Mycobacterium tüberküloz ile muhabir enzim Floresans farelerde görüntüleme

Bu raportör enzim floresan görüntüleme prosedürünün genel amacı, patogenez, terapötikler ve aşı araştırmaları için klinik öncesi hayvan modellerinde mikobakteri tüberkülozunun hassas ve spesifik tespitini kolaylaştırmaktır. Bu yöntem, bakteri türlerinin virülans mekanizmalarının yanı sıra terapötikler oluşturma ve aşıları anlama da dahil olmak üzere tüberküloz alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Dolayısıyla bu tekniğin ana avantajı, aynı hayvan grubunun birden fazla zaman noktasında görüntülenmesine izin vermesidir.

Bu, maliyeti büyük ölçüde azaltır, konakçı patojen etkileşimlerini incelememize izin verir ve aynı anda daha fazla sayıda hayvanın bakımı kolayca yapılabildiği için istatistiksel gücü artırır. Başlamak için, MOADCTW ortamında 37 santigrat derecede herhangi bir M.tuberculosis bakterisini 600 nanometrede ölçülen 0,5'lik bir optik yoğunluğa kadar büyütün. Enfeksiyöz materyallerin manipülasyonunu içeren tüm prosedürler, biyogüvenlik kabinleri veya diğer onaylanmış fiziksel muhafaza cihazları içinde gerçekleştirilmelidir.

Hazır olduktan sonra, aynı ortamda kültürün bir ila 10 seyreltmesinden oluşan bir dizi yapın. Ardından, CFU'nun doğru bir şekilde belirlenmesini sağlamak için seyreltmeleri seçici 7H11 plakaları üzerine üçlü olarak yerleştirin. Plakaları 37 santigrat derecede dört hafta boyunca veya CFU'yu belirlemek için koloniler doğru bir şekilde sayılana kadar inkübe edin.

Bir aşı kurmadan önce, her zaman biyogüvenlik başlığının dakikada 50 litre hava akıttığından emin olun. 90 fareye kadar enfekte edebilecek bir aşı hazırlamak için, istenen CFU'yu 15 mililitrelik bir şahin tüpünde ölçün. Tipik olarak 10.000 ila 1 milyon CFU kullanılır.

Sonra bakterileri topaklayın. Daha sonra bakterileri 10 mililitre tuzlu su ile bir kez yıkayın. Sonra onları 15 milileter tuzlu su içinde askıya alın.

Daha sonra bir biyogüvenlik kabininde, aşıyı bir nebülizöre takılabilen bir cam kavanoza yükleyin. Daha sonra nebulizatör ünitesini bağlayın ve dikey paslanmaz çelik boruyu, alt uç süspansiyonun menisküsünün yaklaşık çeyrek inç altında olacak şekilde ayarlayın. Şimdi düzeneği sızdırmaz bir taşıma kabında aşılama odasına aktarın.

Devam etmek için, ağırlığı bilinen hayvanları güçlendirilmiş aşılama odasına yükleyin. Hazne 90 fareye kadar sığabilir. Ardından kapıdaki tüm mandalları kapatın.

Ardından, nebulizatörü çelik bir kelepçe kullanarak bağlayın. Ardından haznedeki başlat düğmesine basın. Ve hava akış hızını dakikada üç ila beş litre arasında ayarlayın.

Basınçlı hava, inç kare başına yaklaşık 22 ila 26 pound arasında akacaktır ve daha da önemlisi, odadaki aşı sisini görmek mümkün olmalıdır. 15 dakika sonra, kontrol panelinin ön tarafında kırmızı bir ışık belirecek ve çalışmanın sona erdiğini sesli bir sinyal verecektir. Ardından zamanlayıcıları sıfırlamak için sıfırlama düğmesine basın.

Vakumu serbest bırakmak için haznenin kapısındaki küçük kırmızı düğmeye basın. Ardından oda kapısını açın ve fareleri ev kafeslerine geri koyun. İleriye dönük olarak, hayvanları muhafaza odasında tutun.

Daha sonra kavanozu ve taşıma kabını biyogüvenlik kabinine geri koyun. Orada, kalan bakteri süspansiyonunu belirlenmiş bir atık kabına atın. Daha sonra kullanılmış nebulizatör kavanozunu bir biyolojik tehlike torbasına yerleştirin ve torbayı otoklava taşınmak üzere kapatın.

Hazneyi temizlemek için iç yüzeylere tamponlu fenol ve% 70 etanol püskürtün. Bu çözeltilerin bu yüzeylerde 10 dakika boyunca reaksiyona girmesine izin verin. Sonra onları iyice silin.

Tüm mendilleri biyolojik tehlike çöp kutusuna atın. Ardından çöpü, atık kabını ve kullanılmış nebulizatör kavanozlarını otoklavlayın. Hayvanları görüntüleme odasına aktarın.

Orada, bir hayvanı metin protokolüne göre uyuşturun ve intraperitoneal enjeksiyon yoluyla kontrast substrat ile enjekte edin. Görüntüleme sistemleri yazılımında, sistemi başlatın ve sıcaklık çubuğu yeşile döndüğünde devam edin. Sistemi başlattıktan sonra, fareyi görüntüleme odasına yerleştirin.

Burun deliklerinin burun konisinin içinde olduğundan emin olun, böylece görüntüleme sırasında anestezi alır. Şimdi bilgisayara geri dönün. Edinme kontrol panelinde, tüm hayvan görselleştirmesi için floresan, transillüminasyon veya akciğer dokularını görüntülemek için epi-aydınlatmayı seçin.

Tek bir fare için, görüş alanını B ve lamba seviyesini yüksek olarak ayarlayın. Pozlama için otomatik süre, orta gruplama ve F/Stop için iki veya üç kullanın. Ardından uyarma filtresini 745 nanometreye ve emisyon filtrelerini 780 ila 840 nanometreye ayarlayın.

Ardından, dizi kurulumuna gidin ve ilgilendiğiniz alanda dokuz ila 12 transillüminasyon noktası seçin. Şimdi görüntüleri toplamak için edin'e basın. Görüntü analizi metin protokolünde ele alınmıştır.

Enfeksiyonun derecesini analiz etmek için, fareyi sodyum pentobarbital kullanarak ötenazi yapın. Hayvanın ötenazi yapıldığından emin olmak için bir pedal refleksi olup olmadığını kontrol ettiğinizden emin olun. Ve sonra standart bir diseksiyon kullanarak akciğerleri çıkarın.

Daha sonra akciğer dokusunu bir mililitre PBS'de homojenize edin. Daha sonra PBS kullanarak homojeninin on kat seri seyreltmesini yapın. Seyreltilmiş homojeni üç kopya halinde tabaklayın ve koloniler sayılana kadar plakayı 37 santigrat derecede inkübe edin.

Ardından enfeksiyonun ciddiyetini ölçmek için CFU skorunu kullanın. Fareler tarif edildiği gibi tedavi edildi. M. tuberculosis'in ilerlemesini görüntülemek için bir REF substratı kullanıldı.

Floresan, transillüminasyon kullanılarak ölçüldü. Ve enfekte farelerde ikinci haftadan altıncı haftaya yükseldi. Kontrol farelerinde sinyaldeki hafif düşüş, altı haftalık süre boyunca vücut kütlesi ve hacmindeki artışa bağlanabilir.

Floresan kaynaklarının 3D FLIT rekonstrüksiyonu, aynı uyarma ve bir dizi emisyon filtresi kullanılarak birden fazla transillüminasyon noktasından yapılmıştır. Rekonstrüksiyon kalitesini kontrol etmek için NTF verimlilik haritaları çıkarıldı. Spesifik uyarma filtresinden alınan görüntü, aynı emisyon filtresi ve açık bir uyarma filtresi ile yapılan iletim görüntüsüne normalize edildi.

Bu, tek başına alt tabaka tarafından üretilen bir sinyal sağlar. Rekonstrüksiyonda neredeyse hiç hata yoktu. Verilerin NTF etkinliğinin hem yatay hem de dikey görünümde incelenmesi sıkı bir korelasyon göstermiştir.

Bu nedenle, 3D rekonstrüksiyonda az sayıda artefakt, gelişmiş sinyal lokalizasyonu ve diğer yöntemlere göre geliştirilmiş hassasiyet vardı. Bu teknik, tüberküloz alanındaki araştırmacıların mycobacterium tuberculosis'e karşı ilaçların terapötik etkinliklerini araştırmalarının yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, REF substratı kullanılarak takip optik görüntüleme ile mycobacterium tuberculosis ile aerosol yolu yoluyla farelerin nasıl enfekte edileceğini iyi bir şekilde anlamış olmalısınız.