Generación de organoides Cerebral prosencéfalo-tipo estandarizadas y reproducibles de humanos inducida por células madre pluripotentes

El objetivo general de este procedimiento es generar organoides de tipo prosencéfalo altamente estandarizados y reproducibles a partir de células madre pluripotentes humanas. Este método es una poderosa herramienta para modelar los mecanismos de las NTZ de nuevo desarrollo. En particular, puede ayudar a abordar preguntas clave asociadas con la génesis cortical humana temprana.

La principal ventaja de esta técnica es que permite la generación estandarizada y eficiente en el tiempo de tejido cortical humano con pequeñas variaciones entre organoides individuales y lotes de organoides. La tecnología de organoides puede proporcionar información sobre el desarrollo, la estructura y la función del cerebro humano, especialmente para aquellos aspectos que no se encuentran en los modelos cerebrales de las especies inferiores. Para generar agregados de células madre pluripotentes, cuando los cultivos de células madre alcancen una confluencia del 70 al 90%, agregue 500 microlitros de reactivo de disociación celular a un pocillo de la placa de cultivo de seis pocillos para separar las células.

Las células madre pluripotentes inducidas, que están adaptadas a las condiciones de cultivo de una sola capa, son un buen tipo de célula para generar agregados, ya que son menos propensas a la muerte celular inducida por el estrés durante el procedimiento de disociación y agregación. Después de cinco a 10 minutos a 37 grados centígrados, golpee suavemente la placa y use dos mililitros de DMEM / F-12 para lavar las células del fondo del pozo. Transfiera la suspensión celular resultante a un tubo cónico de 15 mililitros y aumente el volumen de la solución celular a 10 mililitros con más medio DMEM/F-12.

Después de contar, transfiera 4,5 veces 10 a la tercera célula por agregado de células madre pluripotentes a un nuevo tubo de 15 mililitros y recoja las células por centrifugación. Suspendemos el pellet en el volumen adecuado de medio de células madre pluripotentes, suplementado con inhibidor de roca de 50 micromolares para lograr una concentración de 4,5 veces 10 a la tercera célula por cada 150 microlitros de medio. A continuación, agregue 150 microlitros de células a los pocillos individuales de una placa inferior en U de baja adhesión de 96 pocillos y coloque la placa en una incubadora de 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono.

Para monitorear la inducción del neuroectodermo anterior, use un microscopio de cultivo de tejidos para observar de cerca los cambios morfológicos de los agregados de células madre pluripotentes todos los días bajo bajo aumento. El primer día, se deben observar agregados de células con bordes claros. En el segundo día, aspire cuidadosamente aproximadamente dos tercios del medio, sin alterar los agregados celulares en el fondo de cada pocillo, y reemplace el medio desechado con 100 microlitros de medio de células madre pluripotentes frescas.

Entre cuatro y seis días después, cuando los agregados celulares alcancen de 350 a 450 micrómetros de diámetro y exhiban bordes lisos, use una punta de pipeta modificada de 100 microlitros para transferir hasta 20 agregados a una sola placa de cultivo de baja fijación de seis centímetros que contenga cinco mililitros de medio de inducción cortical. Sustituir el medio cortical de inducción por medio fresco una vez cada tres días, monitorizando diariamente la morfología de los agregados bajo el objetivo 4X. Después de cuatro a cinco días en el medio de inducción cortical, los bordes de los agregados celulares deben comenzar a aclararse en la superficie, lo que indica diferenciación neuroectodérmica y debe surgir la organización radial de un epitelio pseudoestratificado.

Para incrustar los agregados neuroectodérmicos en un andamio de matriz, descongele el extracto de membrana basal en hielo durante dos o tres horas. Mientras se descongela el extracto, use tijeras estériles para cortar la película de parafina de plástico en un cuadrado de cuatro por cuatro centímetros por 16 organoides, y coloque cada pieza de película sobre una bandeja vacía de puntas de micropipeta de 100 microlitros. Presione la película de parafina con la yema del dedo enguantada para que aparezcan pequeños hoyuelos y limpie la película con etanol al 70%.

Después de la radiación UV en una cabina de bioseguridad cerrada y estéril durante 30 minutos, utilice una punta de pipeta modificada de 100 microlitros con una abertura de uno y medio a dos milímetros para transferir cada agregado celular a un hoyuelo en la película. Cuando se hayan transferido todos los agregados, use una punta de pipeta de 100 microlitros sin cortar para aspirar cuidadosamente el medio de cada hoyuelo y agregue 40 microlitros de extracto de membrana basal sin diluir a cada agregado celular. Tenga cuidado de no dañar los organoides mediante una manipulación brusca o aspiración en la punta de la pipeta, ya que esto dañaría el neuroepitelio en desarrollo.

Use la punta de la pipeta para colocar los agregados en el centro de cada gota y use pinzas estériles para transferir con cuidado la lámina de película de parafina de plástico a una placa de Petri de 10 centímetros. Coloque el plato en la incubadora durante 15 a 20 minutos. Mientras el extracto se solidifica, agregue cinco milímetros de medio de inducción cortical fresco a una placa de cultivo de seis centímetros de apego bajo.

Al final de la incubación, voltee la hoja de película de parafina y use pinzas estériles para exprimir suavemente hasta 16 gotas polimerizadas en cada plato de seis centímetros. A continuación, devuelva los agregados a la incubadora de cultivos celulares. Al día siguiente, transfiera las placas de cultivo de organoides a un agitador de cultivo celular oscilante, inclinado en un ángulo de cinco grados a 14 rpm dentro de una incubadora de cultivo celular, con monitoreo diario de microscopía óptica, hasta que los agregados alcancen la etapa de diferenciación de interés.

El día 20, utilice una punta de pipeta modificada de un mililitro con una abertura de tres a tres mililitros y medio para recoger seis organoides de los cultivos agregados. Coloque tres de los organoides en un pocillo de una placa de 24 pocillos que contenga 500 microlitros de PBS, y use una pipeta de cinco mililitros para lavar los organoides dos veces con 500 microlitros de PBS fresco por lavado. Después del segundo lavado, fije los organoides en paraformaldehído al 4% en frío durante 15 minutos, seguido de tres lavados de 10 minutos en PBS a temperatura ambiente y una deshidratación final durante la noche en una solución de sacarosa al 30% a cuatro grados centígrados.

Al día siguiente, tiña previamente los organoides deshidratados con una dilución de uno a 50 azul de tripán durante 10 minutos para permitir la visualización de los organoides durante el procedimiento de criosección, y reemplaza la sacarosa con medio de inclusión recién preparado. Caliente la placa en una almohadilla térmica de 60 grados centígrados durante 15 minutos para equilibrar los organoides en el medio de inclusión y cubra el fondo de un molde de inclusión por organoide con medio de inclusión nuevo. Coloque el molde sobre hielo para solidificar el medio de inclusión, transfiera los organoides a los moldes de incrustación y agregue medio de inclusión fresco hasta que cada organoide esté cubierto.

A continuación, congele los organoides en un baño de congelación de hielo seco al 100% etanol durante al menos un minuto y utilice un criostato para obtener secciones de 20 micrómetros de espesor de cada organoide para el análisis inmunocitoquímico. Para generar organoides de tipo prosencéfalo, utilice únicamente cultivos de IPSC que se presenten como una monocapa homogénea de células indiferenciadas en la población inicial. En el segundo día, los agregados deberían haber formado yemas de celdilla compacta con bordes lisos.

Los agregados del día 10 deben mostrar tejido liso y ópticamente liso y ópticamente translúcido en la superficie externa, lo que representa la inducción del neuroectodermo. Si se ha seguido de cerca el protocolo, se generarán lotes de organoides altamente estandarizados que demuestren una homogeneidad mayor o igual al 90% en la formación de neuroectodermo polarizado dentro y entre lotes. El análisis inmunocitoquímico de los organoides del día 20 revela bucles neuroepiteliales estratificados que expresan el marcador de células madre neurales Sox2, los marcadores de prosencéfalo Pax6 y Otx2, y el marcador cortical dorsal Emx1.

Estos bucles corticales se caracterizan además por una localización apical de N-cadherina y ZO-1, microtúbulos derivados de células gliales radiales de la zona ventricular, que se extiende desde el lado apical hasta el basal de las estructuras, y células divisorias ubicadas en apical que se tiñen positivas para vimentina fosforilada. Para analizar el plano de división de las células gliales radiales apicales se puede realizar una doble tinción para vimentina y Tpx2, una proteína asociada a microtúbulos que se puede utilizar para visualizar el huso mitótico y los procesos apicales durante la migración nuclear intercinética. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar organoides de tipo prosencéfalo altamente estandarizados y homogéneos a partir de células madre pluripotentes humanas.

Esta técnica facilita el estudio de los aspectos específicos del ser humano de los trastornos del neurodesarrollo utilizando un modelo celular complejo en 3D dispuesto de manera específica para el neurotejido. Una vez que se ha dominado la técnica, estos organoides corticales se pueden usar para una variedad de aplicaciones, como estudios de neurodesarrollo, evolutivos o de función génica, incluido el modelado de enfermedades y, potencialmente, pruebas o terapias de medicamentos.