Ingeniería de superficies de islotes pancreáticos con un nanocobertura StarPEG heparinizada

Este método puede ayudar a resolver los principales desafíos en el trasplante de islotes pancreáticos, como el inmunorrechazo, la revascularización de los islotes después del trasplante y la supervivencia. Las principales ventajas de esta técnica es que este enfoque fácil de adoptar permite la ingeniería de la superficie de las células vivas al remodelar el paisaje celular de los islotes pancreáticos, lo que mejorará la función del injerto, la supervivencia y, en última instancia, la eficacia terapéutica del trasplante de islotes. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia las terapias basadas en células porque el resultado terapéutico de las terapias basadas en células también está limitado por la baja retención celular y la baja supervivencia.

Demostrando este procedimiento está Jingyi Yang, un estudiante graduado de mi laboratorio. Primero, pesa 6,9 gramos de heparina y disuélvela en 2 mililitros de agua desionizada helada en un tubo Eppendorf. Disuelva 0,23 gramos de NHS en 0,5 mililitros de agua desionizada helada en un tubo Eppendorf.

A continuación, disuelva 0,77 gramos de EDC en 0,5 mililitros de agua desionizada helada en un tubo cónico de 50 mililitros. Mezcle las soluciones NHS y EDC en un tubo cónico de 50 mililitros. Después de dejar la solución mezclada a temperatura ambiente durante 30 minutos, centrifugala a 12.000 RPM durante 10 minutos para eliminar el exceso de EDC y NHS.

A continuación, agregue 30 mililitros de etanol frío a la solución y centrifugue a 12.000 RPM durante 10 minutos. Ahora, agregue 1 mililitro de 10%starPEG MI aid a un tubo cónico de 50 mililitros. A continuación, añada 0,67 mililitros de solución de heparina NHS al 10% en el mismo tubo cónico de 50 mililitros.

Coloque la solución mezclada en una incubadora a 25 grados centígrados durante 20 minutos para obtener una solución transparente y viscosa. Seleccionamos a mano 200 islotes de ratón previamente extraídos bajo un microscopio de disección y los transfierimos a un tubo de 1,5 mililitros. Agregue 500 microlitros de PBS a los islotes y centrifugue a 1, 200 RPM durante un minuto a cuatro grados centígrados.

Retire el sobrenadante, agregue 250 microlitros de la solución de Heparina PEG y coloque la mezcla en hielo durante 10 minutos. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para permitir que los islotes se mezclen bien con la solución de heparina PEG. Después de esto, centrifugar la mezcla a 1, 200 RPM durante un minuto.

A continuación, retira el sobrenadante y añade 500 microlitros de PBS. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para mezclar bien. Después de centrifugar a 1.200 RPM durante un minuto, retire el sobrenadante y guarde los islotes para su uso posterior.

A continuación, agregue uno o dos mililitros de RPM I 1640, suplementado con 10% FBS a los islotes recubiertos. Y transfiera estos islotes a una placa de cultivo bacteriano estéril sin carga. Finalmente, observe la morfología y las señales fluorescentes de los islotes recubiertos con FAM-heparina-PEG bajo un microscopio de fluorescencia invertida.

Se observaron picos característicos de heparina, correspondientes a los grupos HYDROXAL, en el espectro FTIR del nanorecubrimiento de heparina-PEG. La disminución en la amplitud de estos picos representa la conjugación entre los grupos amida de ayuda MIG-estrella PEG y el grupo carbonal Heparina. El pico correspondiente a la vibración de estiramiento carbonal de la amida también se redujo, lo que indica una reacción suficiente entre los grupos carboxilato de heparina con el suxsonato de succinimida y la amina auxiliar star-PEG MI amina.

Los datos de escaneo de una microscopía electrónica muestran la estructura porosa altamente interconectada del nanorecubrimiento de heparina-PEG, lo que sugiere que podría ser adecuado para la supervivencia celular durante la administración in vivo. Una fina capa de nanorrecubrimiento, mostrada por fluorescencia verde, se depositó uniformemente a través de la superficie de los islotes recubiertos, sin causar cambios evidentes en el volumen o tamaño de los islotes. Los islotes de ratón recubiertos con heparina-PEG mostraron una viabilidad robusta en cultivo.

Se evidenció una formación vascular significativamente más avanzada a partir de las células endoteliales de los islotes que se cultivaron conjuntamente con islotes recubiertos de heparina-PEG, lo que se indicó mediante estructuras alargadas en forma de microvasos y estructuras vasculares en forma de red. Se observó un nivel bajo de secreción de insulina en todos los grupos de tratamiento cuando los islotes se perfundieron con una solución salina fisiológica, suplementada con un nivel subestimulador de glucosa. Cuando los islotes fueron estimulados con un nivel superfisiológico de glucosa, se observó un aumento en la secreción de insulina.

Una vez dominado, el recubrimiento se puede realizar en un minuto si se realiza correctamente para preservar la viabilidad de los islotes.