Name: Perfusable Red Vascular con un modelo de tejido en un dispositivo de microfluidos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Aprende a construir redes vasculares perfusibles en esferoides usando una plataforma microfluídica con PDMS. Este método permite simular la administración de fármacos in vitro para investigación en medicina regenerativa.

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Este trabajo fue apoyado por cresta JST (número JPMJCR14W4), sociedad para la promoción de la ciencia (JSP) KAKENHI (número de concesión 25600060, 16 16386 K), el centro de innovación programa de MEXT y TJS, se centró en el desarrollo de la tecnología de clave evaluación de Agencia de Japón para investigación médica y el desarrollo, AMED, Mizuho Fundación para el fomento de las ciencias. Microfabricación fue apoyado por el centro de tecnología de Nano de la Universidad de Kyoto.

1. fabricación del molde dispositivo microfluídico
<ol><li>Diseñar el modelo del dispositivo microfluídico utilizando software disponible comercialmente (Clewin5 o AutoCAD 2016, etcetera.). Para la función de la Clewin5, consulte el manual del usuario (http://manualzz.com/doc/7159150/clewin-user-s-manual). Nota: El archivo del diseño está disponible en archivo adicional 1.</li>
	<li>Transferir el archivo de diseño a un micro generador y carga la herramienta con una máscara de cromo recubierta con el photoresist positivo.</li>
	<li>Exponer el photoresist positivo en la zona de patrón utilizando un generador de patrón micro.</li>
	<li>Desarrollar el photoresist positivo usando el revelador (Tabla de materiales) y enjuague la máscara con agua desionizada (DI).</li>
	<li>Usando el grabador de cromo (Tabla de materiales), grabe el cromo en el área expuesta donde fue quitado el photoresist positivo. Enjuague la máscara con agua desionizada.</li>
	<li>Eliminar el remanente de la fotoresistencia en la máscara usando acetona. Nota: La máscara de transparencia puede ser una alternativa para la máscara de Cr.</li>
	<li>Preparar una oblea de silicio limpia (4 pulgadas, P(100)) y spin capa hexamethyldisilazane (HMDS) a 3.000 rpm durante 30 s.</li>
	<li>HMDS Softbake durante 5 minutos a 120 ° C y la oblea se enfríe durante 5 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Spincoat el photoresist negativo (tabla de materiales) en 500 rpm durante 10 s y 1.200 r.p.m. durante 30 s. Nota: La condición de la capa de vuelta debe producir las capas de Fotoprotección con un espesor de aproximadamente 100 μm en las obleas después de fotolitografía.</li>
	<li>Prebake el photoresist negativo por 45 min a 95 ° C y enfriar la oblea durante 60 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Compruebe la intensidad de la luz UV en cada experimento y calcular el tiempo de exposición para una dosis de energía de exposición total en 250 mW/cm2. Coloque la fotomáscara (paso de 1.1-1.6) en la oblea y exponerlas a la luz UV.</li>
	<li>Postbake el photoresist negativo durante 1 min a 65 ° C y a 5 min a 95 ° C. Permita que la oblea se enfríe durante 1 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Desarrollar la capa de photoresist negativo durante 15 min en el primer baño de desarrollador (Tabla de materiales) y a 2 minutos en el segundo baño. Enjuague la oblea en el primer baño de isopropanol (IPA) durante 10 s y en el segundo baño de IPA para 10 s.</li>
	<li>Hardbake el photoresist negativo durante 30 min a 200 ° C y la oblea se enfríe durante 5 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Medir el espesor de la capa de photoresist negativo utilizando a un analizador de superficie.</li>
	<li>Colocar la oblea en un desecador conectado a una bomba de vacío y añadir 200 μL de silano (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane). Encienda la bomba durante 10 minutos, luego apáguelo y mantenga la oblea en el desecador durante 4 horas.</li>
</ol>2. fabricación pasos y el conjunto de capas PDMS
<ol><li>El polímero de polidimetilsiloxano (PDMS) antes del molde (base PDMS: agente endurecedor = 10:1 (w/w)) y extraiga el gas en una cámara de vacío por 2 h.</li>
	<li>Cura de PDMS a 80° C en un horno de aire expulsado durante la noche.</li>
	<li>Pele los PDMS de la oblea de silicio.</li>
	<li>Perforar los agujeros 1A - 3B (figura 1) y la cultura de esferoide bien. Use un punzón de 2 mm de diámetro de agujeros 1A - 3B y un diámetro de 1 mm del sacador para el esferoide bien.</li>
	<li>Limpiar la losa PDMS y un cubreobjetos de vidrio (24 x 24 mm) con cinta adhesiva, pegando y despegando la cinta. Luego tratar la losa PDMS con plasma aire 40 s (40 mW, 50 sccm).</li>
	<li>Enlace de la losa PDMS en el vidrio cubreobjetos para expulsar cualquier burbuja de aire de la superficie de la losa PDMS, cubreobjetos y curado a 80 ° C durante al menos 12 h.</li>
</ol>3. esferoide preparación
Nota: En el estudio, la proteína fluorescente roja expresando umbilical humano vena células endoteliales (RFP-HUVECs) y proteína fluorescente verde expresando HUVECs (GFP-HUVECs) se utilizan en el esferoide y microcanales, respectivamente, para distinguir el origen de HUVECs después de la construcción de una red vascular perfusable. Si no es necesario el origen de HUVECs, HUVECs son suficientes para el experimento.
<ol><li>Descongelar la RFP-HUVECs (3,0 × 105 células/frasco) y fibroblastos de pulmón humano (hLF) (1,0 × 106 células/frasco) y añadir a 10 mL de medio para las células endoteliales y células del fibroblasto, respectivamente (Tabla de materiales). La cultura les en un plato de 100 mm a 37 ° C y 5% CO2 para 2-3 días para el confluente HUVECs RFP y hLFs. Esta preparación dará ~ 200 esferoides.</li>
	<li>Separar el RFP HUVECs y hLFs de los platos con 2 mL de tripsina 0,05%-EDTA y detener la reacción de la tripsina con 4 mL de DMEM con 10% (v/v) de suero bovino fetal (FBS) y 1% (v/v) penicilina/estreptomicina.</li>
	<li>Después de la centrifugación a 220 x g durante 3 min, eliminar el sobrenadante y resuspender el RFP HUVECs y hLFs en el medio endotelial a concentración celular final 2,5 × 104 y 1,0 × 105 células/mL, respectivamente.</li>
	<li>Suavemente agregar 200 μL de la suspensión de células (5.000 células de RFP HUVECs) y 20.000 células para hLFs por pozo en una placa de 96 pocillos con superficie de enlace bajas.</li>
	<li>Incubar la placa de 96 pocillos en 37 ° C y 5% CO2 para un período de 2 a 4 días. Nota: Puesto que el diámetro de esferoide depende el período de cultivo y el número de células iniciales en la placa de 96 pozos, puede ser controlada por estos dos parámetros.</li>
</ol>4. célula de siembra en el dispositivo de microfluidos
Nota: La Convención de nomenclatura para los agujeros, canales y el esferoide bien se demuestran en la figura 1. Entendemos por día 0 el día cuando se termina la recolección de celulares en el dispositivo de microfluidos. Esquema de las líneas de tiempo experimental se muestra en la figura 2.
<ol><li>Carga de esferoide día −1) Nota: El siguiente paso debe realizarse en hielo para evitar la gelificación de colágeno y fibrina.<ol>
<li>Disolver el fibrinógeno en tampón fosfato salino (PBS) para una concentración final de 2,80 mg/mL.</li>
		<li>Preparar el colágeno neutralizado (3.0 mg/mL en PBS) según protocolo del fabricante.</li>
		<li>Combinar 107.2 μl de solución de fibrinógeno (2,80 mg/mL), 8.0 μL de colágeno neutralizado (3.0 mg/mL) y 3.6 μl de aprotinina (5 U/mL) por reacción en un tubo. Esta solución se denomina "solución mix master" (MS). Nota: El volumen es suficiente para la carga de un esferoide. Si hay más de un esferoide, multiplique cada volumen por el número de esferoides.</li>
		<li>Trombina en PBS para una concentración final de 50 U/mL se disuelven. Nota: Alícuotas de 50 trombina U/mL (20 μl/tubo) se almacenan a −30 ° C y se descongelan antes de cada experimento.</li>
		<li>Coloque la placa de 96 pocillos que contienen esferoides dentro del gabinete de seguridad de la biotecnología.</li>
		<li>Preparar dos platos de Petri de 35 mm dentro de la bioseguridad de gabinete, con un plato en el hielo (plato 1) y el otro plato sobre la mesa (plato 2). Pipeta 99 μl de MS en el centro del plato 1 (figura 3a) para formar una gota.</li>
		<li>Recortar las puntas de 2 amarillos (10-100 μL) y 3 claras las puntas de pipeta (1-100 μL) de la colección de esferoides de la placa de 96 pocillos, mezcla de trombina con MS, colección precisa de los esferoides, inyección de los esferoides en el dispositivo e inyección de medios de comunicación en el dispositivo , respectivamente. El tamaño del poro de la punta debe ser ligeramente mayor que el diámetro de los agujeros 1A - 3B de los canales 1 y 3 o el esferoide en canal 2 para un ajuste preciso ajuste. Nota: En adelante, a menos que se indique lo contrario, use las puntas de pipetas en este paso. La fotografía de corte puntas está disponible en la figura 4.</li>
		<li>Recoger un esferoide con 100 μl de medio de la placa de 96 pocillos y agregar al plato 2 (figura 3a).</li>
		<li>Recoger el esferoide con volumen mínimo de los medios de comunicación del plato 2. Mientras sujeta la pipeta vertical, el esferoide debe moverse hacia la parte inferior de la punta de la pipeta por gravedad. Expulsar el esferoide tocando la punta de la pipeta en el menisco de la gota de MS en plato 1 (figura 3a). Nota: Los pasos siguientes 4.1.10 y 4.1.11 deben realizarse rápidamente.</li>
		<li>Añadir 1 μl de la trombina (50 U/mL) y mezclar suavemente con la punta de pipeta amarilla.</li>
		<li>Con la pipeta a 7 μl, recoger el esferoide y lentamente lo coloca en el pozo del esferoide (figura 3b).</li>
		<li>Incubar por 15 min a 37 ° C para la congelación de la fibrina.</li>
		<li>Inyecte lentamente el medio endotelial de agujeros 1A y 3A y llenar los canales 1 y 3 con los medios de comunicación (20 ~ 30 μL/canal).</li>
		<li>Coloque el dispositivo en un plato de 100 mm con un Kimwipe húmedo para evitar la evaporación de los medios desde el dispositivo (Figura 3C).</li>
		<li>Coloque el dispositivo en 37 ° C y 5% de CO2 durante 24 h eliminar las burbujas en la interfase entre los medios y la fibrina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Día 0) HUVECs carga<ol>
<li>Descongelar la GFP-HUVECs (3.0 x 105 células/vial) y añadir a 10 mL del medio endotelial. La cultura les en un plato de 100 mm a 37 ° C y 5% CO2 para 2-3 días llegar a sub-confluencia. Un plato de los confluentes GFP-HUVECs es suficiente para la preparación de dispositivos 8-10.</li>
		<li>Separar GFP-HUVECs de los platos con 2 mL de tripsina 0,05%-EDTA y detener la reacción de la tripsina con 4 mL de DMEM con 10% (v/v) de suero bovino fetal (FBS) y 1% (v/v) penicilina/estreptomicina.</li>
		<li>Después de la centrifugación a 220 x g durante 3 min, Resuspender el GFP-HUVECs en medio endotelial en 5.0 x 106 células/mL.</li>
		<li>Inyectar la suspensión de células HUVECs en canal 1 a través del agujero 1B (20 μl/canal).</li>
		<li>Incline el dispositivo de microfluidos 90°, coloque en el lado e incubar a 37 ° C por 30 minutos asegurar que el HUVECs se adhieren a la fibrina en el canal 2.<ol>
<li>Confirmar la fijación de HUVECs en la fibrina. Cuando el número de HUVECs en la interfaz entre el gel y el medio no es suficiente, la vasculatura puede desconectarse en la raíz vascular después de algunos días de la cultura del dispositivo (figura 5). En el protocolo, la tasa de éxito de la perfusión es > 50%.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Repita los pasos 4.2.4 y 4.2.5 canal 3.</li>
		<li>Células en cultivo en un plato de 100 mm con un Kimwipe humedecido a 37 ° C y 5% de CO2 por 7-14 días.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Día 1 ~) Media exchange<ol>
<li>La mitad de los medios de comunicación en canales 1 y 3 cambio de cada día.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. tinción de núcleos
<ol><li>Preparar 4% paraformaldehido (PFA) en PBS.</li>
	<li>Quitar los medios de comunicación de los canales 1 y 3 y añadir 20 μl del 4% PFA por canal. Para sustituir la solución en 4% PFA, repetir eliminar la solución desde el dispositivo y agregar 4% PFA tres veces.</li>
	<li>Incubar el dispositivo a 4 ° C durante la noche.</li>
	<li>Quitar 4% PFA desde el dispositivo y el lavado de los canales tres veces con PBS.</li>
	<li>Añadir 20 μl de 10 μg/mL del colorante fluorescente (Tabla de materiales) por canal para teñir los núcleos celulares. Para cambiar la solución en el dispositivo, repita el eliminar la solución desde el dispositivo y agregar 10 μg/mL el tinte fluorescente tres veces.</li>
	<li>Guarde el aparato a 4 ° C por 24 h.</li>
</ol>6. líquida perfusión de un esferoide
<ol><li>Preparar el esferoide después de cultivo de más de 7 días en el equipo de 37 ° C y 5% CO2 para la realización de una vía vascular continua.</li>
	<li>Retire el medio de 3B, 1B, 3A y 1A de los agujeros.</li>
	<li>Introducir 10 μl de solución 10 μm isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrán en PBS en los agujeros 1A y 1B.</li>
	<li>Controlar el flujo de microesferas o tinte FITC bajo un microscopio invertido.</li>
</ol>7. cuantificación de la longitud de brotes
Nota: Software versión 1.49 de ImageJ se utiliza para todos los análisis de la imagen en este estudio.
<ol><li>Se superponen las imágenes de GFP HUVECs días 0, 1, 3, 5 y 7.</li>
	<li>Reste la posición de la punta de la vasculatura del día 0 de la misma posición en imágenes tomadas en los días 1, 3, 5 y 7.</li>
	<li>Determinar el crecimiento de la punta vascular desde la posición de la raíz (figura 6). La distancia entre la punta vascular y raíz se define como la longitud de brotes en este estudio (figura 7b).</li>
</ol>8. cuantificación de los ángulos Vascular
Nota: El ángulo Vascular se definió como el ángulo consistió en ángulo vascular, raíz y el centro del esferoide (figura 7 c).
<ol><li>Binarize las imágenes fluorescentes de la esferoide de cocultivo con RFP HUVECs y medir la posición de "centroide" por la función de análisis en ImageJ. En este estudio, la posición de medida "centroide" se define como el centro del esferoide (figura 6).</li>
	<li>Determinar la posición de los vasculares y las raíces de la misma manera en el paso 7.</li>
	<li>Medir los ángulos vasculares utilizando la función de análisis en el software ImageJ.</li>
</ol>

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<li>Nashimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+perfusable+vascular+networks+with+a+three-dimensional+tissue+in+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device.</a> Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).</li>
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<li>Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+requirement+for+fibroblasts+in+angiogenesis%3A+fibroblast-derived+matrix+proteins+are+essential+for+endothelial+cell+lumen+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).</li>
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<li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+Liquid+Tumors%3A+An+In+Vitro+Assay+for+Leukemic-Cell-Induced+Bone+Marrow+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in Liquid Tumors: An In Vitro Assay for Leukemic-Cell-Induced Bone Marrow Angiogenesis.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (9), 1014-1024 (2016).</li>
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</ol>

El autor declara que no tienen intereses financieros que compiten.

Informes anteriores muestran que hLFs secretan un cóctel de varios factores angiogénicos, como angiopoyetina-1, angiogenina, factor de crecimiento, transformación de factor de crecimiento-α, factor de necrosis tumoral y algunas de las proteínas de matriz extracelular29, 30. Este ensayo se basa en la secreción de angiogenic del hLFs en un esferoide de cocultivo, que es la limitación de la técnica. Por lo tanto, es fundamental para una formación vascular estable d...

El cambio de una cultura (bidimensional) de monocapa a una cultura tridimensional está motivado por la necesidad de trabajar con modelos de cultura que imitan las funciones celulares de la vida los tejidos1,2,3. Planos y duros plástico sustratos utilizados en cultivo de células no se parecen a la mayoría de los entornos extracelulares en el cuerpo humano. De hecho, muchos estudios demuestran que cultura tridimensionales recrear tejidos específicos la arquitectura, señales mecánicas y bioquímicas y comunicación de la célula, que no se han observado en la cultura bidimensional convencional4, 5,6,7,8.
Un agregado multicelular o esferoide, es una de las técnicas más prometedoras para realizar este cultivo tridimensional9,10. Las células secretan la matriz extracelular (ECM) y pueden interactuar con otros en el esferoide. Aunque algunos otros bioingeniería enfoques11,12,13,14, como el amontonamiento de células, replicar con éxito la complejidad espacial del cuerpo humano, estos enfoques tienen sólo dos o tres tipos de células para la facilidad de análisis y enfocada en sólo una de las funciones de órganos diana. En contraste, las células esferoides están expuestas a ambientes de cultivo diferentes dependiendo de sus posiciones en el esferoide debido a la heterogénea oferta de nutrientes, oxígeno y paracrina y autocrina señalización de moléculas en el esferoide. Esta característica de esferoides imita parcialmente en vivo cultura condición y activar las células esferoides para crear tejido mucho más complejo y organizado de la estructura en vitro que las cultivadas en el apilamiento de tejido9, 15 , 16. tenga en cuenta que si un esferoide se compone de un solo tipo de células, la función de las células en el esferoide no es uniforme debido al ambiente heterogéneo en el esferoide. En los últimos años, las culturas esferoide permitieron células de madre pluripotentes células madre embrionarias (ESCs), inducidas (iPSCs) o células madre de tejido-residente en vivo secuencias de desarrollo de imitar y recrear mini-órganos como el cerebro17, hígado18y riñón19,20.
A pesar de importantes avances en las técnicas de cultivo esferoide, cultivo esferoides grandes durante mucho tiempo es todavía problemático. En un tejido tridimensional, las células necesitan estar ubicados a menos de 150-200 μm de un vaso sanguíneo debido a la limitada fuente de oxígeno y nutrientes21. Redes vasculares en el esferoide están necesarias recapitular intercambiando sustancias entre la sangre y los tejidos in vivo. Para ello, otros grupos han co cultivadas las células endoteliales con las células de destino22,23,24 o inducido la diferenciación de las células pluripotentes en CD31-positive células20. Sin embargo, las estructuras de recipiente-como informadas no tiene los extremos abiertos del lumina para suministrar oxígeno y nutrientes al centro del esferoide. Para imitar la función vascular para nutrir las células en el cultivo tridimensional, abierta y perfusable de la red vascular debe ser desarrollada en el esferoide.
Durante los últimos años, algunos grupos de investigación en el campo de la Microtécnica informaron métodos para construir una red vascular perfusable, formada espontáneamente en un dispositivo de microfluidos utilizando factores angiogénicos de células de morfología de fibroblastos25 ,26. Estas redes vasculares tienen una morfología similar a sus contrapartes en vivo y pueden ser remodeladas por factores ambientales, haciéndolos convenientes para mímico funciones vasculares en una cultura del esferoide. El propósito de este protocolo es construir una red vascular perfusable en un esferoide usando una plataforma de microfluidos27. El dispositivo de microfluidos se modifica el dispositivo previamente divulgados25 por lo que puede ser incorporado un esferoide. Dirigiendo la secreción angiogénico de las células del fibroblasto de un esferoide a las células endoteliales en microcanales, angiogénica brota de los microcanales que se anastomosa con el esferoide y forma una red vascular perfusable. Este método permite una entrega directa de una amplia gama de sustancias, como las moléculas fluorescentes y granos micrómetro-escala en el interior de un esferoide, que proporciona el marco para un cultivo de tejidos a largo plazo con las redes vasculares.

<table><tbody><tr><td>AutoCAD 2017</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD 2017</td><td></td></tr><tr><td>Una máscara de cromo recubierta con AZP 1350.</td><td>TECNOLOGÍA DE SUPERFICIE LIMPIA</td><td>CBL2506Bu-AZP</td><td></td></tr><tr><td>Micro generador de patrones</td><td>Heidelberg</td><td>uPG101</td><td></td></tr><tr><td>MF CD-26 Revelador</td> de <td>materiales electrónicos Rohm and haas-Desarrollador</td><td></td> <td>en protocolo 1.4</td></tr><tr><td>S-Clean</td><td>Sasaki Chemical</td><td>S-24</td><td>Grabador de cromo en protocolo 1.5</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Wako</td><td>012-00343</td><td></td></tr><tr><td>Oblea de silicio</td><td>Canosis</td><td>SiJ-4</td><td></td></tr><tr><td>Spin Coater</td><td>MIKASA</td><td>1H-D7</td><td></td></tr><tr><td>Hexametildisilazano (HMDS)</td><td>Tokyo Ohka Kogyo</td><td>H0089</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3050</td><td>MicroChem-Negativo</td><td></td> <td>fotorresistente en protocolo 1.9</td></tr><tr><td>Exposición UV</td><td>Nanometric Technology Inc</td><td>LA310s</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 Revelador</td><td>MicroChem</td><td>Y020100</td><td>Revelador para el fotorresistente negativo en el protocolo 1.13</td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Wako</td><td>163-04841</td><td></td></tr><tr><td>Perfilador de superficies</td><td>Veeco</td><td>Veeco Dektak XT-S</td><td></td></tr><tr><td>(Tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silano</td><td>Sigma 448931</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polidimetilsiloxano (PDMS)</td><td>Dow Corning Toray</td><td>184W/C</td><td></td></tr><tr><td>Punzón de biopsia (1.0mm)&nbsp;</td><td>Punzón</td><td>de biopsia Kai Industries BP-10F</td><td></td></tr><tr><td>(2,0 mm) &nbsp;</td><td>Kai Industries</td><td>BP-20F</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Plasma</td><td>Femto Ciencia</td><td>COVANCE</td><td></td></tr><tr><td>Cubierta de vidrio</td><td>MATSUNAMI GLASS</td><td>C024241</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo</td><td>Iwaki</td><td>1000-035</td><td></td></tr><tr><td>RFP Expresión de células endoteliales de la vena umbilical humana</td><td>Angio Proteomia</td><td>cAP-0001RFP</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblastos pulmonares humanos normales</td><td>Lonza</td><td>CC-2512</td><td></td></tr><tr><td>Medio de crecimiento de células endoteliales</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>Kits de medios de crecimiento de fibroblastos</td><td>Lonza</td><td>CC-3132</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td> 11965092 <td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Solución de penicilina-estreptomicina</td><td>Wako</td><td>168-23191</td><td></td></tr><tr><td>0.05w/v% Tripsina-0.53mmol/l EDTA&bull; Solución 4Na con Rojo Fenol</td><td>Wako</td><td>204-16935</td><td></td></tr><tr><td>PBS (Sales tamponadas con fosfato)</td><td>Takara bio</td><td>T900</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos</td><td>Sumitomo baquelita</td><td>631-21031</td><td></td></tr><tr><td>1000ul Chip</td><td>NIPPON Genetics</td><td>FG-402</td><td></td></tr><tr><td>200ul&nbsp; Chip</td><td>NIPPON Genetics</td><td>FG-301</td><td></td></tr><tr><td>10ul Chip</td><td>NIPPON Genetics</td><td>37650</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>incubadora Thermo Fisher</td><td>Scientific Model 370</td><td></td></tr><tr><td>GFP Expresión de células endoteliales de vena umbilical humana</td><td>Angio Proteomia</td><td>cAP-0001GFP</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinógeno de plasma bovino</td><td>Sigma</td><td>F8630</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinina de pulmón bovino</td><td>Sigma</td><td>A6279</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno I</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Trombina de plasma bovino</td><td>Sigma</td><td>T4648</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H21492</td><td>Colorante fluorescente para teñir núcleos en el protocolo 5.5</td></tr><tr><td>Solución de paraformaldehído</td><td>Wako</td><td>163-25983</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia invertida</td><td>OLYMPUS</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Cámara CCD DEGITAL</td><td>OLYMPUS</td><td>ORCA-R2</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio biológico de barrido láser confocal</td><td>OLYMPUS</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia invertida</td><td>OLYMPUS</td><td>IX-83</td><td></td></tr><tr><td>Isotiocianato de fluoresceína-dextrano</td><td>Sigma</td><td>FD70S</td><td></td></tr></tbody></table>

perfusable red vascular con un modelo de tejido en un dispositivo de microfluidos

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

Un esferoide (un agregado multicelular) es considerado como un buen modelo de tejidos vivos en el cuerpo humano. A pesar del avance significativo en las culturas del esferoide, una red vascular perfusable en los esferoides sigue siendo un reto para la cultura a largo plazo necesaria para mantener y desarrollar sus funciones, como expresiones de la proteína y la morfogénesis. El protocolo presenta un método novedoso para integrar una red vascular perfusable dentro del esferoide en un dispositivo de microfluidos. Para inducir una red vascular perfusable en el esferoide, brotes angiogénicos conectados con microcanales fueron guiados a la esferoide utilizando factores angiogénicos de fibroblastos de pulmón humanos cultivados en el esferoide. Los brotes angiogénicos alcanzaron el esferoide, que se fusiona con las células endoteliales cultivadas conjuntamente en el esferoide y forman una red vascular continua. La red vascular podría inundar el interior del esferoide sin ninguna salida. La red vascular construida puede utilizarse más como una ruta para el suministro de nutrientes y eliminación de residuos, que mímico la circulación de sangre en vivo. El método proporciona una nueva plataforma en la cultura de esferoide hacia mejor recapitulación de los tejidos vivos.

La figura 1 muestra un diseño y una foto del dispositivo microfluídico. Tiene tres canales paralelos, en que canal 2 contiene el esferoide bien. Canales 1 y 3 se utilizan para el cultivo HUVEC y canal 2 es para el esferoide. Cada canal está separada por microposts trapezoidal diseñado para patrón de PDMS. Los microposts que no el hidrogel en canal 2 en canales 1 y 3 por tensión superficial y permiten el intercambio de sustancias entre el esferoide y HUVECs en...

El protocolo describe cómo diseñar una red vascular perfusable en un esferoide. Microambiente circundante del esferoide es ideado para inducir angiogénesis y conectarse el esferoide de los microcanales en un dispositivo de microfluidos. El método permite la perfusión de la esferoide, que es una técnica largamente esperada en cultivos tridimensionales.

Perfusable Red Vascular con un modelo de tejido en un dispositivo de microfluidos

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the ...

El objetivo general de este procedimiento es utilizar una plataforma microfluídica para construir una red vascular perfusible en un agregado multicelular o esferoide. Este método puede ayudar a abordar preguntas clave en la forma alternativa de los campos de la medicina regenerativa, como la importancia de una red vascular en modelos de tejido in vivo e in vitro. La principal ventaja de esta técnica es que la vía de administración de fármacos y suplementos puede simularse in vitro mediante la administración de regiones de interés directamente en los esferoides.Generalmente, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la dificultad de introducir las células en el área objetivo en el dispositivo microfluídico. Después de fundir el prepolímero PDMS, desgasifique el material en una cámara de vacío durante dos horas, seguido de un curado nocturno a 80 grados centígrados en un horno con ventilación de aire. A la mañana siguiente, retire el PDMS de la oblea de silicio y use un perforador de dos milímetros de diámetro para crear agujeros en el material en las posiciones indicadas.Use un punzón de un milímetro de diámetro para crear el pozo de esferoide y use cinta adhesiva para limpiar la losa de PDMS y un cubreobjetos de vidrio de 24 por 24 milímetros. Trate la losa limpia con plasma de aire durante 40 segundos y pegue la losa de PDMS en el cubreobjetos. Luego, cure el PDMS a 80 grados centígrados durante al menos 12 horas.Dos o tres días antes de sembrar el dispositivo microfluídico, agregue tres veces 10 al quinto hLF, RFP-HUVEC y GFP-HUVIC recién descongelados a 10 mililitros de medio endotelial fresco en una placa de 10 milímetros. Cuando los hLFs y los RFP-HUVECs alcancen la subconfluencia, suspender los hLFs y los RFP-HUVECs en el medio endotelial hasta concentraciones finales a 1,0 veces 10 a la quinta y 2,5 veces 10 a la cuarta celda por milímetro, respectivamente. Después de dos días en cultivo en suspensión, en un gabinete de bioseguridad, agregue una gota de 99 microlitros de solución de mezcla maestra recién preparada en el centro de una placa de Petri de 35 milímetros sobre hielo.Para cargar el dispositivo microfluídico, utilice una punta de micropipeta modificada de 100 microlitros para transferir un esferoide y 100 microlitros de medio a una segunda placa de Petri a temperatura ambiente. A continuación, aspire el esferoide en una cantidad mínima de medio y gire la pipeta en posición vertical para que el esferoide se mueva hacia el fondo de la punta de la pipeta por gravedad. Toque la punta de la pipeta con el menisco de la gota de mezcla maestra para expulsar el esferoide a la solución sin presionar el émbolo de la pipeta.A continuación, agregue rápidamente un microlitro de trombina recién preparada a la gota y mezcle suavemente la trombina con la solución. Con la pipeta ajustada a siete microlitros, transfiera lentamente el esferoide al pocillo de esferoide de la losa de PDMS. El paso más crítico del procedimiento es inyectar el esferoide con suficiente gel para permitir que el esferoide se asiente en la parte inferior del dispositivo.Después de la carga, retire la punta de la pipeta con cuidado para evitar fugas entre los micropostes. Incuba el esferoide a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Cuando la fibrina se haya solidificado, inyecte lentamente de 20 a 30 microlitros de medio endotelial en los orificios uno A y tres A para cargar los canales uno y tres, respectivamente.A continuación, transfiera el dispositivo a una toallita húmeda de laboratorio en un plato de 100 milímetros e incube el dispositivo a 37 grados centígrados y 5% de CO2 durante 24 horas para facilitar la eliminación de cualquier burbuja en la interfaz entre el medio y la fibrina. Al día siguiente, agregue dos mililitros de tripsina-EDTA al 0,05% a los GFP-HUVIC subconfluentes y detenga la reacción de tripsina con cuatro mililitros de medio completo cuando las células se hayan desprendido por completo. Recoja las células endoteliales por centrifugación y vuelva a suspender el pellet en medio endotelial fresco a una concentración de cinco veces 10 a la sexta célula por mililitro.A continuación, inyecte 20 microlitros de HUVEC en el orificio uno B para cargar el canal uno, y coloque el dispositivo a 37 grados centígrados durante 30 minutos, inclinado en un ángulo de 90 grados para asegurarse de que los HUVC se adhieran a la fibrina en el canal dos. Después de cargar el canal tres de la misma manera, coloque el dispositivo en un nuevo plato de 100 milímetros que contenga una toallita de laboratorio húmeda en la incubadora de cultivos celulares durante siete a 14 días, reemplazando la mitad del medio en los canales uno y tres diariamente. Estas imágenes representativas tomadas en el día cero de la carga de HUVEC muestran el gel de fibrina cargado solo en el canal dos, sin ninguna fuga en los canales uno o tres y con los HUVEC adheridos con éxito a la pared lateral del gel de fibrina.También se puede observar que el esferoide está correctamente asentado en la parte inferior del dispositivo. Los brotes angiogénicos se observan a partir del primer día, con el brote más largo alcanzando el esferoide en el tercer día en este experimento, y con la mayoría de los brotes angiogénicos alcanzando el esferoide en el séptimo día. De manera óptima, después de cuatro días en el dispositivo, se puede observar el flujo a través de los lúmenes vasculares con el ángulo vascular definido como la dirección de la punta vascular y el centro del esferoide desde la raíz vascular.Los ángulos vasculares disminuyen de manera dependiente del tiempo, lo que indica la migración de los brotes angiogénicos hacia el esferoide. Las RFP y GFP-HUVEC pueden formar coordinadamente una sola luz vascular, lo que indica claramente cómo los brotes angiogénicos de los canales uno y tres se anastomosan a las RFP-HUVEC en el esferoide para formar una red vascular continua. Además, el FITC-dextrano inyectado en el canal uno fluye hacia la red vascular construida y el interior del esferoide, llegando finalmente al canal tres, lo que implica que la red vascular integrada podría suministrar nutrientes y eliminar los productos de desecho del esferoide.Tras su desarrollo, esta técnica abrió el camino para que los investigadores del campo de la electricidad orgánica exploraran la eficacia de fármacos o suplementos de interés en modelos de tejido in vitro.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

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