Name: Un procedimiento integral para evaluar el rendimiento In Vitro de la neovascularización de Hemangioblastoma putativo con el esferoide brotación ensayo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-12T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Aprende a evaluar la neovascularización de hemangioblastomas mediante el ensayo de brotación de esferoides in vitro. Este método revela que la angiogénesis clásica actúa como mecanismo complementario en estos tumores vasculares.

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Este trabajo fue financiado por becas del Comité de Shanghai de ciencia y tecnología (15411951800, 15410723200). Los autores desean agradecer al Prof. YuMei Wen y Prof. Chao Zhao de la Universidad del Departamento de microorganismo patógenos de Fudan para su asistencia técnica.

Este método fue realizado según las directrices aprobadas y regulaciones de la investigación ética Comité de Huashan Hospital, Universidad de Fudan. Correspondientes medidas de seguridad estándar se siguieron en cada paso. Una presentación esquemática, por favor consulte la figura 1.
1. cultura y construcción del plásmido de la célula
<ol><li>Habitualmente, mantener las células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) en Dulbecco de modificado medio del águila (DMEM) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS), 100 unidades/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina en un 5% humidificado incubadora de CO2 a 37 ° C.</li>
	<li>Digerir PLKO.1 plásmido con ApaI y EcoRI para la síntesis del fragmento de shRNAs. Garantizar que la secuencia de oligonucleótidos del vector de shRNAs BVS CCGGGATCTGGAAGACCACCCAAATCTCGAGA TTTGGGTGGTCTTCCAGATCTTTTTG14.</li>
	<li>Luego, mezcle 20 sistema µΜ delantero 5 μl de oligo, 5 μl de oligo reverse, 5 μl de 10 x buffer de NEB y 35 μl de ddH2O junto (el volumen total es de 50 μL). Calienta la mezcla a 98 ° C por 4 minutos y poco a poco enfriar a temperatura ambiente unas horas.</li>
	<li>Ligar los oligos recocido y PLKO.1 plásmido junto con T4 ligasa a 4 ° C para pasar la noche. 16 h más tarde, añadir 5 μl de mezcla de ligadura en competentes DH5α células de 25 μl. Luego, la plásmidos ligada con éxito de la pantalla y verificar el fragmento insertado por la secuencia.</li>
</ol>2. infección y paquete de lentivirus
<ol><li>En total, mezclar 10 μg del vector PLKO.1-shVHL o PLKO.1-shScramble, 7,5 μg de plásmido psPAX2 de embalaje y 2,5 μg de envolvente plásmido pMD2.G en 500 μl del medio DMEM sin suero fetal bovino (FBS) durante 25 minutos.</li>
	<li>Añadir 7 mLDMEM sin SFB a la solución preparada anteriormente.</li>
	<li>La cultura 293 células FT en DMEM sin FBS en un platos de cultivo de tejidos de 10 cm de diámetro. Asegúrese de que el número de células 293 pies es 1 x 107 usando un contador de células.</li>
	<li>Añadir 1 mL de la solución preparada anteriormente en el soporte de células 293 pies para transfección. Nota: La línea celular de 293 pies se deriva de la línea celular de 293F y estable expresan el antígeno T grande de SV40. Por lo tanto, es un huésped adecuado para la producción de lentivirales.</li>
	<li>Reemplazar el medio de cultivo con DMEM con 10% FBS después de 6 h.</li>
	<li>Recoger los medios de comunicación con una pipeta a las 48 h después de transfección. Nota: El virus existe en DMEM con 10% FBS. Las células muertas flotan en el medio. Utilizar membrana estéril de 0,45 μm para filtrar las células muertas e impurezas. Por lo general, no hay necesidad para revisar la multiplicidad de infección (MOI). Se trata de establecer una línea estable de células. En el último paso, todas las células vivas sin éxito infección morirán por puromicina. El grupo de shScramble y las células HUVEC están el grupo de control. Asegúrese de que todas las células HUVEC mueren con la concentración de puromicina usado por 72 h. Cada pozo tiene el mismo número de células.</li>
	<li>La cultura las células HUVEC en los medios de comunicación lentivirales para 72 h. Luego, añadir puromicina a los medios de comunicación de las células HUVEC en una concentración de 2 μg/mL para las células HUVEC uso de 24 h. sin ningún tratamiento como el grupo de control. Asegúrese de que todos los de control las células mueren por este tiempo. Nota: Las células vivas representan una línea celular estable de células precipitación BVS y shSramble. La densidad de placas es 5.000/pozo en placas de 96 pocillos.</li>
</ol>3. generación de esferoides de células endoteliales
<ol><li>Trypsinize las células HUVECs y resuspender en medio DMEM con 10% FBS. Con un número moderado de células en una placa de cultivo de 10 cm, añadir 1 mL de EDTA typsin.</li>
	<li>Las células en una placa de 96 pocillos de fondo redondo 3D, con una densidad celular de 1 × 103 células/pozo de la semilla. Uso de un bien que puede acomodar un esferoide de 0,50 μL para suspender el esferoide. Contar las células mediante un sistema de contador celular siguiendo las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Incube las células a 37 ° C y 5% CO2 continuamente durante 72 h. En estas condiciones, asegurarse de que las células suspendidas forman los esferoides celulares automáticamente. Vuelva a colocar la mitad de medio de cultivo después de 36 h.</li>
</ol>4. ensayo de angiogénesis in vitro
<ol><li>Descongelar la solución gel a 4 ° C y diluir con el medio de suero reducido en una proporción de dilución de 1:5.</li>
	<li>Chupar los esferoides de medio de cultivo DMEM con una micropipeta. Después de lavar los esferoides con 5 mL de medio de suero reducido, suspender los esferoides suavemente y con cuidado el gel diluido. Asegúrese de que no hay ninguna burbuja de aire.</li>
	<li>Incorporar 300 μL de líquido mezclado en una placa de la pozo 15. Después de incubación a 37 ° C y 5% CO2 para 1 h, añadir 400 μL del medio reducido suero a cada pozo. Llene de agua estéril alrededor de los pozos para generar un ambiente humidificado para dificultar la evaporación.</li>
	<li>Después de eso, la cultura la placa a 37 ° C en 5% CO2 en el 100% de humedad durante 1 hora.</li>
	<li>Cuidadosamente aspirar el medio viejo y sustituirlo por 600 μl del medio de suero reducido con suplementos de crecimiento celular endotelial de 1% en cada pozo.</li>
	<li>Después de 12 h o 24 h, tomar imágenes en un microscopio de luz invertido (40 *).</li>
</ol>5. Análisis de datos
<ol><li>Subir las imágenes a una plataforma de análisis de imagen en línea para obtener datos de la longitud del brote (Tabla de materiales).</li>
	<li>En la página web, crear una cuenta de correo electrónico.</li>
	<li>Luego subir las imágenes haciendo clic en el botón subir.</li>
	<li>Descargar el resultado haciendo clic en el botón de descarga. Nota: El software genera los datos y la imagen procesada. Los datos contienen cinco partes: brote acumulado, longitud de brotes promedio, la desviación estándar de longitud de brotes, área de brote y esferoide. En la imagen procesada, cada parámetro se contornea en un color diferente para facilitar la identificación en la imagen procesada: rojo representa brotes de esqueleto, el número de brotes de amarillo, azul el brote estructura final brote blanco y naranja esferoide.</li>
</ol>

<ol><li>Lonser, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0140673603136434">von Hippel-Lindau disease.</a> Lancet. 361 (9374), 2059-2067 (2003).</li>
<li>Hussein, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+capillary+haemangioblastoma%3A+the+pathologist%27s+viewpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">Central nervous system capillary haemangioblastoma: the pathologist's viewpoint.</a> Int J Exp Pathol. 88 (5), 311-324 (2007).</li>
<li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemangioblastomas+might+derive+from+neoplastic+transformation+of+neural+stem+cells%2Fprogenitors+in+the+specific+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Hemangioblastomas might derive from neoplastic transformation of neural stem cells/progenitors in the specific niche.</a> Carcinogenesis. 32 (1), 102-109 (2011).</li>
<li>Zhuang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+derived+vasculogenesis+in+von+Hippel-Lindau+disease-associated+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Tumor derived vasculogenesis in von Hippel-Lindau disease-associated tumors.</a> Sci Rep. 4, 4102(2014).</li>
<li>Glasker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VHL-deficient+vasculogenesis+in+hemangioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">VHL-deficient vasculogenesis in hemangioblastoma.</a> Exp Mol Pathol. 96 (2), 162-167 (2014).</li>
<li>Wizigmann-Voos, S., Breier, G., Risau, W., Plate, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+vascular+endothelial+growth+factor+and+its+receptors+in+von+Hippel-Lindau+disease-associated+and+sporadic+hemangioblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of vascular endothelial growth factor and its receptors in von Hippel-Lindau disease-associated and sporadic hemangioblastomas.</a> Cancer Res. 55 (6), 1358-1364 (1995).</li>
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<li>Kawamura, J., Garcia, J. H., Kamijyo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+hemangioblastoma%3A+histogenesis+of+stroma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Cerebellar hemangioblastoma: histogenesis of stroma cells.</a> Cancer. 31 (6), 1528-1540 (1973).</li>
<li>Jurco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemangioblastomas%3A+histogenesis+of+the+stromal+cell+studied+by+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">Hemangioblastomas: histogenesis of the stromal cell studied by immunocytochemistry.</a> Hum Pathol. 13 (1), 13-18 (1982).</li>
<li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+tumorigenic+cells+and+implication+of+their+aberrant+differentiation+in+human+hemangioblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Identification of tumorigenic cells and implication of their aberrant differentiation in human hemangioblastomas.</a> Cancer Biol Ther. 12 (8), 727-736 (2011).</li>
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<li>Laib, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid-based+human+endothelial+cell+microvessel+formation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1202-1215 (2009).</li>
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<li>Finkenzeller, G., Graner, S., Kirkpatrick, C. J., Fuchs, S., Stark, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+in+vivo+vasculogenic+potential+of+endothelial+progenitor+cells+in+comparison+to+human+umbilical+vein+endothelial+cells+in+a+spheroid-based+implantation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">Impaired in vivo vasculogenic potential of endothelial progenitor cells in comparison to human umbilical vein endothelial cells in a spheroid-based implantation model.</a> Cell Prolif. 42 (4), 498-505 (2009).</li>
<li>Morin, K. T., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+angiogenesis+and+vasculogenesis+in+fibrin+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro models of angiogenesis and vasculogenesis in fibrin gel.</a> Exp Cell Res. 319 (16), 2409-2417 (2013).</li>
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<li>Straume, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+heat+shock+protein+27+induces+long-term+dormancy+in+human+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Suppression of heat shock protein 27 induces long-term dormancy in human breast cancer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (22), 8699-8704 (2012).</li>
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<li>Naumov, G. N., Folkman, J., Straume, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+dormancy+due+to+failure+of+angiogenesis%3A+role+of+the+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Tumor dormancy due to failure of angiogenesis: role of the microenvironment.</a> Clin Exp Metastasis. 26 (1), 51-60 (2009).</li>
<li>Wang, Y., Yang, J., Du, G., Ma, D., Zhou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+respond+to+cerebral+ischemia+without+susceptibility+to+HB-tumorigenesis+in+VHL+heterozygous+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Carcinog%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects respond to cerebral ischemia without susceptibility to HB-tumorigenesis in VHL heterozygous knockout mice.</a> Mol Carcinog. 56 (10), 2342-2351 (2017).</li>
<li>Stratmann, R., Krieg, M., Haas, R., Plate, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putative+control+of+angiogenesis+in+hemangioblastomas+by+the+von+Hippel-Lindau+tumor+suppressor+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Putative control of angiogenesis in hemangioblastomas by the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 56 (11), 1242-1252 (1997).</li>
<li>Correa de Sampaio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heterogeneous+in+vitro+three+dimensional+model+of+tumour-stroma+interactions+regulating+sprouting+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A heterogeneous in vitro three dimensional model of tumour-stroma interactions regulating sprouting angiogenesis.</a> PLoS One. 7 (2), 30753(2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Recientemente, varios campos de investigación de la biología vascular fueron estimulados por el estudio del endotelio angiogénicos15. En este artículo, hemos desarrollado un esferoide endotelial brotación técnica como un modelo experimental para estudiar la formación de vasos que origina la pérdida del gen VHL de función en las células endoteliales manipuladas para identificar moléculas de nuevo candidato de la cascada angiogénica. A lo mejor de nuestro conocimiento, éste es el primer informe para...

(HBs) los hemangioblastomas son tumores vasculares benignos que se encuentran exclusivamente en el sistema de nervioso central (SNC) humano. Se desarrollan en pacientes con enfermedad de von Hippel-Lindau (VHL) o lesiones esporádicas. BVS-HBs son difíciles de curar a través de tratamiento quirúrgico debido a la frecuente repetición y lesiones múltiples que resultan de esta genética desorden1. Aunque la inactivación del gen supresor VHL tumor se ha considerado la causa principal de la tumorigénesis de BVS-HBs, el origen citológico (incluyendo el neovascularization) y el proceso evolutivo de HBs siendo polémico en gran parte2. Por lo tanto, una mejor comprensión de los mecanismos biológicos de HB-neovascular puede proporcionar ideas útiles sobre las estrategias más prometedoras vasculares para BVS-HBs.
La investigación reciente ha sugerido que HB-neovascularización es similar a la vasculogénesis embriológico3,4,5. Clásico factor de crecimiento endotelial (VEGF)-angiogénesis mediada que origina el endotelio vascular y que es conducido por pérdida de la BVS de la función dio lugar a la proliferación y la formación neovascular, que ha sido desafiado6. En 1965, Cancilla y Zimmerman encontró, utilizando microscopía electrónica, que HBs se originaron en el endotelio7. Más tarde se encontró que las células del estroma se derivan vasoformativas elemento8. En 1982, Jurco et al encontraron que las células del estroma son de origen endotelial9. Por lo tanto, la hipótesis de que las células endoteliales vasculares humanas son las células originales de neovascularización de la HB10. Aunque es mejor utilizar los cultivos primarios de células HB de cirugías pacientes VHL, nuestra investigación anterior indicó que cultivos primarios de HB no son estables, y las líneas celulares no pueden ser establecido3. Por otra parte, los cultivos primarios en el entorno 3D no pudieran identificar el origen citológico de neovascularización de HB porque incluyen los progenitores de HB-vascular ingredientes10,11. Por lo tanto, como un modelo primitivo y clásico de las células endoteliales, las células endoteliales vasculares humanas (HUVEC) podían servir como modelo celular alternativo para HBs.
El ensayo de despunte de esferoide es un nuevo modelo en tejido ingeniería12,13. En este papel, un cocultivo de colágeno-basado 3D sistema en vitro con el esferoide brotación ensayo fue desarrollado, con una meta para evaluar si la angiogénesis tumoral clásico existe en HBs, así como su papel en HBs.

<table><tbody><tr><td>célula endotelial de la vena umbilical humana</td><td>Fudan IBS Cell Center</td><td>FDCC-HXN180</td><td></td></tr><tr><td>dulbecco' Es un águila modificada' s medio&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11995040</td><td></td></tr><tr><td>suero fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>&nbsp; </td><td></td>26400044</tr><tr><td>PLKO.1-puro vector</td><td>Addgene</td><td>#8453</td><td></td></tr><tr><td>empaquetamiento plásmido psPAX2&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>#12260</td><td></td></tr><tr><td>plásmido de envoltura pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>#12259</td><td></td></tr><tr><td>3D de fondo redondo placas de 96 pocillos</td><td>S-Bio</td><td>MS-9096M</td><td></td></tr><tr><td>matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>medio Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>medio de suero reducido&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa de 15 pocillos</td><td>Ibidi</td><td>81501</td><td>Las burbujas de aire en el gel se pueden reducir equilibrando el &mu; &ndash; Desliza la angiogénesis antes de usarla dentro de la incubadora durante la noche</td></tr><tr><td>suplementos para el crecimiento de células endoteliales</td><td>Sciencell</td><td>#1052</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo de 10 cm</td><td>Corning</td><td>Scipu000813</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Gibco</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>typsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Sistema Automatizado de Contador de Células &nbsp;</td>Software de análisis de imágenes <td>BioTech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Winmasis</td><td></td><td>http://mywim.wimasis.com&nbsp;</td></tr></tbody></table>

un procedimiento integral para evaluar el rendimiento in vitro de la neovascularización de hemangioblastoma putativo con el esferoide brotación ensayo

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

La inactivación del gen de supresor de tumor von Hippel-Lindau (VHL) desempeña un papel crucial en el desarrollo de hemangioblastomas (HBs) en el sistema de nervioso central (SNC) humano. Sin embargo, el origen citológico y el proceso evolutivo de HBs (incluyendo el neovascularization) siguen siendo polémicas, y anti-angiogénesis para la BVS-HBs, basados en el clásico HB angiogénesis, han producido resultados decepcionantes en ensayos clínicos. Un obstáculo importante para la traducción clínica exitosa de tratamiento vascular es la falta de un conocimiento profundo del neovascularization en este tumor vascular. En este artículo, presentamos un procedimiento general para evaluar en vitro si angiogénesis tumoral clásico existe en HBs, así como su papel en HBs. Con este procedimiento, los investigadores pueden comprender la complejidad de la neovascularización de la HB con precisión e identificar la función de esta forma común de la angiogénesis en HBs. Estos protocolos pueden utilizarse para evaluar la terapia vascular más prometedor para los tumores, que tiene alto potencial traslacional para tratamiento de tumores o para ayudar en la optimización del tratamiento anti-angiogénico para HBs en el futuro las traducciones. Los resultados destacan la complejidad de la neovascularización de la HB y sugieren que esta angiogénesis forma común es solamente un mecanismo complementario en la neovascularización de la HB.

Imágenes originales son tomados por microscopio de luz invertida. Las imágenes típicas del grupo control y el grupo de la BVS se muestran en la figura 2-A1 y figura 2-A2. La longitud de brote del grupo de control es más corta que el del grupo VHL.
Después de subir las imágenes, la plataforma online ofrece análisis de resultados directam...

Este trabajo presenta un procedimiento general para evaluar en vitro si angiogénesis tumoral clásico existe en los hemangioblastomas (HBs) y su papel en HBs. Los resultados destacan la complejidad de la neovascularización de la HB y sugieren que esta forma común de angiogénesis es solamente un mecanismo complementario en la neovascularización de la HB.

Un procedimiento integral para evaluar el rendimiento In Vitro de la neovascularización de Hemangioblastoma putativo con el esferoide brotación ensayo

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

El objetivo general de este experimento es evaluar el rendimiento de la neovascularización putativa del hemangioblastoma mediante el ensayo de germinación esferoide in vitro. El método puede ayudar a responder las preguntas clave en el campo angiogénico, como la angiogénesis tumoral. La principal ventaja de esta técnica es que es producto de un procedimiento integral para evaluar in vitro donde el tumor clásico de angiogénesis existe en el hemangioblastoma y crece en el hemangioblastoma.La implicación de esta técnica se extiende hacia la terapia del hemangioblastumor y la vasculatura porque los resultados ponen de manifiesto la complejidad de la neovascularización del hemangioblastumor, y eso sugiere que esta forma común de angiogénesis es sólo un mecanismo complementario. Por lo tanto, este método puede proporcionar información sobre el estudio de la neovascularización del hemangioblastumor. También se puede aplicar a tumores, angiogénesis y aplicaciones relacionadas con la vasculogénesis en algunos tumores sólidos, como el mimetismo vasculogénico tumoral en tumor de vidrio.La demostración real de este método es crítica, ya que la generación de estos esferoides manipulados de célu

a-comprehensive-procedure-to-evaluate-vitro-performance-putative

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

La invasión de los tejidos normales circundantes es una característica definitoria de los tumores malignos. Proporcionamos aquí un ensayo de microplaca simple y semiautomatizado de invasión en una biomatriz 3D natural que se ha ejemplificado con una serie de modelos de cánceres humanos avanzados.

Tumor Ensayo tridimensional (3D) esferoide Invasion

El protocolo describe cómo diseñar una red vascular perfusable en un esferoide. Microambiente circundante del esferoide es ideado para inducir angiogénesis y conectarse el esferoide de los microcanales en un dispositivo de microfluidos. El método permite la perfusión de la esferoide, que es una técnica largamente esperada en cultivos tridimensionales.

Perfusable Red Vascular con un modelo de tejido en un dispositivo de microfluidos

Presenta protocolo una novela en vitro la tira de ensayo más modelos adecuadamente el proceso de en vivo brotación angiogénesis mediante la incorporación de pericitos. Esta modificación permite el ensayo de grano más fielmente recapitular las interacciones celulares heterotípicos entre las células endoteliales y las células murales que son críticas para la angiogénesis.

Incorporación de pericitos en un grano de célula endotelial brotación ensayo

Este método describe el cultivo de células endoteliales derivadas de iPSC como 40 microvas 3D perfundidas en una plataforma microfluídica estandarizada. Esta plataforma permite el estudio de la brotación angiogénica impulsada por gradientes en 3D, incluyendo anastomosis y estabilización de los brotes angiogénicos de una manera escalable y de alto rendimiento.

Ensayo estandarizado y escalable para estudiar la brotación angiogénica 3D perfundida de células endoteliales derivadas de iPSC in Vitro

El sistema de ensayo de angiogénesis esferoide cocultura tridimensional está diseñado para imitar la angiogénesis fisiológica. Los esferoides de cocultivo están formados por dos precursores de células vasculares humanas, EFCC y MSC, e incrustados en gel de colágeno. El nuevo sistema es eficaz para evaluar moduladores angiogénicos y proporciona información más relevante al estudio in vivo.

Sistema de ensayo de angiogénesis tridimensional utilizando esferoides de cocultura formados por células formadoras de colonias endoteliales y células madre mesenquimales

Este protocolo presenta el ensayo de brotación coroides, un modelo ex vivo de proliferación microvascular. Este ensayo se puede utilizar para evaluar las vías implicadas en la proliferación de micro vasos corooidales y evaluar los tratamientos farmacológicos utilizando tejido de ratón de tipo salvaje y modificado genéticamente.

Un ensayo ex vivo de brotes de coroides de angiogénesis microvascular ocular

Este ensayo utiliza células madre embrionarias de ratón diferenciadas en cuerpos embrioides cultivados en gel de colágeno 3D para analizar los procesos biológicos que controlan la angiogénesis germinada in vitro. La técnica se puede aplicar para probar medicamentos, modelar enfermedades y estudiar genes específicos en el contexto de deleciones que son embrionariamente letales.

In vitro Ensayo de germinación tridimensional de angiogénesis utilizando células madre embrionarias de ratón para el modelado de enfermedades vasculares y pruebas de fármacos

La diafonía entre las células epiteliales mamarias y las células endoteliales contribuye de manera importante a la progresión del cáncer de mama, el crecimiento tumoral y la metástasis. En este estudio, los esferoides se han hecho de células de cáncer de mama junto con células endoteliales vasculares y / o linfáticas y demuestran su aplicabilidad como un sistema in vitro para la investigación del cáncer de mama.

Esferoides epiteliales y endoteliales mamarios como un modelo funcional potencial in vitro para la investigación del cáncer de mama

Aquí, presentamos un protocolo que permite la fabricación rápida, robusta y barata de esferoides tumorales seguida de encapsulación de hidrogel. Es ampliamente aplicable ya que no requiere equipo especializado. Sería particularmente útil para explorar las interacciones esferoides-matrices y construir modelos de fisiología tisular o patología in vitro .

Fabricación y encapsulación de esferoides tumorales en hidrogeles de polietilenglicol para el estudio de las interacciones esferoide-matriz

Este estudio presenta el ensayo bidimensional (2D) de migración de heridas por arañazo y el ensayo tridimensional (3D) de brotes esferoides, junto con sus respectivos métodos de análisis posteriores, incluida la extracción de ARN y la inmunocitoquímica, como ensayos adecuados para estudiar la angiogénesis in vitro.

Investigación de la angiogénesis a nivel funcional y molecular mediante el uso del ensayo de migración de heridas por arañazo y el ensayo de germinación de esferoides.

Aprende a evaluar la neovascularización de hemangioblastomas mediante el ensayo de brotación de esferoides in vitro. Este método revela que la angiogénesis clásica actúa como mecanismo complementario en estos tumores vasculares.

Un procedimiento integral para evaluar el rendimiento In Vitro de la neovascularización de Hemangioblastoma putativo con el esferoide brotación ensayo (Video) | JoVE Journal

Un procedimiento integral para evaluar el rendimiento In Vitro de la neovascularización de Hemangioblastoma putativo con el esferoide brotación ensayo

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