de gota, abra la puerta y retire el soporte de la placa de la unidad. Retire la placa de PCR de 96 pocillos del soporte y descartarlo. </li><li> Para el mantenimiento adecuado, reemplace el aceite lector de gota y vaciar el recipiente de residuos, según sea necesario. Añadir 50 ml de 10% de lejía a la botella de residuos para prevenir el crecimiento microbiano. </li></ol> 2.4 ADN perfiles mutación (según el protocolo recomendado por el fabricante) Nota: Las gotas de PCR-positivos y PCR-negativos se cuentan para proporcionar quantific absolutaación de las mutaciones del ADN diana BRAF V600E en forma digital, utilizando el software de análisis de datos. <ol><li> Haga clic en Configuración para introducir información sobre las muestras, ensayos y experimentos. </li><li> En la ventana de configuración, cargue una placa (filename.qlp), a continuación, haga clic en Analizar para abrir y analizar los datos. La interfaz de análisis de datos se divide en tres ventanas: Resultados de mesa, Selector Bueno y Procesado de Datos / pantalla gráfica. </li><li> En la ventana de datos procesados, los datos de concentración para cada objetivo aparecen en los pozos en el mapa plato y se tabulan en la Tabla de Resultados. Haga clic Concentración de visualizar datos en parcelas de concentración. </li></ol>

<ol><li>Vogelstein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+alterations+during+colorectal-tumor+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Genetic alterations during colorectal-tumor development.</a> The New England journal of medicine. 319, 525-532 (1988).</li>
<li>Davies, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+of+the+BRAF+gene+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutations of the BRAF gene in human cancer.</a> Nature. 417, 949-954 (2002).</li>
<li>Solit, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRAF+mutation+predicts+sensitivity+to+MEK+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">BRAF mutation predicts sensitivity to MEK inhibition.</a> Nature. 439, 358-362 (2006).</li>
<li>Wong, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+anti-cancer+agents+targeting+the+Ras%2FRaf%2F+MEK%2FERK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+patents+on+anti-cancer+drug+discovery%22%5BJournal%5D)">Recent developments in anti-cancer agents targeting the Ras/Raf/ MEK/ERK pathway.</a> Recent patents on anti-cancer drug discovery. 4, 28-35 (2009).</li>
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<li>Milbury, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+lower+limits+of+detection+of+digital+PCR+assays+for+cancer-related+gene+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+detection+and+quantification%22%5BJournal%5D)">Determining lower limits of detection of digital PCR assays for cancer-related gene mutations.</a> Biomolecular detection and quantification. 1, 8-22 (2014).</li>
<li>Zhu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Sensitive+Droplet+Digital+PCR+Method+for+Detection+of+EGFR+Activating+Mutations+in+Plasma+Cell-Free+DNA+from+Patients+with+Advanced+Non-Small+Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+molecular+diagnostics%3A+JMD%22%5BJournal%5D)">Highly Sensitive Droplet Digital PCR Method for Detection of EGFR Activating Mutations in Plasma Cell-Free DNA from Patients with Advanced Non-Small Cell Lung Cancer.</a> The Journal of molecular diagnostics: JMD. , (2015).</li>
<li>Fan, H., Gulley, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+extraction+from+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">DNA extraction from paraffin-embedded tissues.</a> Methods in molecular medicine. 49, 1-4 (2001).</li>
<li>Nadauld, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+Sensitive+Detection+of+Cancer+Genome+Amplifications+from+Formalin+Fixed+Paraffin+Embedded+Tumors+with+Droplet+Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Quantitative and Sensitive Detection of Cancer Genome Amplifications from Formalin Fixed Paraffin Embedded Tumors with Droplet Digital PCR.</a> Translational medicine. 2, (2012).</li>
</ol>

Myung Ryuri Oh, Si Eun Kim, y Young Deug Kim son empleados de ABION CRO.

En este sentido, destacamos la aplicabilidad de ddPCR y el aislamiento de ADN a partir de muestras de líneas celulares estándar FFPE de referencia para una evaluación específica de mutación genética. En este estudio, se utiliza TPS método de aislamiento de ADN automatizado que se puede adaptar fácilmente y automatizado, y tiene capacidad para un máximo de 48 muestras diferentes de forma simultánea, lo que permite más grandes experimentos a escala y una menor variabilidad. Una de las limitaciones del aislamiento del ADN ...

La acumulación de mutaciones genéticas en genes reguladores clave altera la programación normal de las células como la proliferación celular, la diferenciación y la supervivencia, que conduce al cáncer 1. La vía RAS-RAF quinasa MAP media las respuestas celulares a las señales de crecimiento. Mutaciones oncogénicas BRAF pueden resultar de mutaciones del conductor en el gen BRAF, que pueden causar la BRAF oncoproteína para convertirse hiperactiva 2. Las mutaciones en el gen BRAF también dan lugar a la señalización aguas abajo hiperactiva MEK y ERK 3, que, a su vez, conduce a un crecimiento celular excesivo y la proliferación independiente de factor de crecimiento mediada por la regulación 4-6. Varias herramientas están disponibles para perfilar mutación del ADN, como en tiempo real mutaciones BRAF V600E cuantitativos en fijado en formol, embebidos en parafina (FFPE) referencia las líneas celulares estándar por ddPCR. ddPCR es un método basado en la PCR para la cuantificación absoluta-ofreciendo una mayor precisión en comparación con el tiempo real convencional de PCR cuantitativa (qPCR) 7,8. ddPCR también proporciona mayor poder de resolución y la precisión para la detección de mutaciones raras en plantillas de ADN, lo que permite la investigación del cáncer más informativo y diagnóstico 9. Las ventajas adicionales de ddPCR sobre qPCR convencional incluyen su mayor sensibilidad y precisión cuando se estudia el número de copias bajo plantilla 10-12. En este documento, un protocolo para la extracción automática de ADN de referencia FFPE líneas celulares estándar, seguido por la determinación de la presencia o ausencia de mutaciones BRAF V600E por ddPCR se demuestra. También se describen el uso de software para el análisis de datos y una representación gráfica de los resultados. Todo el procedimiento es relativamente simple y totalmente depende del número de muestras que se perfilados y el número de máquinas de PCR y ddPCR convencionales disponibles. El siguiente protocolo describe los procedimientos estándar para BR<html> FFPE de referencia líneas celulares estándar AF V600E-positivos (HD598, HD593, HD617, HD273 y de tipo salvaje (WT)) se realiza en un instrumento totalmente automatizado usando el protocolo Tissue Sistema de Preparación de (TPS). Posteriormente, se analizaron muestras de ADN aisladas de la presencia de mutaciones BRAF V600E utilizando sistema ddPCR. Análisis de la mutación se realiza después se han perfilado todas las muestras y los datos se ha cargado en el software de análisis de datos. Dependiendo del número de muestras / grupos estudiados, análisis de datos puede requerir de una a varias horas. El componente experimental de la metodología requiere precisión en la manipulación de <a href="http://www.jove.com/science-education/5096/isolating-nucleic-acids-from-yeast" title="Aislamiento de ácidos nucleicos a partir de levadura, un video Educación JoVe Ciencia explicar más acerca sobre el contexto de ARN">ADN</a> yrológicos Pipetas y pipetas, un video JoVe Educación Ciencia explicar más acerca sobre el contexto de pipeteo &quot;&gt; pipeteo en placas de 96 pocillos, mientras que el análisis de datos se realiza mediante software.

<table><tbody><tr><td>Hamilton MICROLAB STARlet IVD</td><td>instrument Siemens</td><td>10701001</td><td>Automated DNA isolation instrument</td></tr><tr><td>QX200 Droplet Generator&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>772BR1119</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Lector de gotas</td><td>Bio-Rad</td><td>771BR1497</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de PCR convencional capaz de ajuste de tiempo de rampa</td><td></td><td>621BR17718</td><td></td></tr><tr><td>PX1 Selladora de placas PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>770BR1575</td><td></td></tr><tr><td>Software QuantaSoft</td> Kit <td>de aislamiento de ADN Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VERSANT Reactivos de Preparación de Tejidos Caja 1&nbsp;</td><td>Siemens</td><td>10632398</td><td></td></tr><tr><td>VERSANT Reactivos de preparación de tejidos Caja 1&nbsp;</td><td>Consejos de Siemens</td><td>10632399</td><td></td></tr><tr><td>CO-RE</td><td>Siemens</td> ddPCR análisis <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>de<td>mutaciones</td></tr><tr><td>ddPCR Supermix&nbsp;</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>BR186-3010</td><td></td></tr><tr><td>Cartucho DG8 de concentración 2X&nbsp;</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>BR186-4008</td><td></td></tr><tr><td>Aceite generador de gotas</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>BR-186-3005</td><td></td></tr><tr><td>Junta</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>BR186-3006</td><td></td></tr><tr><td>Aceite lector de gotas</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>BR-186-3004</td><td></td></tr></tbody></table>

el empleo de la gotita de pcr digital para detectar mutaciones braf v600e en embebidos en parafina líneas celulares de referencia estándar fijos-formalina

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

ddPCR es un método de PCR altamente sensible que utiliza un sistema de emulsión de agua y aceite. Usando un generador de gotas, una muestra de ácido nucleico extraída se divide en ~ 20,000 gotas de agua en aceite de tamaño nanométrico, y la amplificación de PCR ocurre en gotas individuales. El enfoque de ddPCR consiste en identificar mutaciones en secuencias, alteraciones en el número de copias y seleccionar reordenamientos estructurales que involucran genes específicos. Aquí, demostramos el uso de ddPCR como una técnica poderosa para cuantificar con precisión mutaciones raras de BRAF V600E en líneas celulares estándar de referencia FFPE, lo cual es útil para identificar a las personas con cáncer. En conclusión, la técnica de ddPCR ofrece el potencial de perfilar con precisión las mutaciones raras específicas en diferentes genes en varios tipos de muestras de FFPE.

Para nuestro análisis ddPCR, estudiamos las de referencia FFPE mutación líneas celulares estándar BRAF V600E. El lector de gota se conecta a un software de análisis de datos portátil ordenador en funcionamiento. Cada gotita individual se define sobre la base de la amplitud fluorescente como positivo o negativo. El software proporcionado por el fabricante también permite un punto de corte definido por el usuario a introducir para definir el umbral entre las gotitas positivos y negativos. El número de gotitas pos...

El objetivo de este video es demostrar cómo llevar a cabo la extracción de ADN automatizado de parafina embebido (FFPE) referencia las líneas celulares estándar fijado en formol y gotita digital de PCR (ddPCR) análisis para detectar mutaciones raras en un entorno clínico. La detección de mutaciones en muestras de FFPE demuestra la utilidad clínica de ddPCR en muestras FFPE.

El empleo de la gotita de PCR digital para detectar mutaciones BRAF V600E en embebidos en parafina líneas celulares de referencia estándar fijos-formalina

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

El objetivo general de este experimento es aislar ADN genómico humano a partir de líneas celulares de referencia estándar en formato fijado con formalina e incluidas en parafina, utilizando un sistema de preparación de tejidos, seguido del análisis de las mutaciones BRAF V600E en el ADN genómico mediante digital droplet. La PCR en gotas digitales (ddPCR) puede ayudar a responder preguntas clave en oncología molecular, como la presencia y abundancia de mutaciones en secuencias de AR, así como la cuantificación de ácidos nucleicos cuando el número de copias de la plantilla es bajo. Aunque este método se está demostrando en líneas celulares estándar, también puede utilizarse en otras muestras biológicas, siempre y cuando se optimicen las condiciones para aislar el ADN de interés.Este sistema de preparación de tejido puede utilizarse para aislar hasta 48 muestras de ADN genómico humano libre de contaminantes en menos de cuatro horas en comparación con otros procedimientos manuales. Este sistema es algo costoso para la preparación debido al uso de perlas magnéticas. Sin embargo, es más seguro y produce ADN de alta calidad. Se demostrará la técnica un investigador A y un técnico de nuestro laboratorio.La extracción de ADN se realizará en un instrumento de aislamiento de ADN completamente automatizado utilizando el sistema de preparación de tejidos o el protocolo TPS. Comience encendiendo el instrumento y la computadora. Abra el software de control de corridas e inserte una bandeja de carga automática en el área de carga del módulo TPS.A continuación, distribuya los reactivos en sus canales correspondientes como se muestra en esta figura y coloque las cuatro muestras en la bandeja portamuestras. Asegure una mezcla adecuada del tampón de lisis y los tampones de lavado invirtiéndolos de tres a cinco veces y luego dispénselos en los canales respectivos de la columna cuatro. Después de invertirlos varias veces o agitar suavemente en vórtex, cargue el tampón de elución, las perlas magnéticas y el tampón FFPE en los canales pequeños de la columna cinco, dejando dos espacios vacíos en los lugares indicados.Coloque una placa de pocillos profundos de dos mililitros en el portaplacas. Antes de iniciar un análisis, coloque las tapas en todos los tubos y en las cubetas de reactivos. Confirme que haya capacidad suficiente en la botella de desecho líquido y que la botella de desecho sólido esté vacía y forrada con una bolsa de bio-peligro.Confirme que la placa de expulsión de puntas esté centrada en el ensamblaje de desecho. Cierre la tapa frontal, inicie el software y abra el ML starlet principal de preparación de ácidos nucleicos. Realice el archivo med.Haga clic en iniciar. El estado del instrumento cambiará de inactivo a en ejecución. Ingrese el número de muestras para este análisis.Seleccione el método deseado para esta ejecución. Ingrese la posición de la primera punta de alto volumen, seleccionando una. Si todas las bandejas están llenas, ingrese la posición de la primera punta de volumen estándar, seleccionando una.Si todas las bandejas están llenas, el instrumento realizará los pasos automatizados sin intervención del usuario. Se muestra aquí un flujo de trabajo detallado para evitar la contaminación. Siga las precauciones estándar, como el uso de guantes y la utilización de una campana PCR limpia.Pipetas limpias y tubos de baja unión a proteínas. Arme las mezclas de reacción en tiras de tubos para PCR, descongele y equilibre los componentes de la reacción a temperatura ambiente. La muestra de ADN genómico humano para análisis digital por gotas, PCR o D-D-P-C-R debe tener una concentración mínima de 3,3 nanogramos por microlitro.Preparar las reacciones de PCR. Combinar la mezcla súper PCR 20x con los cebadores directo e inverso y la sonda con cada muestra de ADN purificada y aforar hasta 20 microlitros con agua destilada. Agitar la mezcla vigorosamente para asegurar homogeneidad y centrifugar brevemente para recoger el contenido en la parte inferior de los tubos antes de dispensar.Operar el generador de gotas según el protocolo recomendado por el fabricante. Insertar el cartucho en el soporte con la muesca del cartucho colocada en la esquina superior izquierda del soporte. Añadir 20 microlitros de la mezcla de reacción que contiene las muestras en los pozos centrales y 70 microlitros de aceite generador en los pozos inferiores.Coloque la junta en la parte superior del cartucho. Asegúrese de que la junta esté firmemente enganchada en ambos extremos del soporte. De lo contrario, no se alcanzará la presión suficiente para la generación de gotas.Abra el generador de gotas presionando el botón verde en la parte superior del instrumento. Inserte el cartucho cuando el soporte esté en la posición correcta. Tanto la luz indicadora de energía como la del soporte son verdes.Pulse nuevamente el botón superior del instrumento para cerrar la puerta e iniciar la generación de gotas. La luz indicadora de gotas parpadeará en verde después de 10 segundos para indicar que la generación de gotas está en curso. Cuando la generación de gotas haya finalizado, las tres luces indicadoras cambiarán a verde fijo.Abra la puerta presionando el botón y retire el soporte de la unidad. Retire la junta desechable del soporte y deséchela. Tenga en cuenta que los pozos superiores del cartucho contienen las gotas, mientras que los pozos medios e inferiores están casi vacíos, con una pequeña cantidad de aceite residual tras la generación de gotas.Prepárese para la amplificación por PCR convencional. Para cada muestra, retire 40 microlitros del contenido de las gotas desde el pocillo superior de las cartucheras hacia un solo pocillo de una placa PCR de 96 pocillos recomendada, según se indica en el protocolo del instrumento del fabricante; aspire la gota lentamente y con suavidad para minimizar la degradación por cizallamiento durante las transferencias. Inmediatamente después de transferir las gotas, la placa PCR debe sellarse para evitar la evaporación.Configure la temperatura del sellador de placas a 180 grados Celsius y el tiempo a cinco segundos. Toque la flecha para abrir la puerta de la bandeja. Coloque el bloque de soporte en la bandeja con el lado de 96 pocillos hacia arriba.Coloque la placa de 96 pocillos sobre el bloque de soporte y asegúrese de que todos los pocillos de la placa estén alineados con la tapa del bloque de soporte. La placa de 96 pocillos con una hoja de sello de aluminio. Utilice sellos de aluminio compatibles con un sellador de placas para PCR y con las agujas del lector de gotas. Una vez que la placa de 96 pocillos esté asegurada sobre el bloque de soporte y cubierta con un sello de aluminio curable.Toque el botón de sellado. La bandeja se cerrará y comenzará el calentamiento del techo. Cuando el sellado térmico esté completo, la puerta se abrirá automáticamente.Retire la placa del bloque térmico y luego retire el bloque térmico. Asegúrese de que todos los pocillos de la placa estén sellados verificando las depresiones. El papel de aluminio es claramente visible sobre cada pocillo.Una vez sellada, la placa está lista para el ciclado térmico. Realice la amplificación por PCR convencional siguiendo los parámetros detallados en el texto del protocolo. Una vez completada la amplificación por PCR del objetivo de ácido nucleico en las gotas.El siguiente paso consiste en analizar individualmente cada gota mediante un sistema de detección de dos colores. Por lo general, el instrumento lector de gotas se configura para detectar fluorocromos marcadores FAM y VIC. Haga clic en "flush system" para cebra el lector de gotas y prepararlo para el análisis de D-D-P-C-R.Coloque la placa en el lector de gotas y haga clic en iniciar. Cuando la lectura de gotas esté completa, abra la puerta y retire el soporte de la placa del equipo. Retire la placa de 96 pocillos del soporte y deséchela.Posteriormente, realice el perfilado de mutaciones del ADN utilizando software de análisis de datos, como se describe en el texto del protocolo. En este análisis D-D-P-C-R, se estudiaron las mutaciones RAF V 600 E. Se detectó la fluorescencia y se procesó en una representación gráfica de dispersión bidimensional.Se utilizó un software personalizado para trazar las compuertas adecuadas y se contó el número de gotas dentro de cada compuerta. Las gotas representadas por puntos azules por encima de la línea de corte rosa para todas las muestras son positivas. Para RAF mutado V600E y tipo salvaje BRA, las gotas se representan mediante puntos verdes en ambas gráficas.Los puntos grises en la parte inferior se consideran como el fondo de fluorescencia. Las frecuencias alélicas mutantes generales se calcularon entonces en función de los porcentajes relativos de las concentraciones de las plantillas de tipo salvaje bra y brav V 600 E detectadas en un semestre. El análisis individual de HR puede realizarse dentro de las cuatro horas siguientes a esta postura.Otras muestras, como una biopsia líquida de PPT, pueden realizarse para responder preguntas adicionales, como el monitoreo de la progresión del cáncer después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de los diagnósticos complementarios exploraran diversas detecciones de mutaciones en el campo de la oncología molecular. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar el sistema de preparación de tejidos y la reacción en cadena de la polimerasa digital por gotas para la detección específica de una mutación puntual en el ADN.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Se describe un sistema integrado para la secuenciación dirigida de próxima generación de muestras oncológicas. Este sistema multiplataforma está optimizado para biopsias tumorales de baja calidad y baja cantidad, se adapta a entradas de ADN bajas, incluye controles multivariantes bien caracterizados y cuenta con un nuevo llamador de variantes que se basa en medidas cuantitativas de control de calidad preanalítico.

Integración de Procesos húmedo y en seco de banco Optimiza Targeted secuenciación de próxima generación de baja calidad y biopsias de tumores de baja cantidad

La PCR de bloqueo de tipo salvaje seguida de secuenciación directa ofrece un método altamente sensible de detección de mutaciones somáticas de baja frecuencia en una variedad de tipos de muestras.

El bloqueo de tipo salvaje PCR Combinado con la secuenciación directa como un método altamente sensible para la detección de baja frecuencia mutaciones somáticas

Detección de ácido ribonucleico (cRNA) de la sangre que circula es una necesidad en el diagnóstico clínico. Aquí describimos los métodos que caracterizan a cRNA de pacientes con cáncer pulmonar de células no pequeñas mediante reacción en cadena de polimerasa digital sensible y específico. Las pruebas de cumplen requisitos de diseño para detectar variantes de fusión dentro de las 72 horas.

Una base de sangre de prueba para la detección de ROS1 y RET transcripciones de la fusión de circulación de ácido ribonucleico con reacción en cadena de polimerasa Digital

Aquí, presentamos un protocolo para cuantificar con precisión múltiples alteraciones genéticas de una región de destino en una sola reacción usando ddPCR de bajada y un único par de sondas de hidrólisis.

Reacción en cadena polimerasa Digital sola gota para la detección integral y simultánea de mutaciones en las regiones de Hotspot

Aquí, describimos un análisis en situ el hibridación que permite la detección sensible y específica de secuencias tan cortas como 50 nucleótidos con resolución del solo-nucleótido en el nivel unicelular. El ensayo, que se puede realizar manual o automáticamente, puede habilitar la visualización de variantes de empalme, secuencias cortas y mutaciones en el contexto del tejido.

Visualización de variantes genéticas, metas cortas y mutaciones puntuales en el contexto morfológico del tejido con un ensayo de ARN In Situ hibridación

Aquí, presentamos un protocolo para detectar mutaciones somáticas tumorales en el ADN circulante presente en fluidos biológicos del paciente (biofluidos). Nuestro método basado en la reacción en cadena de la polimerasa digital de gotas (dPCR) permite cuantificar la frecuencia alélica de la mutación tumoral (MAF), facilitando un complemento mínimamente invasivo para el diagnóstico y el monitoreo temporal de la respuesta tumoral.

Detección y seguimiento del ADN circulante asociado a tumores en biofluidos del paciente

En el presente protocolo, demostramos cómo visualizar la resección final de doble cadena de ADN durante la fase S / G2 del ciclo celular utilizando un método basado en inmunofluorescencia.

Evaluación de la resección final global de DOBLE cadena de ADN utilizando el etiquetado brdU-DNA junto con imágenes de discriminación del ciclo celular

Este protocolo proporciona un método reproducible para visualizar la amplificación de genes en muestras de tejido fijadas en formol e incluidas en parafina (FFPE).

Detección robusta de la amplificación génica en muestras fijadas en formol e incluidas en parafina mediante hibridación fluorescente in situ

Identificación de los mecanismos que subyacen a daño muscular es crucial. Aquí se presenta la técnica histológica para la preparación de parafina y las secciones congeladas de los músculos torácicos Drosophila. Esto permite el análisis de la morfología del músculo y la localización de las proteínas y otros componentes de la célula muscular.

Las secciones incluidas en parafina y congeladas de Drosophila Los músculos de Adultos

Este video muestra el protocolo para la extracción de ADN de fijado en formol e incluido en parafina de material. Este es un procedimiento de varios días en los que las secciones de tejido se deparaffinized con xileno, rehidratada con etanol y se tratan con proteinasa K para purificar y aislar el ADN para su posterior análisis de genes específicos o en todo el genoma.

Extracción de ADN a partir de material incluido en parafina para análisis genéticos y epigenéticos

Aprende a detectar mutaciones BRAF V600E en muestras FFPE mediante PCR digital en gotitas. Este método automatizado permite aislar ADN de alta calidad de líneas celulares estándar para aplicaciones clínicas en oncología molecular.

El empleo de la gotita de PCR digital para detectar mutaciones BRAF V600E en embebidos en parafina líneas celulares de referencia estándar fijos-formalina (Video) | JoVE Journal

El empleo de la gotita de PCR digital para detectar mutaciones BRAF V600E en embebidos en parafina líneas celulares de referencia estándar fijos-formalina

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