Name: Ingeniería de superficies de islotes pancreáticos con un nanocobertura StarPEG heparinizada (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 35 s
Description: Aprende a aplicar nanocobertura de heparina-PEG en islotes pancreáticos para mejorar la viabilidad y función del injerto en trasplantes. Esta técnica facilita la revascularización y supera el rechazo inmunológico.

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Estamos agradecidos por el apoyo financiero de los fondos Nacional de Ciencias naturales de China (31770968), Tianjin programa de investigación de Fundación de aplicación y tecnología avanzada (17JCZDJC33400).

1. fabricación de heparina incorporada la nanocobertura Starpeg
<ol><li>
Síntesis de succinato de succinimidyl heparina (heparina-NHS)
	<ol>
<li>Pesar 0,69 g de heparina y disolver en 2,0 mL de agua desionizada helada.</li>
		<li>Pesar 0,23 g de NHS y disolver en 0,5 mL de helado agua desionizada en un matraz de fondo redondo.</li>
		<li>Pesar 0,77 g de EDC y disolver en 0,5 mL de helado agua desionizada en un matraz de fondo redondo.</li>
		<li>Mezcla el NHS y EDC soluciones en un matraz de fondo redondo. Deje la solución mezclada en el banquillo a temperatura ambiente durante 30 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Centrifugar la mezcla de NHS de EDC a 5.031 x g por 10 min eliminar el exceso de EDC y NHS.</li>
		<li>Añadir 30 mL de etanol frío a la solución de mezcla y centrifugar a 5.031 x g por 10 min.<ol>
<li>Repetir dos veces.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de la nanocobertura heparina starPEG
	<ol>
<li>Añadir 1,0 mL de 10% (p/v) starPEG-(NH2)8 a un matraz de fondo redondo.</li>
		<li>Añadir 0,67 mL de 10% (p/v) heparina-NHS el mismo matraz de fondo redondo.</li>
		<li>Coloque la solución mezclada de starPEG-(NH2)8 y heparina-NHS en una incubadora a 25 ° C por 20 min obtener una solución clara con viscosidad. Nota: Para los experimentos en que fluorescencia etiquetada heparina (heparina de FAM) fue requerida, el procedimiento de fabricación es el mismo excepto que la estrella de (NH2) - PEG -8 fue disuelto en agua desionizada con 5.6- carboxyfluorescein Nsuccinimidyl - éster 0.1% (fracción molar) de starPEG-(NH2)8. )</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Caracterización de la nanocobertura heparina-PEG por Fourier transforman espectroscopía infrarroja (FT-IR)
	<ol>
<li>Antes de empezar, enjuague el dispositivo de mortero, mortero y granulación de ágata (pequeños discos con diámetro de 13 mm) con acetona y agua desionizada. Seque el vidrio en un horno antes de usarlo.</li>
		<li>Mezcla aproximadamente 0.1 – 1% heparina-PEG muestra con 200 – 250 mg de polvo fino de KBr.</li>
		<li>Coloque la mezcla de KBr y heparina-PEG en el mortero de ágata y pulverizar finamente en pequeñas bolitas con un diámetro de 2 μm.</li>
		<li>Transferir la mezcla a un dispositivo de granulación. Aplique la fuerza de compresión alta (8 T/cm2) en el vacío durante 1-2 min formar bolitas transparentes.</li>
		<li>Tire suavemente de las pelotillas de la muestra respecto a la dispositivo de granulación. Tenga cuidado de no tirar demasiado para no incurrir en grietas.</li>
		<li>Transferir las pelotillas muestra muy cuidadosamente a un espectroscopio infrarrojo de Fourier transforma para determinar la estructura química de la muestra.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Examen de las estructuras internas de la porosidad de la nanocobertura heparina-PEG por escaneada la microscopia electrónica (SEM)
	<ol>
<li>Para los siguientes procedimientos, preparar pipetas y placa de cultivo de célula estándar de 48-bien.</li>
		<li>Pipetear la solución de copolímero de PEG de heparina en los pocillos de una placa de cultivo de 48-bien.</li>
		<li>Congelar la placa a-80 ° C durante 24 h.</li>
		<li>Lypophilize las muestras a-50 ° C en ambiente de vacío (0.1 Pa) durante 24 h.</li>
		<li>Distribuyen las muestras en la superficie pegajosa de un trozo de aluminio.</li>
		<li>Cubrir las muestras con oro y observe bajo el microscopio electrónico escaneado para observar estructuras internas porosas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Examen de la superficie de la nanocobertura heparina-PEG por microscopía de fuerza atómica (AFM)
	<ol>
<li>Limpiar el portaobjetos de vidrio de sílice con solución Piraña (70% H2SO4, 30% H2O2) a 80 ° C durante 40 minutos.</li>
		<li>Someter a ultrasonidos las diapositivas en metanol durante 10 minutos y luego en tolueno durante 10 minutos.</li>
		<li>Secar los portaobjetos por secado al vacío.</li>
		<li>Lave los portaobjetos con abundante 3-aminopropil trietoxisilano solución 2% de tolueno, agitar suavemente.</li>
		<li>Someter a ultrasonidos las diapositivas en metanol durante 10 min luego en tolueno durante 10 minutos.</li>
		<li>Coloque 100 μl de solución de heparina-PEG 3% toda la superficie de los portaobjetos con ayuda de una pipeta estándar.</li>
		<li>Examinar la superficie de heparina-PEG bajo un microscopio de fuerza atómica (una frecuencia resonante de 50 a 80 kHz, la fuerza constante de 0.350 N m 21, radio de punta de 600 nm).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ratón islote ingeniería de superficies con heparina-PEG nanocobertura
<ol><li>
Capa superficial del islote ratón con heparina-PEG nanocobertura
	<ol>
<li>Extraer los islotes de ratón colagenasa digestión histopaque gradiente purificación y según lo divulgada previamente en JoVE19.</li>
		<li>Dedazo 200 islotes bajo un microscopio de disección a un tubo de 1,5 mL.</li>
		<li>Añadir 500 μl de PBS a los islotes y centrifugar a 503 x g durante 1 minuto.</li>
		<li>Quite el sobrenadante y añadir 250 μl de la solución de heparina-PEG y mantener la mezcla en hielo durante 10 minutos la pipeta hacia arriba y hacia abajo para permitir que los islotes mezclar bien con la solución de heparina-PEG.</li>
		<li>Centrifugar a 503 x g durante 1 minuto.</li>
		<li>Quite el sobrenadante y agregar 500 μl de PBS. Pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar bien.</li>
		<li>Centrifugue a 503 x g durante 1 min y retirar el sobrenadante y mantener los islotes para su uso posterior. Para la examinación de los islotes de ratón recubierto con heparina-PEG, FAM-heparina-PEG fue utilizado para el recubrimiento de islote siguiendo estos pasos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Examen de los islotes de ratón con la nanocobertura FAM-heparina-PEG
	<ol>
<li>Añadir 1-2 mL de RPMI 1640 suplementado con 10% suero bovino fetal en los islotes revestidos y transferir estos islotes en una placa de cultivo bacteriano estéril no cargado.</li>
		<li>Observar las señales de morfología y de la fluorescencia de FAM-heparina-PEG revestido de la nanocobertura islotes bajo un microscopio de fluorescencia invertido.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. función de la heparina-PEG revestido islotes de ratón comparados con islotes sin recubrimiento
<ol><li>
Viabilidad de los islotes de ratón recubierto de heparina-PEG
	<ol>
<li>Dedazo de 20 de los islotes de ratón recubierto de heparina-PEG y colocarlos en un pocillo de una placa de cultivo celular de 96 pozos.</li>
		<li>Un total de 10 pozos se llenan 20 islotes de ratón recubierto de heparina-PEG para cada pozo.</li>
		<li>Dedazo 20 de islotes de noncoated control y colocarlos en un pozo de la misma placa de cultivo celular de 96 pozos.</li>
		<li>Un total de 10 pozos se llenan 20 islotes de noncoated de control para cada pozo.</li>
		<li>Colocar 200 μL de RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal 10% a cada pocillo de la placa de 96 pocillos que contiene islotes y mantener en cultivo durante 14 días.</li>
		<li>Sustituir los medios de cultivo de islotes pancreáticos cada 2 días.</li>
		<li>Tratar los islotes con un vivo o muertos kit de tinción en el final de 14 días en cultura y observados bajo un microscopio de fluorescencia invertido.</li>
		<li>Células en cada islote bajo un microscopio de fluorescencia invertido en cuenta PI+ (rojo).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Revascularización de la heparina-PEG cubierto de islotes de ratón in vitro
	<ol>
<li>Pre-enfriar todos los plásticos experimentales incluyendo placa de cultivo y por lo menos 12 h antes de usar puntas de pipeta.</li>
		<li>Lugar un 24-bien sobre un cojín de la refrigeración. Añadir 250 μl de hielo frío Matrigel reducido factor de crecimiento en cada pocillo de una placa de cultivo celular de 24 pozos. Coloque la placa de 24 pocillos recubierta a 4 ° C durante al menos 30 minutos.</li>
		<li>Mientras la solución de la matriz está en la nevera, trypsinize las células endoteliales de milla Sven 1 (MS1) ratón islote pancreático.<ol>
<li>Quite todos los medios de cultivo del frasco de cultivo de tejidos. Enjuague el matraz con 5 mL de PBS.</li>
			<li>Retirar el PBS y añadir 3 mL de tripsina-EDTA. Incubar a 37 ° C durante 3 minutos en una incubadora estándar.</li>
			<li>Golpee ligeramente la parte inferior del frasco para separar las células y añadir 5 mL de medio de suplemento de suero.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Recoger las células en un tubo de centrífuga de 15 mL y centrifugar a 1.000 x g durante 5 minutos.</li>
		<li>Quite el sobrenadante y añadir 5 mL de PBS. Pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar bien.</li>
		<li>Centrifugar a 1.000 x g durante 5 minutos y retirar el sobrenadante.</li>
		<li>Añadir medios DMEM suplementada con suero en el tubo y semilla de 50.000 células en cada pocillo de la placa de 24 pocillos recubiertos de solución matriz.</li>
		<li>Añadir 5 islotes recubierto de heparina-PEG o control noncoated islotes en cada pozo.</li>
		<li>Añadir medios DMEM suplementada con suero en cada pozo a un total de 500 μl por pocillo.</li>
		<li>Observar la formación del tubo después de 4h y 24 h de incubación bajo un microscopio de luz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Secreción de insulina estimulada por glucosa de islotes recubierto de heparina-PEG Nota: Para determinar si la nanocobertura afectaría a la función de los islotes de ratón, se evaluó la secreción de insulina estimulada por glucosa de heparina-PEG revestido e islotes noncoated.<ol>
<li>Dedazo 30 recubierto de heparina-PEG islotes o islas noncoated control en un tubo de 1,5 mL. Preparar cada uno un total de 10 tubos de islotes revestidos e islotes noncoated.</li>
		<li>Añadir 1 mL de solución salina fisiológica con 2 mmol/L glucosa20 e incubar a 37 ° C por 2 h. Nota: Para la receta de la solución salina fisiológica, consulte la tabla 1. Mantenga la tapa de los tubos sueltos durante la incubación en la incubadora.</li>
		<li>Quite tanta solución como sea posible.</li>
		<li>Estimular islotes por añadir 600 μl de solución salina fisiológica complementada con 20 Glucosa mmol/L a 37 ° C durante 30 minutos.</li>
		<li>Recoger 200 μL del sobrenadante de cada tubo para la cuantificación de ELISA usando una insulina comercial ELISA kit de insulina.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este artículo, se demuestra un enfoque "fácil-a-adoptar" para la vida de la superficie de la célula una nanocobertura starPEG incorporado de heparina vía química de pseudo-bioorthogonal entre los grupos N- hydroxysuccinimide la nanocobertura de ingeniería y la grupos amino de la membrana superficial del islote pancreático. De hecho, los grupos aminos en las membranas celulares son altamente reactivos, y como resultado, estudios anteriores han reportado interacciones entre los grupos aminos primarios con activado N- hydroxysuccinimidyl (NHS) éster bajo condiciones fisiológicas14 ,16,21. Además, una amplia investigación ha informado que incorporación de heparina, un glucosaminoglicano altamente sulfatada y componente importante de la matriz extracelular durante la encapsulación del islote, podría conducir a poste-trasplante mejorada revascularización y reducido IBMIR22,23. Teniendo en cuenta la biocompatibilidad de PEG y multivalentes propiedades de heparina, se utilizó PEG 8-armado de heparina máxima carga durante la fabricación de la nanocobertura. La heparina fue modificada con -NHS, que posteriormente sería reaccionar con los grupos de2 -NH en membrana de la célula del islote. Activando la formación de enlace covalente entre -NH2 (de membrana de la célula) y -NHS de la clavija de Hep, los islotes serían fácilmente "cubrir" la clavija incorporada de heparina, formando así una capa delgada de nano (nanocobertura) en la superficie externa de la pancreática islotes.
El enfoque actual es diferente de métodos previamente publicados que también seleccionaron PEG como el polímero importante para microencapsulación de islote en eso química de pseudo-bioorthogonal entre los -NHS (de la nanocobertura) y -NH2 de la célula del islote membrana fue utilizada. Teniendo en cuenta que la estabilidad de la célula del islote capa, especialmente en un entorno complejo como el plasma, es crucial para la revascularización posterior al trasplante y la supervivencia, la formación entre el NHS - y -NH2 sería más estable en comparación con interacción hidrófoba entre PEG y membrana celular24, interacciones electrostáticas9,15,24,25,26 o vínculo biológico entre la biotina estreptavidina14.
Además, en contraste con islote enfoque de capa que se basa en el enfoque de la LBL con período de manejo extendido islote de deposición multicapa14,16,25, la presente técnica también requiere un mínimo procesamiento y muy corto período de la capa de los islotes aislados. Ambos de estos factores son esenciales para la supervivencia después del trasplante del islote ya que viabilidad de islotes a menudo ya está comprometido aislamiento islote siguiente debido a la ECM dañado durante la digestión enzimática. Sin embargo, una limitación del enfoque actual es que, a diferencia de LBL, que espesor de la capa externa puede ser controlado por aumentar o reducir el número de la deposición de la capa, espesor de la nanocobertura Hep-PEG no puede ser adaptado por el momento.
Además, debido a la condición suave donde la reacción química entre el NHS - y -NH2 se lleva a cabo, el actual enfoque es aplicable para la célula viva superficie ingeniería no se limita a islotes pancreáticos, pero la mayoría la terapia celular. Además, teniendo en cuenta que la heparina es conocida para interactuar con una variedad de citoquinas y moléculas biológicamente activas, la nanocobertura Hep-PEG también presenta una plataforma abierta que tiene el potencial para la incorporación de mediadores biológicos ilimitados así como interfaces para la ingeniería de superficies de células más compleja.

La eficacia terapéutica de las terapias basadas en células está limitada por células baja retención y supervivencia pobre1,2. Con el fin de mejorar el resultado de terapias con células madre, ingeniería de superficies a través de la manipulación enzimática de la célula, péptido Conjugación, bioorthogonal química y física encapsulación con biomateriales ha sido explotados3,4, 5,6,7,8,9,10. El protocolo actual pretende lograr ingeniería de superficies de las células vivas utilizando un método "fácil-a-adoptar" aplicando una nanocobertura starPEG ultrafino incorporado de heparina (heparina-PEG) a la superficie de la célula. Ingeniería de superficies de islotes pancreáticos fue presentado aquí como un ejemplo debido a la naturaleza heterogénea de los islotes de Langerhans y los resultados despectivos del trasplante clínico de islotes actual.
De hecho, el trasplante clínico de islotes se realiza actualmente por inyección directa de islotes aislados en la vena porta hepática y este procedimiento sólo está disponible para pacientes selectivos debido a la escasez de donantes materiales y baja eficacia terapéutica 11. convencionalmente, alginato ha sido el biomaterial más comúnmente utilizado para la encapsulación de islote y modificación superficial, aunque es menos que ideal debido a la inestabilidad química de alginato y fibrosis inflamatoria relacionada con12, 13. Además, en comparación con el tamaño natural de islotes que oscila entre 100 a 200 μm, las microcápsulas de alginato-islote son más grandes, que oscilan entre los 400 y 800 μm, que exceda la distancia de difusión fisiológica de oxígeno. Encapsulación de islote conformal, es decir., encapsulando islotes sin alteración significativa del volumen del islote, fue entonces desarrollado. Así, la deposición de nanomembranes compuesto por PEG, tetrafluoroetileno, membrana de silicio o nanocobertura varias capas (también conocido como la técnica de la "capa por capa" [LBL]) ha sido reportada, dando por resultado mejorado en vitro la supervivencia de la isla14 ,15,16,17,18, aunque la LBL enfoque a menudo requiere extensos islotes dando período de deposición de capas múltiples, que puede comprometer la viabilidad del islote . Por otra parte, la inestabilidad de nanomembranes que se basa en las interacciones electrostáticas o covalentes entre capas de biomembrana o interacciones hidrofóbicas entre nanomembranes y la superficie del islote también plantea preocupaciones9,14 , 15 , 16 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26.
Otro factor limitante que afecte el resultado terapéutico del trasplante intraportal islote es la instantánea sangre mediada por reacción inflamatoria (IBMIR) causada por el contacto directo de implantado islotes de sangre, resultando en la agregación plaquetaria, coagulación y efecto inmune adversa o indeseable activación celular9. Para abordar estos problemas, una nanocobertura ultra fina compuesta de glicol de polietileno en forma de estrella (starPEG) fue preparada por su biocompatibilidad establecido y su versatilidad como material de la cubierta del islote. Heparina, un glicosaminoglicano altamente sulfatado, se incorporó en la nanocobertura starPEG por sus propiedades antiinflamatorias, anticoagulantes y capacidad para facilitar la vascularización mediante la contratación de pro-angiogenic Factores del crecimiento22, 23.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Reactivo</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>AAJ207798</td><td></td></tr><tr><td>Estreptozototina</td><td>Sigma</td><td>S0130</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma</td><td>10831</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>GIBCO, de Life Technologies</td><td>31800022</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>GIBCO, de Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>GIBCO, de Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Solución de disociación celular</td><td>GIBCO, de Life Technologies</td><td>13150-016</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, de Life Technologies</td><td>12800017</td><td></td></tr><tr><td>solución de D-(+)-Glucosa</td><td>Sigma</td><td>G8644</td><td></td></tr><tr><td>488 faloidina</td><td></td><td>Sigma A12379</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Sigma</td><td>21888-25mg-F</td><td></td></tr><tr><td>Anexina V/PI kit de apoptosis</td><td>Dojindo</td><td>AD10</td><td></td></tr><tr><td>DAPI Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa de Clostridium, Tipo XI</td><td>Sigma</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>NHS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56480</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3449</td><td></td></tr><tr><td>PEG</td> J& de 8 brazos <td> K Scientific Ltd</td><td>1685176</td><td></td></tr><tr><td>FAM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M041100</td><td></td></tr><tr><td>5(6)-carboxifluoresceína N-succinimidilo éster</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21888</td><td></td></tr><tr><td>KBr</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>32036</td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropil-trietoxisilano&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>toluene</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>S-15497-20X</td><td></td></tr><tr><td>Kit de tinción vivo/muerto</td><td>Biovision, US</td><td>K501</td><td></td></tr><tr><td>BD MatrigelTM, matriz de membrana basal, factor de crecimiento reducido</td><td>BD Bioscience</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio, 99.5%</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>105864 Cloruro</td><td></td></tr><tr><td>de potasio, 99%, J</td>& extra puro <td> K Scientific Ltd</td><td>991468</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio, 99,7%, reactivo ACS</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>988639</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio hexahidratado, 99%, reactivo ACS</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>182158</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de dihidrógeno de potasio, 99%,</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>128839</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio heptahidratado, 99%, para análisis</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>119370</td><td></td></tr><tr><td>Solución de cloruro de calcio volumétrica, 1.0 M CaCl2</td><td>J& K Scientific Ltd</td><td>21114</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900933</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ELISA de insulina para ratas/ratones</td><td>Millipore-linco</td><td>EZRMI-13K</td><td></td></tr></tbody></table>

ingeniería de superficies de islotes pancreáticos con un nanocobertura starpeg heparinizada

Surface Engineering of Pancreatic Islets with a Heparinized StarPEG Nanocoating

Ingeniería de superficies de la célula puede proteger las células implantadas del ataque inmune del anfitrión. También puede cambiar la forma de paisaje celular para mejorar la función del injerto y supervivencia después del trasplante. Este protocolo pretende lograr superficie ingeniería de islotes pancreáticos mediante una nanocobertura starPEG ultrafino incorporado de heparina (Hep-PEG). Para generar la nanocobertura Hep-PEG para ingeniería de superficies de islote pancreático, succinato de succinimidyl heparina (heparina-NHS) primero fue sintetizado por la modificación de sus grupos carboxilato con N-(3-dimethylamino propyl) -N'-etilo carbodiimida clorhidrato (EDC) y N- hydroxysuccinimide (NHS). La mezcla Hep-PEG fue formada entonces por reticulación del amino final funcionalizados ocho brazos starPEG ((NH2) de starPEG-8) y heparina-NHS. Para la capa superficial de la isla, islotes de ratón fueron aislados mediante colagenasa digestión y la purificación del gradiente usando Histopaque. Islotes aislados fueron tratados luego con solución de PEG Hep fría hielo por 10 min permitir la unión covalente entre el NHS y los grupos amino de la membrana de la célula del islote. La nanocobertura con Hep-PEG incurre la alteración mínima del tamaño del islote y volumen y heparinización de los islotes con Hep-PEG también pueden reducir la reacción inflamatoria mediada por sangre instantánea durante el trasplante de islotes pancreáticos. Este enfoque de "fácil-a-adoptar" es lo suficientemente suave para la ingeniería de superficie de células vivas sin comprometer la viabilidad celular. Teniendo en cuenta que la heparina ha demostrado afinidad de unión a múltiples citoquinas, la nanocobertura Hep-PEG también proporciona una plataforma abierta que permite la incorporación de mediadores biológicos funcionales ilimitadas y superficies multicapas para vivir superficie de la célula Bioingeniería.

La nanocobertura heparina-PEG fue sintetizada por la conjugación de heparina con EDC y NHS como acoplamiento agentes (figura 1) y starPEG-(NH2)8 . Estructura química de la nanocobertura heparina-PEG fue examinado por FT-IR y como se muestra en la figura 2, se pudieran observar picos característicos de la heparina en 3.300-3.600 cm-1, correspondiente a los grupos del oxhidrilo de la heparina (figura 2 rojo). La disminución en la amplitud del pico en 3.300-3.600 cm-1 (figura 2 azul) representa la conjugación entre el starPEG (NH2)8 amida grupos y el grupo carbonilo de la heparina. Amplitud de pico 1.650 cm-1 corresponde a la amida carbonilo que se extiende la vibración también se redujeron, indicando suficiente reacción entre los grupos carboxilatos de la heparina con succinato de succinimidyl y amina de starPEG-(NH2) 8. estructura de la superficie de la nanocobertura heparina-PEG fue examinado por microscopia de fuerza atómica y aparece de Lou et al., la nanocobertura fue aproximadamente 30 nm de altura y 2 μm de ancho con pequeñas características porosas (manchas oscuras) que van entre 100 y 200 nm de diámetro10. Datos obtenidos de microscopía electrónica escaneada también confirman la estructura porosa altamente interconectada de la heparina-PEG (figura 3), sugiriendo que podría ser conveniente para la supervivencia de la célula durante el parto en vivo.
Revestimiento de la superficie de los islotes de ratón aislados fue examinado y como se presenta en la figura 4, capa delgada de la nanocobertura, demostrada por fluorescencia verde fue depositada uniformemente toda la superficie de recubrimientos islotes sin causar cambios evidentes en el islote volumen/tamaño. Durante el recubrimiento, es aconsejable mantener los islotes de hielo para mantener su viabilidad. Del mismo modo, el período de la capa, 10 minutos en este caso, fue también optimizada para permitir el mantenimiento de la viabilidad de los islotes. Cabe destacar que para la mejor observación de la nanocobertura, la microscopia electrónica que examina las secciones de islotes revestidos como previamente divulgados9,16 sería más apropiada, aunque los datos se generarían de islotes fijos y embedded en lugar de estar islotes en cultivo.
En cuanto a supervivencia y función de islotes revestidos, revascularización de islote y funciones en han sido evaluadas in vitro. Teniendo en cuenta las propiedades beneficiosas de la heparina, funcionalización de la heparina sobre la superficie del islote podría facilitar la revascularización islote en la cultura y por lo tanto su supervivencia. Hemos observado que los islotes de ratón recubierto de heparina-PEG exhibieron viabilidad robusto islotes en cultivo (figura 5). Significativamente más avanzada formación vascular era también evidente a partir de células endoteliales del islote (MS1) que fueron cultivadas conjuntamente con heparina-PEG revestido islotes, indicados por estructuras alargadas en microvasos y red-como las estructuras vasculares (figura 6 ).
El proceso de la nanocobertura no incurridos capacidad secretora de efecto insulina estimulada por glucosa de los islotes de recubierto de heparina-PEG. Bajo nivel de secreción de insulina se observó en todos los grupos de tratamiento cuando islotes fueron perfundidos con solución salina fisiológica con sub-stimulatory nivel de la glucosa (2 mmol/L; Figura 7). Cuando islotes fueron estimulados con un nivel supra fisiológico de la glucosa (glucosa de 20 mmol/L), se observó aumento en la secreción de insulina en todos los grupos de tratamiento.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig1v2.jpg"> Figura 1: Estructura química de la nanocobertura Hep-PEG para ingeniería de superficies de islotes pancreáticos. Capa del islote fue alcanzada por reticulación covalente entre la heparina-NHS y aminas primarias dentro de la membrana de la célula y estrellas - PEG-(NH2)8. Cada molécula de heparina posee varios grupos carboxilo, que fueron modificados para tener un grupo NHS cada. Los grupos carboxilo activado de NHS reaccionará con aminas primarias de la proteína a vínculos de amida de la forma, través del cual se estabiliza la nanocobertura de Hep-PEG e islotes. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig1v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig2v2.jpg"> Figura 2 : Espectro infrarrojo de la estrella - PEG-(NH2)8, heparina y la nanocobertura Hep-PEG en seco estado. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig2v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig3.jpg"> Figura 3: Imágenes de microscopía electrónica de Hep-PEG en estado seco escaneadas. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig4.jpg"> Figura 4: Cubierto de imágenes representativas de heparina-PEG islotes bajo microscopio de fluorescencia. La heparina fue etiquetada con FAM (mostrado en verde). Las imágenes son representante de 100 islotes. Barra de escala = 100 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig4large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig5.jpg"> Figura 5: Islotes recubierto de heparina-PEG exhibieron viabilidad islote robusto. (A) los datos presentados como mean± error de estándar del medio, n = 50 islotes por grupo. (B) las células vivas se muestran en las células verdes y muertas en rojo. Barra de escala = 100 μm. las imágenes son representativas de 50 islotes. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig6.jpg"> Figura 6: Heparina-PEG nanocobertura facilita la revascularización intra-islote. Formación de tubo de Matrigel de MS1 células cultivadas conjuntamente con heparina-PEG cubierto de islotes y control noncoated islotes. Imágenes fueron tomadas en el bar de escala 4 y 24 h. = 100 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig6large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig7.jpg"> Figura 7: Heparina-PEG nanocobertura no incurre ningún cambio en la función de secreción de insulina islote. Heparina-PEG islotes revestidos y control noncoated islotes (30 cada uno) fueron expuestos a 2 mmol/L (barra blanca) o 20 Glucosa mmol/L (barra negra) durante 30 minutos la secreción de insulina en respuesta a Glucosa mmol/L 20 fue comparable entre el recubrimiento e islotes. Datos se muestran como media ± error estándar de los medios, n = 10. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este protocolo pretende lograr superficie ingeniería de islotes pancreáticos mediante una nanocobertura starPEG incorporado de heparina vía química de pseudo-bioorthogonal entre los grupos N- hydroxysuccinimide la nanocobertura y los grupos de la amina del islote membrana de la célula.

Ingeniería de superficies de islotes pancreáticos con un nanocobertura StarPEG heparinizada

Cell surface engineering can protect implanted cells from host immune attack. It can also reshape cellular landscape to improve graft function and ...

Este método puede ayudar a resolver los principales desafíos en el trasplante de islotes pancreáticos, como el inmunorrechazo, la revascularización de los islotes después del trasplante y la supervivencia. Las principales ventajas de esta técnica es que este enfoque fácil de adoptar permite la ingeniería de la superficie de las células vivas al remodelar el paisaje celular de los islotes pancreáticos, lo que mejorará la función del injerto, la supervivencia y, en última instancia, la eficacia terapéutica del trasplante de islotes. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia las terapias basadas en células porque el resultado terapéutico de las terapias basadas en células también está limitado por la baja retención celular y la baja supervivencia.Demostrando este procedimiento está Jingyi Yang, un estudiante graduado de mi laboratorio. Primero, pesa 6,9 gramos de heparina y disuélvela en 2 mililitros de agua desionizada helada en un tubo Eppendorf. Disuelva 0,23 gramos de NHS en 0,5 mililitros de agua desionizada helada en un tubo Eppendorf.A continuación, disuelva 0,77 gramos de EDC en 0,5 mililitros de agua desionizada helada en un tubo cónico de 50 mililitros. Mezcle las soluciones NHS y EDC en un tubo cónico de 50 mililitros. Después de dejar la solución mezclada a temperatura ambiente durante 30 minutos, centrifugala a 12.000 RPM durante 10 minutos para eliminar el exceso de EDC y NHS.A continuación, agregue 30 mililitros de etanol frío a la solución y centrifugue a 12.000 RPM durante 10 minutos. Ahora, agregue 1 mililitro de 10%starPEG MI aid a un tubo cónico de 50 mililitros. A continuación, añada 0,67 mililitros de solución de heparina NHS al 10% en el mismo tubo cónico de 50 mililitros.Coloque la solución mezclada en una incubadora a 25 grados centígrados durante 20 minutos para obtener una solución transparente y viscosa. Seleccionamos a mano 200 islotes de ratón previamente extraídos bajo un microscopio de disección y los transfierimos a un tubo de 1,5 mililitros. Agregue 500 microlitros de PBS a los islotes y centrifugue a 1, 200 RPM durante un minuto a cuatro grados centígrados.Retire el sobrenadante, agregue 250 microlitros de la solución de Heparina PEG y coloque la mezcla en hielo durante 10 minutos. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para permitir que los islotes se mezclen bien con la solución de heparina PEG. Después de esto, centrifugar la mezcla a 1, 200 RPM durante un minuto.A continuación, retira el sobrenadante y añade 500 microlitros de PBS. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para mezclar bien. Después de centrifugar a 1.200 RPM durante un minuto, retire el sobrenadante y guarde los islotes para su uso posterior.A continuación, agregue uno o dos mililitros de RPM I 1640, suplementado con 10% FBS a los islotes recubiertos. Y transfiera estos islotes a una placa de cultivo bacteriano estéril sin carga. Finalmente, observe la morfología y las señales fluorescentes de los islotes recubiertos con FAM-heparina-PEG bajo un microscopio de fluorescencia invertida.Se observaron picos característicos de heparina, correspondientes a los grupos HYDROXAL, en el espectro FTIR del nanorecubrimiento de heparina-PEG. La disminución en la amplitud de estos picos representa la conjugación entre los grupos amida de ayuda MIG-estrella PEG y el grupo carbonal Heparina. El pico correspondiente a la vibración de estiramiento carbonal de la amida también se redujo, lo que indica una reacción suficiente entre los grupos carboxilato de heparina con el suxsonato de succinimida y la amina auxiliar star-PEG MI amina.Los datos de escaneo de una microscopía electrónica muestran la estructura porosa altamente interconectada del nanorecubrimiento de heparina-PEG, lo que sugiere que podría ser adecuado para la supervivencia celular durante la administración in vivo. Una fina capa de nanorrecubrimiento, mostrada por fluorescencia verde, se depositó uniformemente a través de la superficie de los islotes recubiertos, sin causar cambios evidentes en el volumen o tamaño de los islotes. Los islotes de ratón recubiertos con heparina-PEG mostraron una viabilidad robusta en cultivo.Se evidenció una formación vascular significativamente más avanzada a partir de las células endoteliales de los islotes que se cultivaron conjuntamente con islotes recubiertos de heparina-PEG, lo que se indicó mediante estructuras alargadas en forma de microvasos y estructuras vasculares en forma de red. Se observó un nivel bajo de secreción de insulina en todos los grupos de tratamiento cuando los islotes se perfundieron con una solución salina fisiológica, suplementada con un nivel subestimulador de glucosa. Cuando los islotes fueron estimulados con un nivel superfisiológico de glucosa, se observó un aumento en la secreción de insulina.Una vez dominado, el recubrimiento se puede realizar en un minuto si se realiza correctamente para preservar la viabilidad de los islotes.

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Bioengineering

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