Inclusión en parafina y finas secciones de Biofilms microbianos Colonia para el análisis microscópico

El objetivo general de este procedimiento es generar secciones de biopelícula incluidas en parafina que puedan usarse para evaluar la distribución de la expresión génica según lo informado por la producción de proteínas fluorescentes dentro de morfologías nativas intactas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el estudio de las comunidades microbianas, como la expresión de genes específicos en la producción de sustancias exopoliméricas distribuidas en el contexto de la arquitectura de biopelículas nativas. La principal ventaja de esta técnica es que permite el análisis de la expresión génica dentro de la morfología preservada de las secciones transversales de la biopelícula, al tiempo que es susceptible de tratamientos posteriores, como la tinción de características distintivas y la obtención de imágenes de alta resolución, como la microscopía confocal o electrónica.

Después de preparar la solución de triptona de agar de acuerdo con el protocolo de texto, use un tubo cónico de 50 mililitros para verter 45 mililitros de la solución en un plato cuadrado de 100 milímetros por 100 milímetros. Deje que el agar se solidifique durante aproximadamente 20 a 30 minutos. Vierta una segunda capa de 15 milímetros encima de la primera capa, luego deje que se solidifique durante la noche y, si es necesario, use un pañuelo sin pelusa para eliminar la condensación de los párpados.

A continuación, para detectar biopelículas de colonias, después de cultivar una sola colonia aislada de P. Aeruginosa a partir de un stock congelado de acuerdo con el protocolo de texto, pipetee de 2,5 a 10 microlitros de suspensión celular en una placa mediana de dos capas. Las colonias pueden incubarse en la oscuridad a 25 grados centígrados con una humedad relativa del 80 al 100% durante un máximo de cuatro días. Vierta suavemente 15 mililitros de la solución de agar sobre el medio de crecimiento y la colonia y deje que el agar forme un gel a temperatura ambiente durante cinco minutos.

Luego, use una hoja de afeitar afilada para cortar un mandril cuadrado de tres capas con la colonia laminada entre las dos capas superiores. Si prepara varias muestras, asegúrese de que cada mandril esté cortado a un tamaño comparable. Retire suavemente cualquier exceso de agar de la colonia que contiene el mandril.

Luego, humedezca la cabeza plana de una espátula en PBS o agua e insértela suavemente entre las capas superior e inferior de agar. Transfiera inmediatamente la colonia laminada a un casete de inclusión etiquetado con un rotulador resistente a los productos químicos. Coloque el casete de inclusión en un sobre de portaobjetos de vidrio que contenga el fijador previamente preparado.

Procese las muestras. Use 1X PBS para lavarlos dos veces durante una hora cada uno. Para obtener los mejores resultados, automatice la homogeneización de reactivos utilizando el ajuste bajo de la función de centrifugado de un procesador automático de tejidos.

Para incrustar las muestras, llene un molde de cera con cera de parafina fundida calentada a 55 grados centígrados, luego use una espátula plana calentada para transferir rápidamente el mandril infiltrado del casete de inclusión al molde de cera asegurándose de que el mandril descanse paralelo a la base del molde. Deje que la cera se solidifique durante la noche a cuatro grados centígrados. Las muestras moldeadas en cera sólida pueden almacenarse indefinidamente a esta temperatura.

Una vez que la cera se haya solidificado, extirpe la muestra del molde y use una cuchilla de afeitar para recortar el exceso de cera alrededor de la muestra. Deje un poco de cera que se extienda desde un extremo de la muestra que se pueda usar para sujetarla en el micrótomo. Es importante recortar la muestra incrustada en cera de manera que su forma facilite la recolección de cintas lineales lisas.

Pequeñas imperfecciones en el recorte pueden producir artefactos en la cinta y comprometer la integridad de la sección. A continuación, calienta un baño de agua a 42 grados centígrados. A continuación, sujete la muestra en el micrótomo con la superficie de la colonia orientada perpendicularmente al borde de la hoja.

Recorte la muestra en intervalos de 50 micrómetros hasta que se haya alcanzado el plano deseado de la colonia, a partir del cual se recogerán secciones utilizando un micrótomo ajustado a una velocidad de corte de 75 a 80 RPM y un ángulo de despeje de seis a 10 grados. Corta una cinta del número deseado de secciones de 10 micrómetros de grosor. Luego, usa un pincel de punta fina para separar la cinta de la hoja.

Ahora, con pinzas o una gota de agua en la punta de una pipeta Pasteur, transfiera suavemente la cinta al baño de agua. Inserte inmediatamente un portaobjetos en el baño de agua y colóquelo debajo de la cinta en un ángulo de 45 grados. Toque el borde estrecho de la cinta con la diapositiva justo debajo de la etiqueta esmerilada.

La cinta debe adherirse. Tire del portaobjetos fuera del baño de agua y ajuste el ángulo para que sea perpendicular a la superficie del agua, permitiendo que la cinta quede plana contra el tobogán a lo largo de su longitud. Evite atrapar el exceso de agua debajo de la cinta.

Coloque suavemente el portaobjetos sobre un pañuelo absorbente sin pelusa que absorba el exceso de agua de la sección. Luego, coloque el portaobjetos sobre una toalla de papel y déjelo secar en la oscuridad a temperatura ambiente durante la noche. Caliente una placa calefactora nivelada a 45 grados centígrados y coloque la corredera en la placa durante 30 a 60 minutos.

La cera se volverá semifundida y se aplanará contra el portaobjetos. Levante suavemente el portaobjetos de la placa calefactora y colóquelo plano sobre una superficie lisa y nivelada a temperatura ambiente durante aproximadamente un minuto hasta que la cera se solidifique. Asegúrese de que la cera fundida no se desplace hacia ninguno de los lados del portaobjetos.

Con las muestras dentro de un sobre de portaobjetos de vidrio, desparafina los portaobjetos en cuatro lavados con agente limpiador durante cinco minutos cada uno. Use un aspirador Buchner para eliminar la solución entre lavados. Use etanol 100% para lavar los portaobjetos tres veces durante un minuto cada una.

Luego, después de rehidratar las diapositivas de acuerdo con el protocolo de texto, monte inmediatamente las secciones en un medio de montaje con tampón tris y aplique un cubreobjetos. El agar de superposición alrededor de la sección no reacciona con el fijador, por lo que no se adhiere al portaobjetos de acelga. Este agar puede desprenderse durante la rehidratación y dañar la sección, por lo que se debe tener cuidado de no agitar la solución durante la rehidratación.

Deje que el medio de montaje se polimerice a temperatura ambiente durante la noche. Una vez polimerizado, use esmalte de uñas transparente para sellar el cubreobjetos al portaobjetos. Finalmente, guarde los portaobjetos sellados indefinidamente en la oscuridad a cuatro grados centígrados.

Mientras que las imágenes DIC que utilizan un objetivo de inmersión en aceite 40 veces pueden ser suficientes para mostrar algunas características morfológicas de las secciones delgadas de la biopelícula, la microscopía de fluorescencia de cepas diseñadas para expresar constitutivamente proteínas fluorescentes proporciona una visualización mejorada de la distribución celular dentro de las muestras. Como se muestra en estos paneles, las imágenes de secciones individuales se pueden unir para generar una sección transversal de toda la colonia y proporciona contexto para la localización de características estructurales dentro de la morfología general a nivel macroscópico. El uso de una cepa diseñada para expresar una proteína fluorescente bajo el control de un promotor específico permite la visualización de la distribución de la expresión génica.

Además, las colonias pueden cultivarse en un medio que contenga colorantes, o se pueden añadir colorantes después del corte a los polisacáridos específicos de las manchas. Finalmente, las muestras también se pueden preparar y obtener imágenes a mayor resolución utilizando microscopía electrónica de transmisión, como se presenta aquí. Al intentar este procedimiento, es importante tener en cuenta la agilidad de las muestras y la posibilidad de introducir artefactos fluorescentes y estructurales, ya sea mediante fijación, seccionamiento o rehidratación, que pueden influir en la interpretación de los datos.

Este procedimiento permite un análisis cuantitativo de imágenes, como la correlación de los perfiles de expresión de los reporteros fluorescentes con las características morfológicas y el eje Z de una biopelícula. Este protocolo se puede aplicar a diversas especies de microbios formadores de biopelículas con importancia médica e industrial como Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae y Bacillus subtilis. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cultivar y preparar biopelículas de colonias para seccionar mediante inclusión en parafina.