Un procedimiento integral para evaluar el rendimiento In Vitro de la neovascularización de Hemangioblastoma putativo con el esferoide brotación ensayo

El objetivo general de este experimento es evaluar el rendimiento de la neovascularización putativa del hemangioblastoma mediante el ensayo de germinación esferoide in vitro. El método puede ayudar a responder las preguntas clave en el campo angiogénico, como la angiogénesis tumoral. La principal ventaja de esta técnica es que es producto de un procedimiento integral para evaluar in vitro donde el tumor clásico de angiogénesis existe en el hemangioblastoma y crece en el hemangioblastoma.

La implicación de esta técnica se extiende hacia la terapia del hemangioblastumor y la vasculatura porque los resultados ponen de manifiesto la complejidad de la neovascularización del hemangioblastumor, y eso sugiere que esta forma común de angiogénesis es sólo un mecanismo complementario. Por lo tanto, este método puede proporcionar información sobre el estudio de la neovascularización del hemangioblastumor. También se puede aplicar a tumores, angiogénesis y aplicaciones relacionadas con la vasculogénesis en algunos tumores sólidos, como el mimetismo vasculogénico tumoral en tumor de vidrio.

La demostración real de este método es crítica, ya que la generación de estos esferoides manipulados de células endoteliales es difícil de aprender. Porque el estado adecuado es importante. En primer lugar, se cultivaron las células endoteliales HUVEC en un medio de cultivo DMEM suplementado con un diez por ciento de suero fetal bovino, penicilina y estreptomicina.

Luego, mantenga el cultivo en la incubadora a 37 grados centígrados con cinco por ciento de dióxido de carbono. A continuación, para sintetizar el fragmento de shRNA, digiera el plásmido con las enzimas de restricción ApaI y EcoRI. Luego, al plásmido digerido, agregue los oligonucleótidos directo e inverso, tampón NEB 10x y agua destilada doble hasta un volumen final de 50 microlitros.

Después de agregar todos los reactivos, caliente la mezcla a 98 grados centígrados durante cuatro minutos. Luego, enfríe gradualmente a temperatura ambiente en un lapso de unas pocas horas. Utilice la ligasa T4 para ligar los oligonucleótidos recocidos y el plásmido.

Incubar el tubo a cuatro grados centígrados durante toda la noche. Al día siguiente, agregue cinco microlitros de mezcla de ligadura a 25 microlitros de células competentes DH5alpha. En 500 microlitros de medio DMEM, agregue el vector lentiviral o el vector codificado, junto con otros plásmidos de empaque.

Luego, incuba la mezcla lentiviral durante 25 minutos a 37 grados centígrados. Después de la incubación, agregue 7 mililitros del medio DMEM a la solución mezclada revuelta o lentiviral. Cultive las células 293FT en medio DMEM sin suero fetal bovino en una placa de cultivo de 10 centímetros.

Agregue un mililitro de la solución lentiviral o revuelta a las células 293FT en la placa de cultivo. Después de seis horas, aspire el medio viejo de la placa de cultivo. Luego, reemplace el medio antiguo con un medio DMEM fresco que contenga un 10 por ciento de suero fetal bovino.

Después de 48 horas, recoja el medio. Transfiera las células endoteliales HUVEC en el medio lentiviral y manténgalas durante 72 horas. A continuación, añada dos microgramos por mililitro de puromicina al medio de cultivo celular HUVEC.

Finalmente, incube el cultivo durante otras 24 horas. Al día siguiente, agregue un mililitro de tripsina EDTA para tripsinizar las células HUVEC. A continuación, vuelva a suspender la suspensión celular tripsinizada en medio DMEM con un 10 por ciento de suero fetal bovino.

Cuente el número de celdas usando un contador de celdas. Después de contar, siembre las células en una placa de 96 pocillos con fondo redondo en 3D. Después de la siembra, incube las células a 37 grados centígrados con un cinco por ciento de dióxido de carbono durante 72 horas continuas.

Después de 36 horas, reemplace la mitad del medio de cultivo con medio fresco. Primero, descongele la solución de gel a cuatro grados centígrados y luego dilúyala en una proporción de uno a cinco con el medio sérico reducido. Aspire los esferoides del medio DMEM con una micropipeta.

A continuación, lavar los esferoides con cinco mililitros de medio sérico reducido. Transfiera con cuidado los esferoides suspendidos y el gel diluido. En una placa de 15 pocillos, incruste 300 microlitros del líquido mezclado de esferoides y gel diluido.

Incubar la placa a 37 grados centígrados y cinco por ciento de dióxido de carbono durante una hora. A continuación, agregue 400 microlitros de medio sérico reducido a un solo pocillo. Para evitar la evaporación, llene los alrededores del pozo con agua estéril.

Luego, cultive las células a 37 grados Celsius, cinco por ciento de dióxido de carbono y 100 por ciento de humedad durante una hora. Después de la incubación, aspire el medio viejo y agregue 600 microlitros de medio sérico reducido con un suplemento de crecimiento de células endoteliales al uno por ciento al pocillo e incube durante un día. Captura de imágenes con un microscopio de luz invertida.

Aquí, el brote esferoide de las células se captura utilizando un microscopio de luz invertida para estudiar el efecto del silenciamiento del gen VHL en el potencial angiogénico de las células endoteliales. Se observa que un esferoide brota 12 horas después del tratamiento lentiviral tanto en las células endoteliales silenciadas de control como en las de VHL. A continuación, se realiza un análisis estadístico para cuantificar la longitud de los brotes generados por los esferoides silenciados por el gen VHL.

La longitud media de los brotes parece ser de unos 125 micrómetros en los grupos silenciados de la VHL, mientras que en el grupo de control es de sólo unos 65 micrómetros. La longitud promedio acumulada de los brotes del grupo silenciado de la BVS es de aproximadamente 1250 micrómetros, mientras que la del grupo control es de 680 micrómetros. Estos resultados indican un aumento de dos veces la longitud de los brotes en los grupos silenciados de la BVS.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 48 horas si se realiza correctamente. Siguiendo este procedimiento y método como la formación capilar, se puede realizar un ensayo para responder preguntas adicionales. Como explorar la capacidad angiogénica de las células endoteliales vasculares.

Después de este desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la angiogénesis exploraran la vasculorización interna del tumor. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de qué genes pierden una función en las células endoteliales manipuladas que se utilizan para el ensayo explosivo.