Name: Inclusión en parafina y finas secciones de Biofilms microbianos Colonia para el análisis microscópico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Aprende a incluir biofilms microbianos en parafina y obtener secciones finas para análisis microscópico. Este método permite visualizar patrones de expresión génica preservando la morfología nativa de las colonias bacterianas.

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Este trabajo fue apoyado por NSF carrera Premio 1553023 y Premio de NIH/NIAID R01AI103369.

1. crecimiento de aeruginosa de los Pseudomonas Biofilms de Colonia
<ol><li>Preparación de placas de medio-bicapa<ol>
<li>Preparar un 10 G/l triptona, agar 10 g/L solución (véase Tabla de materiales) en agua desionizada.</li>
		<li>Autoclave durante 20 min enfriar a 50-60 ° C en un baño de agua.</li>
		<li>45 mL de la solución de agar triptona vierta un plato cuadrado de 100 x 100 mm (véase Tabla de materiales) utilizando un tubo cónico de 50 mL. Permitir que el agar se solidifique (~ 20-30 min). Verter una segunda capa de 15 mL encima la primera capa. Dejar solidificar durante la noche, eliminación de condensación de tapas si es necesario frotándola con un paño libre de pelusas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Avistamiento de Colonia Biofilms<ol>
<li>Las cepas de interés de la raya de las existencias de congelador en LB agar placas13 e incubar en la oscuridad de 12-16 h a 37 ° C y 80-100% humedad relativa.</li>
		<li>Para cada cepa o repetición, utilice una sola Colonia para inocular 2 mL de LB e incubar en la oscuridad de 12-16 h a 37 ° C con agitación a 250 rpm.</li>
		<li>El de la cultura mediante la dilución 1: 100 en fresco LB y de incubación en la oscuridad de 2.5-3 h a 37 ° C con agitación a 250 rpm.</li>
		<li>Medir densidad óptica usando un espectrofotómetro y ajustar con LB estéril para lograr una suspensión con un OD500 nm de ~ 0,5.</li>
		<li>Dependiendo de la Colonia deseada tamaño, pipeta 2.5-10 μl de la suspensión celular en un plato mediano-bicapa (preparado en el paso 1.1) y permitir que el terreno se seque por 20 minutos dejando la tapa de petri abierta cerca de una llama abierta puede facilitar el secado.</li>
		<li>Incubar el punto colonias a 25 ° C y 80-100% humedad relativa, en la oscuridad hasta por 4 días.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparación de la solución fijadora
<ol><li>Preparar la solución fijadora en el día de la recolección de la muestra. Diluir el 37% de formaldehído (FA) en PBS 1 x a una concentración final de 4% FA. PRECAUCIÓN: FA es volátil y tóxico. Utilizar equipo de protección y trabajar en una campana bien ventilada.</li>
	<li>Inmediatamente antes del uso, disolver clorhidrato de L-lisina en el 4% FA, (preparada en el paso 2.1) a temperatura ambiente a una concentración final de 50 mM L-Lisina HCl.</li>
</ol>3. dirigir la aplicación de fijador a la biopelícula de Colonia [opcional]
Nota: Hemos encontrado que morfología de biofilm se conserva mejor cuando se añade el agar de recubrimiento antes de la fijación. Sin embargo, este paso constituye también un cambio en las condiciones ambientales que pueden afectar la expresión génica. Patrones de expresión de reportero fluorescente por lo tanto deben ser verificados mediante un protocolo separado en el que el paso de fijación se lleva a cabo antes de la adición de agar de recubrimiento, como se describe aquí.
<ol><li>En el día de la fijación y trabajar en una campana bien ventilada, pipetear el fijador preparado en el paso 2 directamente a la superficie del agar alrededor de la Colonia, lo que le permite llegar a la periferia de la Colonia sin sumergiéndola. Aplicar sólo como mucho fijador ya que para totalmente rodea la Colonia, aproximadamente 500 μl. permitir que el fijador difundir en la Colonia y el agar circundante.</li>
	<li>Una vez que el fijador ha sido completamente absorbido por la Colonia y los medios circundantes, aproximadamente 20-30 min, y FA residual ya no es visible en la placa, repita el paso 3.1. Permiten este fijador difundir en la Colonia y el agar circundante.</li>
	<li>Una vez que el fijador ha sido completamente absorbida por la Colonia y sus alrededores los medios repiten el paso 3.1, esta vez aplicando fijador a la superficie de la Colonia directamente. Permiten este fijador difundir en la Colonia y el agar circundante, proceder al paso 4 sólo después de todo fijador ha sido absorbida y ya no es visible en la placa.</li>
</ol>4. superposición colonias con Agar
<ol><li>En el día de la fijación, preparar un 10 g/L solución de agar en agua desionizada y autoclave de 10-20 minutos disolver. Enfriar en un baño de agua a 50 ° c.</li>
	<li>Suavemente verter 15 mL de la solución de agar al medio de cultivo y Colonia. Permitir que el agar para formar un gel a temperatura ambiente durante 5 minutos (figura 1B).</li>
	<li>Utilice una cuchilla de afeitar para cortar un plato cuadrado, 3 capas con la Colonia laminada entre las dos capas superiores. Si de preparación de muestras múltiples, asegúrese de que cada tirada es cortado a un tamaño comparable.</li>
	<li>Retire suavemente el exceso agar de la tirada que contiene la Colonia.</li>
	<li>Para levantar las dos capas superiores de agar (contiene la Colonia) de la capa inferior del mandril (figura 1), mojar la cabeza plana de 1 x PBS o agua una espátula e inserte suavemente entre las capas superior e inferior. La Colonia laminada debe separarse de la capa inferior. Tenga cuidado de no torcer o doblar la Colonia laminada cuando se levante de su base.</li>
</ol>5. fijación
<ol><li>Trabajar en una campana bien ventilada, transferir inmediatamente la Colonia laminada (es decir, mandril de 2 capas) en un cassette de inclusión (véase Tabla de materiales), marcado con un marcador resistente a productos químicos. Coloque el cassette de inclusión en un envío de diapositivas de vidrio (véase tabla de materiales) que contiene el fijador preparado en pasos 2.1-2.2. Asegúrese de que no hay burbujas de aire atrapadas en el interior del cassette de inclusión.</li>
	<li>Incubar la muestra en el fijador durante la noche en la oscuridad a temperatura ambiente.</li>
</ol>6. muestra proceso: Tampón de lavado, deshidratación, claro y la infiltración
<ol><li>Después de la fijación durante la noche, lave la muestra dos veces en PBS 1 x durante 1 hora. Para mejores resultados, automatizar la homogeneización de reactivo usando la función de un procesador de tejidos automático (véase tabla de materiales) establece en un ajuste bajo. Si no se dispone de ningún procesador, procesamiento se puede ejecutar manualmente.</li>
	<li>Siga el lavado Tampón por deshidratación a través de una serie gradual de etanol (EtOH) diluciones en PBS 1 x (25%, 50%, 70%, 95%) durante 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Deshidratar en tres lavados de 100% EtOH durante 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Claro la muestra deshidratada en tres lavados de agente naranja claro a base de aceite de 100% (véase tabla de materiales) por 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Infiltra la muestra limpia dos veces con parafina fundida la cera (véase Tabla de materiales), se calienta a 55˚C, por 2 h.</li>
</ol>7. muestra incrustación
<ol><li>Llenar un molde de cera con cera de parafina fundida calentada a 55 ° c. Use una espátula caliente, plana para transferir rápidamente el mandril infiltrado del cassette de inclusión en el molde de cera, asegurando que el mandril apoya paralelo a la base del molde. Evite aplicar presión excesiva sobre el mandril. Moldes de cera pueden ser 3D personalizado impreso, o están disponibles en el mercado (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Permita que la cera solidifique durante la noche a 4 ° c. Muestras moldeadas en cera sólida pueden ser almacenadas indefinidamente a 4 ° c.</li>
	<li>Una vez que la cera se ha solidificado, suprimir la muestra del molde y recorte el exceso cera de alrededor de la muestra con una cuchilla de afeitar. Deja la cera sobrante que se extiende desde un extremo de la muestra, paralelo al plano de corte, que puede utilizarse para fijar en el micrótomo (véase Tabla de materiales). También deja una envoltura de cera y aproximadamente 1 mm de espesor, alrededor de la muestra y lisa de sus caras.</li>
</ol>8. seccionamiento
<ol><li>Un baño de agua a 42 ° c de calor. La muestra de la abrazadera en el micrótomo con la superficie de la Colonia orientada perpendicular al borde de la hoja (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Cortar la muestra en intervalos de 50 μm hasta alcanzar el plano deseado de la Colonia, de la que se recogerán las secciones.</li>
	<li>Corte una cinta del número de secciones de 10 μm espesor utilizando un micrótomo a un velocidad de seccionamiento de 75-80 rpm y un ángulo de separación de 6-10 °. Utilizar un pincel de punta fina para separar la cinta de la hoja.</li>
	<li>Utilizando una gota de agua en la punta de una pipeta de Pasteur (preferido) o fórceps, transferir suavemente la cinta para el baño de agua. Tenga cuidado para evitar burbujas de aire captura bajo la sección.</li>
	<li>Inmediatamente insertar una diapositiva en el baño de agua y colocarlo debajo de la cinta en un ángulo de 45 °.</li>
	<li>Toque el borde estrecho de la cinta a la corredera, justo debajo de la etiqueta del helado. La cinta debe adherirse.</li>
	<li>Tire de la corredera en el baño de agua, ajustar el ángulo a ser perpendicular a la superficie del agua y permitir que la cinta en posición plana contra la corredera a lo largo de su longitud. Evite atrapar el exceso de agua debajo de la cinta.</li>
	<li>Soporte suavemente el portaobjetos sobre un absorbente pelusa, absorbe exceso de agua de la sección.</li>
	<li>Coloque el portaobjetos sobre una toalla de papel y deje que se seque a temperatura ambiente durante la noche en la oscuridad. Diapositivas pueden almacenarse indefinidamente a 4 ° c en la oscuridad.</li>
</ol>9. fijación de calor, rehidratación y montaje
<ol><li>Una placa caliente nivelada a 45 ° c de calor. Caliente la diapositiva durante 30-60 minutos. La cera será convertido en semi fundida y aplanar contra la corredera.</li>
	<li>Suavemente Levante la diapositiva de la placa y colóquela plana en una superficie lisa, nivelada, temperatura ambiente, usando cuidado para asegurar que la cera fundida no tira a ambos lados de la corredera, hasta que la cera solidifica (~ 1 min).</li>
	<li>Mediante un envío de diapositivas de vidrio, cera de diapositivas en cuatro lavados de claro agente de 5 minutos cada uno, utilizando un aspirador de Büchner para eliminar la solución entre lavados.</li>
	<li>Lavar los portaobjetos tres veces en el 100% EtOH durante 1 minuto.</li>
	<li>Rehidratar las diapositivas de una serie gradual de etanol en el orden inverso de la transformación (95%, 70%, 50% y 25%) durante 1 minuto que cada uno seguido por dos lavados de 1 min en PBS 1 x.</li>
	<li>Inmediatamente montar las secciones en un medio de montaje con tampón Tris (véase Tabla de materiales) y aplica un cubreobjetos, evitando la introducción de burbujas de aire. Permitir que el medio de montaje polimerizar durante la noche a temperatura ambiente.</li>
	<li>Una vez polimerizado, sellar el cubreobjetos a la diapositiva usando esmalte de uñas claro. Diapositivas de sellado pueden conservarse indefinidamente en la oscuridad a 4 ° c.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Muestras de inclusión en parafina y secciones delgadas del tejido es una técnica histológica clásica que permite proyección de imagen de estructuras morfológicas micro se usa comúnmente en los tejidos eucarióticos y se ha aplicado con cierto éxito a muestras microbianas8 ,9. Mientras que crioinclusiones permite la fuerte retención de señal endógena e inmunofluorescente, inclusión en parafina es generalmente preferible ya que proporciona mejor preservación de la ...

La mayoría de microbios tienen la capacidad para forma biofilms, comunidades de células ligan por matrices de producción propia. Biofilms se puede cultivar en muchos tipos de configuraciones físicas, con diversos regímenes de suministro de nutrientes y sustrato. Ensayos específicos para la formación del biofilm tienden a producir estructuras multicelulares reproducibles, y arquitecturas comunes se observan especies filogenéticamente diversas a nivel macroscópico o comunidad. Cuando microbios crecen como colonias en medio sólido bajo una atmósfera, morfología macroscópica transmite información sobre la capacidad de producción de la matriz y a menudo se correlaciona con otros rasgos 1,2,3. La arquitectura interna de las colonias microbianas también puede proporcionar pistas sobre biofilm específica química y fisiología, pero ha sido difícil de caracterizar. Recientes aplicaciones de las técnicas de crioinclusiones y cryosectioning a colonias bacterianas han permitido la proyección de imagen y visualización de características específicas en la resolución sin precedentes 4,5,6. Sin embargo, estudios con tejidos animales han demostrado que inclusión en parafina proporciona superior conservación de la morfología comparada con crioinclusiones 7 y se ha utilizado para visualizar las bacterias en los tejidos 8,9. Por lo tanto hemos desarrollado un protocolo para la fijación, inclusión en parafina y finas secciones de biofilms microbianos de la Colonia. Aquí, describimos la preparación de secciones delgadas 10,11de Pseudomonas aeruginosa PA14 Colonia-biofilm, pero también con éxito hemos aplicado esta técnica a biofilms formados por las bacterias Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis, y Vibrio cholerae12.
El proceso de inclusión en parafina y secciones delgadas de biopelículas sigue una simple lógica. En primer lugar, los biofilms están contenidos en una capa de agar para preservar la morfología durante el proceso. En segundo lugar, los biofilms encajonadas son sumergidos en un fijador para macromoléculas de la reticulación y preservar micromorfología. Estos son luego deshidratados con alcohol, limpiados con un solvente más polar y luego infiltrados con cera de parafina líquida. Una vez infiltrado, las muestras están incrustadas en bloques de cera para seccionamiento. Las secciones son corte montadas en portaobjetos y luego rehidratadas para volver a un estado más nativo. Desde este punto, pueden ser manchadas o cubiertas de medio de montaje para el análisis microscópico.
Este protocolo produce finas secciones de biofilms microbianos adecuados para análisis histológico. Subestructuras de biofilm de Colonia son accesibles cuando secciones delgadas preparadas utilizando este método son imágenes por microscopia ligera. Biofilms también puede ser crecidos en las manchas fluorescentes que contienen los medios de comunicación específicos para características individuales o manchados en la etapa de rehidratación, inmediatamente antes del montaje (pasos 9.5 9.6). Por último, microbios pueden ser diseñados para producir proteínas fluorescentes de manera constitutiva o regulada, lo que en situ informes de expresión de la distribución o gen de la célula dentro de estas comunidades. Hemos utilizado estos métodos para determinar la profundidad de biofilm de Colonia, distribución celular, distribución de la matriz, patrones de crecimiento y expresión génica espaciotemporal.

<table><tbody><tr><td>Pipeta Pasteur de 5 3/4"</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6A</td><td>Comprada en univeristy biostores&nbsp;</td></tr><tr><td>Agar &nbsp;</td><td>Teknova&nbsp;</td><td>A7777</td><td></td></tr><tr><td>Matraz de aspirador Buchner (vacío)&nbsp;</td><td>Pyrex</td><td>5340</td><td>Comprado en biotiendas universitarias&nbsp;</td></tr><tr><td>Rotulador resistente a los productos químicos</td><td>VWR</td><td>103051-182</td><td>Fabricante: Leica</td></tr><tr><td>Clear Nail Polish&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Comprado en la tienda</td></tr><tr><td>Congo Red Indicador Grado VWR</td><td></td><td>AAAB24310-14</td><td>Fabricante: Alfa Aesar</td></tr><tr><td>Coomassie Blue&nbsp;</td><td>VWR</td><td>EM-3340</td><td>Fabricante: EMD Millipore</td></tr><tr><td>TRIS Buffered Mounting Medium (w/ DAPI)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>50 247 04</td><td>Fabricante: Electron Microscopy Sciences</td></tr><tr><td>Embedding Mold&nbsp;</td><td></td><td></td> Molde de incrustación <td>interno impreso en 3D</td></tr><tr><td>(comercial)&nbsp;</td><td>Ciencias de la microscopía electrónica</td><td>70182</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 200P</td><td>Decon Labs, Inc.&nbsp;</td><td>2701</td><td>Comprado en biostores universitarios&nbsp;</td></tr><tr><td>Pincel de punta fina comprado</td><td></td><td></td><td>en la tienda, pincel</td></tr><tr><td>Glass Coverslips 60x22mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-519-21C</td><td></td></tr><tr><td>Glass Rehydration Mailer&nbsp;</td><td>Ted Pella</td><td>21043</td><td>20 sobres de diapositivas&nbsp;</td></tr><tr><td>Histoclear-II, agente limpiador a base de aceite de naranja&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>50 899 90150</td><td>Fabricante: National Diagnostics&nbsp;</td></tr><tr><td>Histosette, casete de incrustación</td><td>Fisher Scientific</td><td>15 182 701A</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de L-lisina&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP386 100</td><td></td></tr><tr><td>Hojas de micrótomo de perfil bajo</td><td>Fisher Scientific</td><td>22 210 048</td><td>Fabricante: Sturkey&nbsp;</td></tr><tr><td>Micropipeta&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89080-004</td><td>Promo-pack</td></tr><tr><td>Puntas de micropipeta&nbsp;</td><td>Véase la sección</td> de <td>comentarios Véase la sección de comentarios</td><td>p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486)</td></tr><tr><td>Microtomo&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>905200U/00016050</td><td>Modelo: HM355S, Fabricante: Microm, SIN CATÁLOGO, Catálogo del proveedor # 905200U/00016050</td></tr><tr><td>formaldehído, 37% acuoso (formal)</td><td>Ricca Chemical</td><td>RSOF0010-500A</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast Xtra (cera de parafina)</td><td>VWR</td><td>15159-486</td><td>Fabricante: McCormick Scientific&nbsp;</td></tr><tr><td>Placas de Petri Cuadradas 100x100x15mm</td><td>Productos Desechables de Laboratorio&nbsp;</td><td>D210-16</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio&nbsp;</td><td>Productos químicos EMD&nbsp;</td><td>PX1405-1</td><td>Componente de solución salina tamponada con fosfato, preparado internamente&nbsp;</td></tr><tr><td>Fosfato de potasio&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P380-500</td><td>Componente de solución salina tamponada con fosfato, preparado internamente&nbsp;</td></tr><tr><td>Hojas de afeitar &nbsp;</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>Comprado en biostores universitarios&nbsp;</td></tr><tr><td>Calentador de diapositivas&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0865259</td><td>NO CATÁLOGO, Catálogo de proveedores # 12857D</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio&nbsp;</td><td>VWR</td><td>0241-1KG</td><td>Componente de solución salina tamponada con fosfato, preparado internamente&nbsp;</td></tr><tr><td>Fosfato de sodio&nbsp;</td><td>VWR</td><td>BDH9296.500,Componente</td> <td>de solución salina tamponada con fosfato, preparado internamente&nbsp;</td></tr><tr><td>Portaobjetos de histología Suprafrost&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua con flotación de tejidos&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>NC0815797 Fabricante: Ted Pella, Catálogo de proveedores # 28156-B</td></tr><tr><td>Procesador automático de tejidos&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>813160U/Q#00009061</td><td>Modelo: STP120 Procesador de tejidos</td></tr><tr><td>Tryptone&nbsp;</td><td>Teknova&nbsp;</td><td>T9012</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Teknova&nbsp;</td><td>Y9010</td><td></td></tr></tbody></table>

inclusión en parafina y finas secciones de biofilms microbianos colonia para el análisis microscópico

Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis

Seccionamiento mediante inclusión en parafina es una técnica ampliamente establecida en sistemas eucarióticos. Aquí proporcionamos un método para la fijación, inclusión y secciones de biofilms intacto Colonia microbiana utilizando parafina perfundido. Para adaptar este método para el uso en Colonia biofilms, desarrollado técnicas para mantener cada muestra en su sustrato de crecimiento y laminar con un overlayer de agar y lisina ha añadido a la solución fijadora. Estas optimizaciones mejoran la retención de la muestra y la preservación de Características micromorfológicas. Muestras preparadas de esta manera son susceptibles de fino corte y proyección de imagen por microscopía de luz, fluorescencia y transmisión. Hemos aplicado esta técnica a biopelículas de la colonia de Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilisy Vibrio cholerae. El alto nivel de detalle visible en las muestras generadas por este método, combinado con cepa reportero ingeniería o el uso de colorantes específicos, puede proporcionar ideas interesantes sobre la fisiología y el desarrollo de las comunidades microbianas.

Este método genera biofilm delgada-secciones en donde distintas características morfológicas y las zonas de la expresión génica pueden ser reflejadas por DIC, microscopía de fluorescencia y TEM. Mientras que la proyección de imagen DIC utilizando un 40 X objetivo de inmersión de aceite puede ser suficiente para mostrar algunos rasgos morfológicos (Figura 2E), hemos encontrado que la fluorescencia microscopía de variedades dirigido a proteína constitutivamente...

Describimos a fijación, inclusión en parafina y finas técnicas seccionamiento de biofilms microbianos de la Colonia. En muestras preparadas, patrones de expresión de subestructura y reportero de biofilm pueden visualizarse por microscopía.

Inclusión en parafina y finas secciones de Biofilms microbianos Colonia para el análisis microscópico

Sectioning via paraffin embedding is a broadly established technique in eukaryotic systems. Here we provide a method for the fixation, embedding, and ...

El objetivo general de este procedimiento es generar secciones de biopelícula incluidas en parafina que puedan usarse para evaluar la distribución de la expresión génica según lo informado por la producción de proteínas fluorescentes dentro de morfologías nativas intactas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el estudio de las comunidades microbianas, como la expresión de genes específicos en la producción de sustancias exopoliméricas distribuidas en el contexto de la arquitectura de biopelículas nativas. La principal ventaja de esta técnica es que permite el análisis de la expresión génica dentro de la morfología preservada de las secciones transversales de la biopelícula, al tiempo que es susceptible de tratamientos posteriores, como la tinción de características distintivas y la obtención de imágenes de alta resolución, como la microscopía confocal o electrónica.Después de preparar la solución de triptona de agar de acuerdo con el protocolo de texto, use un tubo cónico de 50 mililitros para verter 45 mililitros de la solución en un plato cuadrado de 100 milímetros por 100 milímetros. Deje que el agar se solidifique durante aproximadamente 20 a 30 minutos. Vierta una segunda capa de 15 milímetros encima de la primera capa, luego deje que se solidifique durante la noche y, si es necesario, use un pañuelo sin pelusa para eliminar la condensación de los párpados.A continuación, para detectar biopelículas de colonias, después de cultivar una sola colonia aislada de P. Aeruginosa a partir de un stock congelado de acuerdo con el protocolo de texto, pipetee de 2,5 a 10 microlitros de suspensión celular en una placa mediana de dos capas. Las colonias pueden incubarse en la oscuridad a 25 grados centígrados con una humedad relativa del 80 al 100% durante un máximo de cuatro días. Vierta suavemente 15 mililitros de la solución de agar sobre el medio de crecimiento y la colonia y deje que el agar forme un gel a temperatura ambiente durante cinco minutos.Luego, use una hoja de afeitar afilada para cortar un mandril cuadrado de tres capas con la colonia laminada entre las dos capas superiores. Si prepara varias muestras, asegúrese de que cada mandril esté cortado a un tamaño comparable. Retire suavemente cualquier exceso de agar de la colonia que contiene el mandril.Luego, humedezca la cabeza plana de una espátula en PBS o agua e insértela suavemente entre las capas superior e inferior de agar. Transfiera inmediatamente la colonia laminada a un casete de inclusión etiquetado con un rotulador resistente a los productos químicos. Coloque el casete de inclusión en un sobre de portaobjetos de vidrio que contenga el fijador previamente preparado.Procese las muestras. Use 1X PBS para lavarlos dos veces durante una hora cada uno. Para obtener los mejores resultados, automatice la homogeneización de reactivos utilizando el ajuste bajo de la función de centrifugado de un procesador automático de tejidos.Para incrustar las muestras, llene un molde de cera con cera de parafina fundida calentada a 55 grados centígrados, luego use una espátula plana calentada para transferir rápidamente el mandril infiltrado del casete de inclusión al molde de cera asegurándose de que el mandril descanse paralelo a la base del molde. Deje que la cera se solidifique durante la noche a cuatro grados centígrados. Las muestras moldeadas en cera sólida pueden almacenarse indefinidamente a esta temperatura.Una vez que la cera se haya solidificado, extirpe la muestra del molde y use una cuchilla de afeitar para recortar el exceso de cera alrededor de la muestra. Deje un poco de cera que se extienda desde un extremo de la muestra que se pueda usar para sujetarla en el micrótomo. Es importante recortar la muestra incrustada en cera de manera que su forma facilite la recolección de cintas lineales lisas.Pequeñas imperfecciones en el recorte pueden producir artefactos en la cinta y comprometer la integridad de la sección. A continuación, calienta un baño de agua a 42 grados centígrados. A continuación, sujete la muestra en el micrótomo con la superficie de la colonia orientada perpendicularmente al borde de la hoja.Recorte la muestra en intervalos de 50 micrómetros hasta que se haya alcanzado el plano deseado de la colonia, a partir del cual se recogerán secciones utilizando un micrótomo ajustado a una velocidad de corte de 75 a 80 RPM y un ángulo de despeje de seis a 10 grados. Corta una cinta del número deseado de secciones de 10 micrómetros de grosor. Luego, usa un pincel de punta fina para separar la cinta de la hoja.Ahora, con pinzas o una gota de agua en la punta de una pipeta Pasteur, transfiera suavemente la cinta al baño de agua. Inserte inmediatamente un portaobjetos en el baño de agua y colóquelo debajo de la cinta en un ángulo de 45 grados. Toque el borde estrecho de la cinta con la diapositiva justo debajo de la etiqueta esmerilada.La cinta debe adherirse. Tire del portaobjetos fuera del baño de agua y ajuste el ángulo para que sea perpendicular a la superficie del agua, permitiendo que la cinta quede plana contra el tobogán a lo largo de su longitud. Evite atrapar el exceso de agua debajo de la cinta.Coloque suavemente el portaobjetos sobre un pañuelo absorbente sin pelusa que absorba el exceso de agua de la sección. Luego, coloque el portaobjetos sobre una toalla de papel y déjelo secar en la oscuridad a temperatura ambiente durante la noche. Caliente una placa calefactora nivelada a 45 grados centígrados y coloque la corredera en la placa durante 30 a 60 minutos.La cera se volverá semifundida y se aplanará contra el portaobjetos. Levante suavemente el portaobjetos de la placa calefactora y colóquelo plano sobre una superficie lisa y nivelada a temperatura ambiente durante aproximadamente un minuto hasta que la cera se solidifique. Asegúrese de que la cera fundida no se desplace hacia ninguno de los lados del portaobjetos.Con las muestras dentro de un sobre de portaobjetos de vidrio, desparafina los portaobjetos en cuatro lavados con agente limpiador durante cinco minutos cada uno. Use un aspirador Buchner para eliminar la solución entre lavados. Use etanol 100% para lavar los portaobjetos tres veces durante un minuto cada una.Luego, después de rehidratar las diapositivas de acuerdo con el protocolo de texto, monte inmediatamente las secciones en un medio de montaje con tampón tris y aplique un cubreobjetos. El agar de superposición alrededor de la sección no reacciona con el fijador, por lo que no se adhiere al portaobjetos de acelga. Este agar puede desprenderse durante la rehidratación y dañar la sección, por lo que se debe tener cuidado de no agitar la solución durante la rehidratación.Deje que el medio de montaje se polimerice a temperatura ambiente durante la noche. Una vez polimerizado, use esmalte de uñas transparente para sellar el cubreobjetos al portaobjetos. Finalmente, guarde los portaobjetos sellados indefinidamente en la oscuridad a cuatro grados centígrados.Mientras que las imágenes DIC que utilizan un objetivo de inmersión en aceite 40 veces pueden ser suficientes para mostrar algunas características morfológicas de las secciones delgadas de la biopelícula, la microscopía de fluorescencia de cepas diseñadas para expresar constitutivamente proteínas fluorescentes proporciona una visualización mejorada de la distribución celular dentro de las muestras. Como se muestra en estos paneles, las imágenes de secciones individuales se pueden unir para generar una sección transversal de toda la colonia y proporciona contexto para la localización de características estructurales dentro de la morfología general a nivel macroscópico. El uso de una cepa diseñada para expresar una proteína fluorescente bajo el control de un promotor específico permite la visualización de la distribución de la expresión génica.Además, las colonias pueden cultivarse en un medio que contenga colorantes, o se pueden añadir colorantes después del corte a los polisacáridos específicos de las manchas. Finalmente, las muestras también se pueden preparar y obtener imágenes a mayor resolución utilizando microscopía electrónica de transmisión, como se presenta aquí. Al intentar este procedimiento, es importante tener en cuenta la agilidad de las muestras y la posibilidad de introducir artefactos fluorescentes y estructurales, ya sea mediante fijación, seccionamiento o rehidratación, que pueden influir en la interpretación de los datos.Este procedimiento permite un análisis cuantitativo de imágenes, como la correlación de los perfiles de expresión de los reporteros fluorescentes con las características morfológicas y el eje Z de una biopelícula. Este protocolo se puede aplicar a diversas especies de microbios formadores de biopelículas con importancia médica e industrial como Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae y Bacillus subtilis. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cultivar y preparar biopelículas de colonias para seccionar mediante inclusión en parafina.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Un método para la incorporación de colonias de levadura que permite el corte de luz y microscopía electrónica. Este protocolo permite la determinación de la distribución de células y las células esporuladas pseudohyphal dentro de las colonias de proporcionar una nueva herramienta en la comprensión de la organización de los tipos de células dentro de una comunidad de hongos.

Colonia de levaduras Método de anidamiento

El siguiente video describe cómo preservar la morfología de un tejido con fijación de formol e inclusión de parafina.

Preservación de tejidos embebidos en parafina fijada en formol (FFPE): un método para estudiar la morfología de los tejidos

Fuente: Bucher, T., et al., Metodologías para estudiar biopelículas de B. subtilis como modelo para caracterizar inhibidores de biopelículas de moléculas pequeñas. J. Vis. Exp.(2016)Este vídeo demuestra la preparación de colonias bacterianas maduras de biofilm para imágenes de alta resolución. Cubre los pasos de fijación, deshidratación, montaje y recubrimiento metálico para preservar y visualizar la morfología de la biopelícula.

Preparación de colonias de biofilm bacteriano para análisis morfológicos

Este video describe un método para cultivar y analizar cualitativamente biopelículas bacterianas en hifas fúngicas utilizando microscopía. Las biopelículas bacterianas se forman con frecuencia en las superficies fúngicas e involucran numerosos procesos de interacción bacteriano-fúngico, como la cooperación metabólica, la competencia o la depredación.

Un método para la preparación de muestras para visualizar bacterias formadoras de biopelículas en hifas fúngicas

Este estudio presenta el desarrollo de metodologías reproducibles para estudiar los inhibidores de biopelículas y sus efectos sobre la multicelularidad de Bacillus subtilis.

Metodologías para el estudio<em&gt; B. subtilis</em&gt; Las biopelículas como modelo para la caracterización de Pequeño Biofilm inhibidores de moléculas

Este protocolo describe un nuevo método para hacer crecer y cualitativamente analizar biopelículas bacterianas en hifas de los hongos por microscopía confocal y electrónica.

Un nuevo método para el análisis cualitativo multi-escala de biopelículas bacterianas en filamentosa fúngica Colonias Utilizando microscopía confocal y electrónica

Para ver y cuantificar las características internas de las biopelículas de Candida albicans, preparamos especímenes fijos intactos que se clarifican mediante la coincidencia del índice de refracción. A continuación, la microscopía de seccionamiento óptico se puede utilizar para obtener datos de imagen tridimensionales a través del espesor completo de la biopelícula.

Aclaración e imagen de Candida albicans Biofilms

Aquí, proporcionamos protocolos detallados, robustos y complementarios para realizar imágenes de tinción y resolución subcelular de modelos de cultivo celular tridimensionales fijos que van desde 100 μm hasta varios milímetros, lo que permite la visualización de su morfología, composición de tipo celular e interacciones.

Tinción e imágenes de alta resolución de modelos organoides y esferoides tridimensionales

Este protocolo tiene como objetivo proporcionar procedimientos detallados para recolectar, fijar y mantener muestras de plantas micoheterótrofas, aplicando diferentes técnicas de microscopía como microscopía electrónica de barrido y transmisión, microscopía de luz, confocal y fluorescencia para estudiar la colonización fúngica en tejidos vegetales y semillas germinadas con hongos micorrícicos.

Técnicas de microscopía para interpretar la colonización fúngica en tejidos de plantas micoheterótrofas y germinación simbiótica de semillas

La formación de colonias de células (CFC) de ensayo es un ensayo in vitro en progenitores hematopoyéticos que forman colonias en un medio semi-sólido. Una combinación de la morfología de la colonia, la morfología celular y citometría de flujo se utilizan para evaluar la capacidad de los progenitores para proliferar y diferenciarse a lo largo de los diferentes linajes hematopoyéticos.

La formación de colonias de células (CFC) para el ensayo de células hematopoyéticas humanas

Aprende a incluir biofilms microbianos en parafina y obtener secciones finas para análisis microscópico. Este método permite visualizar patrones de expresión génica preservando la morfología nativa de las colonias bacterianas.

Inclusión en parafina y finas secciones de Biofilms microbianos Colonia para el análisis microscópico

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