El empleo de la gotita de PCR digital para detectar mutaciones BRAF V600E en embebidos en parafina líneas celulares de referencia estándar fijos-formalina

El objetivo general de este experimento es aislar el ADN genómico humano de líneas celulares estándar de referencia formales y fijas incluidas en parafina utilizando un sistema de preparación de tejidos, seguido de un análisis de las mutaciones bra V 600 E en el ADN genómico utilizando gotas digitales. P-C-R-D-D-P-C-R Puede ayudar a responder preguntas clave en oncología molecular, como la presencia y abundancia de mutaciones en la secuencia de AR y la cuantificación de ácido nucleico con números de copias de plantilla bajos. Aunque este método se está demostrando en AEP como líneas celulares estándar, también se pueden usar en otras muestras biológicas solo para asegurarse de optimizar las condiciones para aislar su ADN de interés.

Este sistema de preparación de tejidos se puede utilizar para aislar hasta 48 muestras de ADN genómico humano libre de contaminantes en cuatro horas en comparación con otros procedimientos manuales. Este sistema es algo costoso para la preparación debido al uso de cuentas magnéticas. Sin embargo, es más seguro y producido y de alta calidad demostrando la presión será ssu A y un técnico de nuestro laboratorio.

La extracción de ADN se realizará en un instrumento de aislamiento de ADN totalmente automatizado utilizando el sistema de preparación de tejidos o el protocolo TPS. Comience por encender el instrumento y la computadora. Abra el software de control de ejecución e inserte una bandeja de carga automática en el área de carga de la plataforma TPS.

A continuación, dispense los reactivos en sus canales correspondientes como se muestra en esta figura, coloque las cuatro muestras en el estante portador de muestras. Asegúrese de mezclar correctamente el tampón de lisis y los tampones de lavado invirtiéndolos de tres a cinco veces y luego cárguelos en los canales respectivos en la columna cuatro. Después de invertir unas cuantas veces o de un vórtice leve, cargue las perlas magnéticas del tampón elucian y el tampón FFPE en los pequeños valles de la columna cinco, dejando dos ranuras vacías donde se indique.

Cargue una placa de pocillo de dos mililitros de profundidad en el portador de placas. Antes de comenzar una carrera, UNC tape todos los tubos y canales de reactivos. Confirme que haya suficiente capacidad disponible en la botella de residuos líquidos y que la botella de residuos sólidos esté vacía y forrada con una bolsa de riesgo biológico.

Confirme que la placa de expulsión de la punta esté centrada en el conjunto de desagües. Cierre la cubierta frontal, inicie el software, abra la estrella ML principal de NA prep. Do med file.

Haga clic en Inicio. El estado del instrumento cambiará de inactivo a en funcionamiento. Introduzca el número de muestras para esta ejecución.

Elija el método deseado para esta ejecución. Introduzca la posición de la primera punta de alto volumen, seleccionando una. Si todas las bandejas están llenas, introduzca la posición de la primera punta de volumen estándar seleccionando una.

Si todas las bandejas están llenas, el instrumento pasará por los pasos automatizados sin intervención del usuario. Aquí se muestra un flujo de trabajo detallado para evitar la contaminación. Siga las precauciones estándar, como usar guantes y usar una capucha PCR limpia.

Pipetas limpias y tubos de baja unión a proteínas. Ensamble las mezclas de reacción en tiras de tubo de PCR, descongele y equilibre los componentes de reacción a temperatura ambiente. La muestra de ADN genómico humano para análisis de gotas digitales, PCR o D-D-P-C-R debe tener una concentración mínima de 3,3 nanogramos por microlitro.

Prepare las reacciones de PCR. Combine los dos cebadores y la sonda X-D-D-P-C-R super mix 20 x forward and reverse con cada muestra de ADN purificada y haga hasta 20 microlitros con agua destilada. Agite la mezcla a fondo para garantizar la homogeneidad y centrifugar brevemente para recoger el contenido en el fondo de los tubos antes de dispensar.

Opere el generador de gotas según el protocolo recomendado por el fabricante. Inserte el cartucho en el soporte con una muesca en el cartucho colocada en la parte superior izquierda del soporte. Agregue 20 microlitros de mezcla de reacción que contenga muestras en los pozos intermedios y 70 microlitros de aceite para generadores en los pozos inferiores.

Coloque la junta en la parte superior del cartucho. Asegúrese de que la junta esté bien enganchada en ambos extremos del soporte. De lo contrario, no se logrará una presión suficiente para la generación de gotas.

Abra el generador de gotas presionando el botón verde en la parte superior del instrumento. Inserte el cartucho cuando el soporte esté en la posición correcta. Tanto la luz indicadora de encendido como la del soporte son verdes.

Vuelva a pulsar el botón superior del instrumento para cerrar la puerta e iniciar la generación de gotas. La luz indicadora de gotas parpadea en verde después de 10 segundos para indicar que la generación de gotas está en curso. Cuando se complete la generación de gotas, las tres luces indicadoras cambiarán a verde fijo.

Abra la puerta presionando el botón y retire el soporte de la unidad. Retire la junta desechable del soporte y deséchela. Tenga en cuenta que los pocillos superiores del cartucho contienen las gotas y los pocillos medio e inferior están casi vacíos con una pequeña cantidad de aceite residual después de la generación de gotas.

Prepárese para la amplificación por PCR convencional. Para cada tubo de muestra, se extrajeron 40 microlitros del contenido de las gotas desde el pocillo superior de los cartuchos en un solo pocillo de una placa de PCR de 96 pocillos recomendada como se indica en el protocolo del instrumento del fabricante, aspire la gota lenta y suavemente para minimizar el cizallamiento de las gotas durante las transferencias. Inmediatamente después de transferir las gotas, se debe sellar la placa PCR para evitar la evaporación.

Ajuste la temperatura del sellador de placas a 180 grados centígrados y el tiempo a cinco segundos. Toque la flecha para abrir la puerta de la bandeja. Coloque el bloque de soporte en la bandeja con el lado del pocillo 96 hacia arriba.

Coloque la placa de 96 pocillos en el bloque de soporte y asegúrese de que todos los pocillos de la placa estén alineados con la cubierta del bloque de soporte. La placa de 96 pocillos con una hoja de sello de aluminio Utilice sellos de placa de aluminio parábola que sean compatibles con un sellador de placas de PCR y las agujas en el lector de gotas. Una vez que la placa de 96 pocillos está asegurada en el bloque de soporte y cubierta con un sello de aluminio curable.

Toque el botón de sellado. La bandeja se cerrará y se iniciará el techo de calefacción. Cuando se complete el termosellado, la puerta se abrirá automáticamente.

Retire la placa del bloque de calor y luego retire el bloque de calor. Asegúrese de que todos los pocillos de la placa estén sellados revisando las depresiones. El papel de aluminio es fácilmente visible sobre cada pozo.

Una vez sellada, la placa está lista para el ciclo térmico. Realice la amplificación de PCR convencional siguiendo los parámetros detallados en el texto del protocolo. Una vez completada la amplificación por PCR del ácido nucleico objetivo en las gotas.

El siguiente paso es analizar cada gota individualmente utilizando un sistema de detección de dos colores. Por lo general, el instrumento lector de gotas está configurado para detectar fluorocuatro reporteros FAM y VIC. Haga clic en el sistema de descarga para cebar el lector de gotas y prepararlo para el análisis D-D-P-C-R.

Cargue la placa en el lector de gotas y haga clic en iniciar. Cuando se complete la lectura de gotas, abra la puerta y retire el soporte de la placa de la unidad. Eliminar. Retire la placa de pared 96 del soporte y deséchela.

Posteriormente, realice el perfil de mutaciones del ADN utilizando un software de análisis de datos como se describe en el texto del protocolo. En este análisis D-D-P-C-R se estudiaron las mutaciones RAF V 600 E. La fluorescencia se detectó y se procesó en una visualización de diagrama de dispersión bidimensional.

Se utilizó un software personalizado para dibujar las puertas apropiadas y se contó el número de gotas dentro de cada puerta. Las gotas representadas por puntos azules sobre la línea de corte rosa para todas las muestras son positivas. En el caso de las RAF V 600 E mutadas, las gotas de sujetador de tipo salvaje están representadas por puntos verdes en ambas gráficas.

Los puntos grises en la parte inferior se consideran como el fondo de fluorescencia. A continuación, se calcularon las frecuencias generales de alelos mutantes en función de los porcentajes relativos de las concentraciones de brav tipo salvaje y brav V 600 E template detectadas en un semestre. La FC con el análisis individual se puede realizar dentro de las cuatro horas siguientes a esta postura.

Otras muestras como una biopsia líquida PPT se pueden realizar para responder preguntas adicionales como el seguimiento de la progresión del cáncer después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del diagnóstico complementario exploraran varias detecciones de mutaciones en el campo de la oncología molecular. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar el sistema de preparación de tejidos y la gota digital P-C-R-S-A para un punto específico, la detección de mutaciones en el ADN.