Perfusable Red Vascular con un modelo de tejido en un dispositivo de microfluidos

El objetivo general de este procedimiento es utilizar una plataforma microfluídica para construir una red vascular perfusible en un agregado multicelular o esferoide. Este método puede ayudar a abordar preguntas clave en la forma alternativa de los campos de la medicina regenerativa, como la importancia de una red vascular en modelos de tejido in vivo e in vitro. La principal ventaja de esta técnica es que la vía de administración de fármacos y suplementos puede simularse in vitro mediante la administración de regiones de interés directamente en los esferoides.

Generalmente, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la dificultad de introducir las células en el área objetivo en el dispositivo microfluídico. Después de fundir el prepolímero PDMS, desgasifique el material en una cámara de vacío durante dos horas, seguido de un curado nocturno a 80 grados centígrados en un horno con ventilación de aire. A la mañana siguiente, retire el PDMS de la oblea de silicio y use un perforador de dos milímetros de diámetro para crear agujeros en el material en las posiciones indicadas.

Use un punzón de un milímetro de diámetro para crear el pozo de esferoide y use cinta adhesiva para limpiar la losa de PDMS y un cubreobjetos de vidrio de 24 por 24 milímetros. Trate la losa limpia con plasma de aire durante 40 segundos y pegue la losa de PDMS en el cubreobjetos. Luego, cure el PDMS a 80 grados centígrados durante al menos 12 horas.

Dos o tres días antes de sembrar el dispositivo microfluídico, agregue tres veces 10 al quinto hLF, RFP-HUVEC y GFP-HUVIC recién descongelados a 10 mililitros de medio endotelial fresco en una placa de 10 milímetros. Cuando los hLFs y los RFP-HUVECs alcancen la subconfluencia, suspender los hLFs y los RFP-HUVECs en el medio endotelial hasta concentraciones finales a 1,0 veces 10 a la quinta y 2,5 veces 10 a la cuarta celda por milímetro, respectivamente. Después de dos días en cultivo en suspensión, en un gabinete de bioseguridad, agregue una gota de 99 microlitros de solución de mezcla maestra recién preparada en el centro de una placa de Petri de 35 milímetros sobre hielo.

Para cargar el dispositivo microfluídico, utilice una punta de micropipeta modificada de 100 microlitros para transferir un esferoide y 100 microlitros de medio a una segunda placa de Petri a temperatura ambiente. A continuación, aspire el esferoide en una cantidad mínima de medio y gire la pipeta en posición vertical para que el esferoide se mueva hacia el fondo de la punta de la pipeta por gravedad. Toque la punta de la pipeta con el menisco de la gota de mezcla maestra para expulsar el esferoide a la solución sin presionar el émbolo de la pipeta.

A continuación, agregue rápidamente un microlitro de trombina recién preparada a la gota y mezcle suavemente la trombina con la solución. Con la pipeta ajustada a siete microlitros, transfiera lentamente el esferoide al pocillo de esferoide de la losa de PDMS. El paso más crítico del procedimiento es inyectar el esferoide con suficiente gel para permitir que el esferoide se asiente en la parte inferior del dispositivo.

Después de la carga, retire la punta de la pipeta con cuidado para evitar fugas entre los micropostes. Incuba el esferoide a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Cuando la fibrina se haya solidificado, inyecte lentamente de 20 a 30 microlitros de medio endotelial en los orificios uno A y tres A para cargar los canales uno y tres, respectivamente.

A continuación, transfiera el dispositivo a una toallita húmeda de laboratorio en un plato de 100 milímetros e incube el dispositivo a 37 grados centígrados y 5% de CO2 durante 24 horas para facilitar la eliminación de cualquier burbuja en la interfaz entre el medio y la fibrina. Al día siguiente, agregue dos mililitros de tripsina-EDTA al 0,05% a los GFP-HUVIC subconfluentes y detenga la reacción de tripsina con cuatro mililitros de medio completo cuando las células se hayan desprendido por completo. Recoja las células endoteliales por centrifugación y vuelva a suspender el pellet en medio endotelial fresco a una concentración de cinco veces 10 a la sexta célula por mililitro.

A continuación, inyecte 20 microlitros de HUVEC en el orificio uno B para cargar el canal uno, y coloque el dispositivo a 37 grados centígrados durante 30 minutos, inclinado en un ángulo de 90 grados para asegurarse de que los HUVC se adhieran a la fibrina en el canal dos. Después de cargar el canal tres de la misma manera, coloque el dispositivo en un nuevo plato de 100 milímetros que contenga una toallita de laboratorio húmeda en la incubadora de cultivos celulares durante siete a 14 días, reemplazando la mitad del medio en los canales uno y tres diariamente. Estas imágenes representativas tomadas en el día cero de la carga de HUVEC muestran el gel de fibrina cargado solo en el canal dos, sin ninguna fuga en los canales uno o tres y con los HUVEC adheridos con éxito a la pared lateral del gel de fibrina.

También se puede observar que el esferoide está correctamente asentado en la parte inferior del dispositivo. Los brotes angiogénicos se observan a partir del primer día, con el brote más largo alcanzando el esferoide en el tercer día en este experimento, y con la mayoría de los brotes angiogénicos alcanzando el esferoide en el séptimo día. De manera óptima, después de cuatro días en el dispositivo, se puede observar el flujo a través de los lúmenes vasculares con el ángulo vascular definido como la dirección de la punta vascular y el centro del esferoide desde la raíz vascular.

Los ángulos vasculares disminuyen de manera dependiente del tiempo, lo que indica la migración de los brotes angiogénicos hacia el esferoide. Las RFP y GFP-HUVEC pueden formar coordinadamente una sola luz vascular, lo que indica claramente cómo los brotes angiogénicos de los canales uno y tres se anastomosan a las RFP-HUVEC en el esferoide para formar una red vascular continua. Además, el FITC-dextrano inyectado en el canal uno fluye hacia la red vascular construida y el interior del esferoide, llegando finalmente al canal tres, lo que implica que la red vascular integrada podría suministrar nutrientes y eliminar los productos de desecho del esferoide.

Tras su desarrollo, esta técnica abrió el camino para que los investigadores del campo de la electricidad orgánica exploraran la eficacia de fármacos o suplementos de interés en modelos de tejido in vitro.