Ingeniería de superficies de islotes pancreáticos con un nanocobertura StarPEG heparinizada
23 de junio de 2018
Este protocolo pretende lograr superficie ingeniería de islotes pancreáticos mediante una nanocobertura starPEG incorporado de heparina vía química de pseudo-bioorthogonal entre los grupos N- hydroxysuccinimide la nanocobertura y los grupos de la amina del islote membrana de la célula.
Este método puede ayudar a resolver los principales desafíos en el trasplante de islotes pancreáticos, como el inmunorrechazo, la revascularización de los islotes después del trasplante y la supervivencia. Las principales ventajas de esta técnica es que este enfoque fácil de adoptar permite la ingeniería de la superficie de las células vivas al remodelar el paisaje celular de los islotes pancreáticos, lo que mejorará la función del injerto, la supervivencia y, en última instancia, la eficacia terapéutica del trasplante de islotes. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia las terapias basadas en células porque el resultado terapéutico de las terapias basadas en células también está limitado por la baja retención celular y la baja supervivencia.
Demostrando este procedimiento está Jingyi Yang, un estudiante graduado de mi laboratorio. Primero, pesa 6,9 gramos de heparina y disuélvela en 2 mililitros de agua desionizada helada en un tubo Eppendorf. Disuelva 0,23 gramos de NHS en 0,5 mililitros de agua desionizada helada en un tubo Eppendorf.
A continuación, disuelva 0,77 gramos de EDC en 0,5 mililitros de agua desionizada helada en un tubo cónico de 50 mililitros. Mezcle las soluciones NHS y EDC en un tubo cónico de 50 mililitros. Después de dejar la solución mezclada a temperatura ambiente durante 30 minutos, centrifugala a 12.000 RPM durante 10 minutos para eliminar el exceso de EDC y NHS.
A continuación, agregue 30 mililitros de etanol frío a la solución y centrifugue a 12.000 RPM durante 10 minutos. Ahora, agregue 1 mililitro de 10%starPEG MI aid a un tubo cónico de 50 mililitros. A continuación, añada 0,67 mililitros de solución de heparina NHS al 10% en el mismo tubo cónico de 50 mililitros.
Coloque la solución mezclada en una incubadora a 25 grados centígrados durante 20 minutos para obtener una solución transparente y viscosa. Seleccionamos a mano 200 islotes de ratón previamente extraídos bajo un microscopio de disección y los transfierimos a un tubo de 1,5 mililitros. Agregue 500 microlitros de PBS a los islotes y centrifugue a 1, 200 RPM durante un minuto a cuatro grados centígrados.
Retire el sobrenadante, agregue 250 microlitros de la solución de Heparina PEG y coloque la mezcla en hielo durante 10 minutos. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para permitir que los islotes se mezclen bien con la solución de heparina PEG. Después de esto, centrifugar la mezcla a 1, 200 RPM durante un minuto.
A continuación, retira el sobrenadante y añade 500 microlitros de PBS. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para mezclar bien. Después de centrifugar a 1.200 RPM durante un minuto, retire el sobrenadante y guarde los islotes para su uso posterior.
A continuación, agregue uno o dos mililitros de RPM I 1640, suplementado con 10% FBS a los islotes recubiertos. Y transfiera estos islotes a una placa de cultivo bacteriano estéril sin carga. Finalmente, observe la morfología y las señales fluorescentes de los islotes recubiertos con FAM-heparina-PEG bajo un microscopio de fluorescencia invertida.
Se observaron picos característicos de heparina, correspondientes a los grupos HYDROXAL, en el espectro FTIR del nanorecubrimiento de heparina-PEG. La disminución en la amplitud de estos picos representa la conjugación entre los grupos amida de ayuda MIG-estrella PEG y el grupo carbonal Heparina. El pico correspondiente a la vibración de estiramiento carbonal de la amida también se redujo, lo que indica una reacción suficiente entre los grupos carboxilato de heparina con el suxsonato de succinimida y la amina auxiliar star-PEG MI amina.
Los datos de escaneo de una microscopía electrónica muestran la estructura porosa altamente interconectada del nanorecubrimiento de heparina-PEG, lo que sugiere que podría ser adecuado para la supervivencia celular durante la administración in vivo. Una fina capa de nanorrecubrimiento, mostrada por fluorescencia verde, se depositó uniformemente a través de la superficie de los islotes recubiertos, sin causar cambios evidentes en el volumen o tamaño de los islotes. Los islotes de ratón recubiertos con heparina-PEG mostraron una viabilidad robusta en cultivo.
Se evidenció una formación vascular significativamente más avanzada a partir de las células endoteliales de los islotes que se cultivaron conjuntamente con islotes recubiertos de heparina-PEG, lo que se indicó mediante estructuras alargadas en forma de microvasos y estructuras vasculares en forma de red. Se observó un nivel bajo de secreción de insulina en todos los grupos de tratamiento cuando los islotes se perfundieron con una solución salina fisiológica, suplementada con un nivel subestimulador de glucosa. Cuando los islotes fueron estimulados con un nivel superfisiológico de glucosa, se observó un aumento en la secreción de insulina.
Una vez dominado, el recubrimiento se puede realizar en un minuto si se realiza correctamente para preservar la viabilidad de los islotes.
Visión general
Este protocolo describe un método para la ingeniería de superficie de los islotes pancreáticos utilizando un nanorecubrimiento de starPEG incorporado con heparina. Esta técnica tiene como objetivo mejorar los resultados del trasplante de islotes mediante la mejora de la función y la supervivencia del injerto.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Terapias basadas en células
- Biología del trasplante
- Ingeniería de superficies
Antecedentes
- El trasplante de islotes pancreáticos enfrenta desafíos como el rechazo inmunológico y la poca supervivencia de los islotes.
- Mejorar el paisaje celular de los islotes puede mejorar la eficacia terapéutica.
- El nanorecubrimiento de heparina-PEG ofrece una solución potencial a estos desafíos.
- Este método es fácil de adoptar y se puede realizar rápidamente.
Propósito del estudio
- Desarrollar una técnica de recubrimiento que mejore la supervivencia y función de los islotes pancreáticos.
- Abordar problemas relacionados con la baja retención celular en terapias basadas en células.
- Demostrar la efectividad del nanorecubrimiento de heparina-PEG en la mejora de los resultados del trasplante de islotes.
Métodos utilizados
- Preparación de soluciones de heparina y NHS.
- Mezcla de soluciones de NHS y EDC para el nanorecubrimiento.
- Recubrimiento de islotes de ratón con la solución de heparina-PEG.
- Observación de la morfología y viabilidad de los islotes bajo un microscopio de fluorescencia.
Principales resultados
- Los islotes recubiertos con heparina-PEG mostraron una mejor viabilidad en cultivo.
- Se observó una formación vascular mejorada en las células endoteliales de los islotes cocultivados.
- La secreción de insulina fue sensible a la estimulación con glucosa en los islotes recubiertos.
- El recubrimiento no alteró significativamente el volumen o el tamaño de los islotes.
Conclusiones
- El nanorecubrimiento de heparina-PEG es un método prometedor para mejorar el trasplante de islotes.
- Esta técnica podría mejorar la eficacia de las terapias basadas en células.
- Las aplicaciones futuras pueden extenderse a otros tipos de células que requieran ingeniería de superficie.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Surface engineering of pancreatic islets with a heparinized starPEG nanocoating addresses critical barriers in cell-based therapies, including immuno-rejection and poor graft survival. This platform enables functional modification of living cell surfaces, supporting improved transplantation outcomes and translational continuity. The approach offers a scalable, mild, and adaptable solution for enhancing cell viability and therapeutic efficacy in preclinical and discovery-stage R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of immune-modulatory strategies for cell-based therapy targets.
- Supports biological de-risking by preserving islet viability and function post-coating.
- Facilitates predictive confidence in cell survival and engraftment for portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Prepares standardized, surface-engineered islets for downstream functional assays.
- Ensures reproducibility and quantitative assessment of islet viability and insulin secretion.
- Enables reliable evaluation of immune protection and vascularization in screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for islet transplantation and immune response studies.
- Supports continuity from in vitro engineering to in vivo transplantation validation.
- Provides mechanistic de-risking for cell retention and survival in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
This nanocoating method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting early-stage hypothesis testing and enabling robust preclinical validation of cell-based therapies.
- Discovery Biology: Advances hypothesis testing for immune evasion and graft survival mechanisms.
- Screening: Delivers reproducible, quantifiable outputs for islet viability and function.
- Analytics: Provides measurable readouts such as insulin secretion and vascularization metrics.
- Translational Research: Bridges in vitro engineering with in vivo transplantation studies for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a modular platform adaptable to various cell types and functional mediators.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in cell survival and immune protection.
- Operational Value: Standardizes cell surface engineering with minimal impact on cell viability.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions for cell therapy candidates and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of cell-based therapeutic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell isolation, surface chemistry, and nanocoating techniques.
- Needs access to fluorescence microscopy and analytical instrumentation for validation.
- Demands cross-team standardization for reproducibility in islet preparation and coating.
- Adaptable to different cell types and functional mediators as supported by platform design.
- Practical limitations include maintaining cell viability and ensuring uniform coating coverage.
