Colonia de levaduras Método de anidamiento
22 de marzo de 2011
Un método para la incorporación de colonias de levadura que permite el corte de luz y microscopía electrónica. Este protocolo permite la determinación de la distribución de células y las células esporuladas pseudohyphal dentro de las colonias de proporcionar una nueva herramienta en la comprensión de la organización de los tipos de células dentro de una comunidad de hongos.
El objetivo general de este procedimiento es incrustar colonias de levadura. Esto se logra eliminando primero una colonia y el agar subyacente de una placa de agar, colocándolo sobre varias gotas de agar fundido y cubriéndolo rápidamente con más aer fundido. A continuación, se recorta el exceso de AER de la colonia para que sea lo suficientemente pequeño como para caber en un molde.
A continuación, la colonia incrustada en AER se fija, se tiñe, se deshidrata y, finalmente, se infiltra con resina de espolones. A continuación, el bloque se coloca en un molde con espuelas adicionales de resina incubada hasta que se endurece y luego se secciona. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la distribución de los tipos de células dentro de una colonia de levaduras a través de microscopía óptica o electrónica.
La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes como la microscopía electrónica de barrido, es que permite determinar la estructura interna de la colonia. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del desarrollo microbiano, como la distribución de los tipos de células dentro de las colonias. Este método proporcionó información sobre la estructura de las colonias de cocodrilos CAC, pero es probable que también se pueda aplicar a otros microorganismos.
La demostración visual de este método es fundamental, ya que el manejo y la inclusión de las colonias pueden ser difíciles de aprender a partir de un protocolo escrito. La idea de este método se inspiró en algunos datos genéticos que publicamos en 2002 que sugerían que las esporas no se distribuían uniformemente en las colonias. Adaptamos un método para seccionar colonias que fue desarrollado por Engelberg en el laboratorio de aletas.
Así que comencemos. Comience incubando la levadura Wild S visi en placas de barrena a 30 grados hasta que haya aproximadamente 300 colonias. Con una espátula estrecha, retire las colonias de uno a dos milímetros de diámetro, una a la vez, del plato.
Luego, con una pipeta de un mililitro, coloque varias gotas de agar al 2% a 42 grados centígrados en un portaobjetos de microscopio e inmediatamente coloque la colonia en agar boca arriba antes de que el AER se solidifique. Coloque varias gotas más de agar en la colonia y deje que el agar se solidifique, asegúrese de que toda la colonia, incluida la parte superior de la colonia, esté encerrada en agar. En todos los pasos posteriores del protocolo con una cuchilla de afeitar.
Recorte el AER alrededor de la colonia y coloque el bloque de AER que contiene la colonia. En un vial de 3,5 mililitros con tapón de rosca de silicato bo que contiene un 2% de aldehído paraformado y un 2% de glutaraldehído, se deben procesar colonias fijadoras, una a la vez para evitar el secado, pero se pueden colocar hasta 10 colonias en el mismo vial. Dejar las colonias durante siete días a cuatro grados centígrados.
Después de una semana, retire el fijador y lave las colonias agrícolas dos veces, utilizando aproximadamente 1,5 mililitros de sodio 0,15 molar. Cate a pH 7,2 e incubar en hielo después de cada lavado durante 15 minutos sin agitar. Después de esto, lávese dos veces más.
Utilizando 1,5 mililitros de un tampón X OS, compuesto por 100 milimolares de fosfato monopotásico, 10 milimolares de cloruro de magnesio a pH 6,0, incubando en hielo durante cinco minutos después de cada lavado. A continuación, utilizando el mismo vial, realice el tratamiento de osmio y los lavados enumerados aquí y en la parte escrita de este protocolo. Por otra parte, utilizando el mismo vial, realice las deshidrataciones escalonadas que se enumeran aquí y en el protocolo escrito adjunto a primera hora de la mañana siguiente.
Prepare el reactivo de espuelas como se muestra aquí y en el protocolo escrito adjunto. Lave inmediatamente los bloques agrícolas cinco veces durante 10 minutos cada uno con 1,5 mililitros de etanol 100% a temperatura ambiente. Después del último lavado con etanol, retire solo la cantidad suficiente de etanol para que el bloque agrícola permanezca cubierto.
Con una pipeta de pasto, coloque aproximadamente 0,5 mililitros de reactivo de espuelas en el vial y gírelo sobre una rueda a baja velocidad durante 15 minutos. A temperatura ambiente después de la rotación, deje reposar el vial durante 30 minutos. A continuación, retire la solución por completo.
A continuación, añada 1,5 mililitros de reactivo de espuelas para cubrir el bloque agrícola. Nuevamente, gire el vial sobre una rueda durante 15 minutos a temperatura ambiente y déjelo reposar durante 30 minutos. Repite este lavado.
Da tres pasos más. Después de los últimos 30 minutos, retire el reactivo de espuelas y agregue reactivo de espuelas frescas para cubrir los bloques. Deje reposar los bloques agrícolas a temperatura ambiente durante cuatro horas.
Reemplace el reactivo de espuelas y gírelo durante la noche. A la mañana siguiente, reemplace el reactivo de espuelas y deje los viales rotando hasta el día siguiente. A la mañana siguiente, coloque el reactivo de espuelas en moldes de silicona numerados para cubrir solo el fondo de los moldes.
A continuación, coloque los bloques de agricultura en los moldes e incube a 60 grados centígrados durante cuatro horas. Después de cuatro horas, rellene los moldes con más espolones, reactivo e incube a 60 grados centígrados durante la noche. Retire los bloques del molde para seccionarlos.
Aquí se muestra un ejemplo de una micrografía óptica de una sección a través del centro de una colonia de levaduras S Visia silvestres. Esta levadura es una cepa de tipo silvestre aislada de exudados de árboles. La colonia se incubó durante seis días en medio YNA antes de la sección.
En esta imagen, se distinguen fácilmente el asai, la levadura pseudo hifa y la levadura ovoide y también es evidente la región de la colonia que invade el agar subyacente. Las flechas abiertas indican que las flechas llenas de asai son representativas, las flechas llenas de células vegetativas ovoides representativas indican que las puntas de flecha están llenas de cadenas de células alargadas y si. Esta imagen es un ejemplo de una micrografía electrónica de una sección delgada de una cepa de laboratorio de levadura SH 1 0 2 0 y W 3 0 3.Fondo.
La colonia se incubó durante seis días en medio YNA antes de la sección. La imagen muestra una región de la colonia que contiene una alta frecuencia de células esporuladas. Una flecha indica la estructura bicapa de la pared de esporas.
En la parte A, mostramos una sección de una colonia de cuatro días con una cuadrícula compuesta por 15 rectángulos superpuestos en la imagen de la parte B.La frecuencia de células relacionadas con las esporas en cada rectángulo se injerta con las 15 barras correspondientes a los 15 rectángulos que se muestran en la parte A.Los datos son la media y el error estándar de cuatro colonias independientes de cuatro días En la parte C, Se muestran las medias y los errores estándar para cuatro colonias independientes de ocho días. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos semanas con un día completo y varios días de una a tres horas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar agregar las soluciones inmediatamente para que los bloques no se sequen siguiendo este procedimiento.
Otros métodos, como la inmunomicroscopía electrónica, podrían utilizarse para determinar la distribución de las células que expresan proteínas particulares después de su desarrollo. Esta técnica nos permitió observar no solo el patrón de las células esporuladas, sino también el patrón de las células pseudo hifas en las colonias de CCI de Croce. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo incrustar colonias de levadura para seccionar.
No olvide que muchos de los reactivos de microscopía utilizados en este protocolo pueden ser extremadamente peligrosos. Recuerde usar una campana extractora, usar ropa protectora y desechar los reactivos correctamente. Está bien, eso es todo.
Gracias por mirar. Buena suerte con tus experimentos.
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Visión general
Este artículo presenta un método para incrustar colonias de levadura, permitiendo el corte para microscopía de luz y electrónica. El protocolo facilita el análisis de células esporuladas y pseudohifales dentro de las colonias, contribuyendo a la comprensión de la organización de tipos de células en comunidades fúngicas.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Microbiología
- Biología celular
- Biología fúngica
Antecedentes
- Las colonias de levadura exhiben diversos tipos de células.
- Entender la distribución celular es crucial para estudiar comunidades fúngicas.
- Los métodos tradicionales pueden no proporcionar información detallada sobre la organización celular.
- Este método ofrece un nuevo enfoque para la visualización.
Propósito del estudio
- Desarrollar un protocolo para incrustar colonias de levadura.
- Permitir un análisis detallado de la distribución de tipos de células.
- Mejorar la comprensión de la organización de comunidades fúngicas.
Métodos utilizados
- Retirada de colonias de levadura de placas de agar.
- Incrustación de colonias en agar fundido.
- Recorte del exceso de agar para ajustar a moldes.
- Fijación, tinción, deshidratación e infiltración con resina.
Principales resultados
- Incrustación exitosa de colonias de levadura para microscopía.
- Visualización de células esporuladas y pseudohifales.
- Análisis detallado de la distribución de tipos de células dentro de las colonias.
- Nuevas perspectivas sobre la organización de comunidades fúngicas.
Conclusiones
- El método de incrustación es efectivo para el análisis microscópico.
- Proporciona una herramienta valiosa para estudiar la estructura de colonias de levadura.
- La investigación futura puede basarse en este método para explorar interacciones fúngicas.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Understanding spatial organization of cell types within microbial communities supports target validation in antimicrobial and antifungal discovery. This method enables mechanistic de-risking by revealing phenotypic heterogeneity that may influence drug response and resistance development. It provides predictive confidence for early-stage screening by linking colony architecture to functional subpopulations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing sporulated and pseudohyphal cell distribution within colonies.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct observation of cell type patterning linked to functional states.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by preserving spatial relationships of cell types.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through consistent sectioning and imaging of colony interior structures.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance through visualization of invading colony regions that model microbial penetration into host tissues.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling structural correlation with phenotypic outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
Positions the method within early discovery to lead identification by enabling structural phenotyping that informs compound screening decisions.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing and pathway clarification via direct imaging of asymmetric cell distribution.
- Screening: Describes assay readiness through production of thick and thin sections compatible with light and electron microscopy.
- Analytics: Highlights quantitative outputs such as frequency mapping of sporulated cells across colony regions for comparative analysis.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by linking invasive colony fronts to tissue penetration models.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability for structural analysis across multiple fungal strains and conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in microbial community behavior.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of colony preparation for multi-user microscopy pipelines.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early phenotypic de-risking.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on structural biomarkers of virulence or persistence.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in histology, microscopy, and microbial handling.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including microtomes, light and electron microscopes, and resin infiltration systems.
- Cross-team standardization requirements for fixation, staining, and sectioning protocols across microbiology and imaging groups.
- Adaptation considerations across model systems such as biofilm-forming bacteria or other yeast species with varying colony morphology.
- Practical limitations supported by source material including colony size constraints (1-2 mm diameter) and multi-day processing time requiring sterile technique to prevent contamination.
