Name: Colonia de levaduras Método de anidamiento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-22T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Aprenda a incrustar colonias de levadura para microscopía óptica y electrónica. Este método permite analizar la distribución de células esporuladas y pseudohifales, revelando la organización interna de comunidades fúngicas.

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La investigación fue financiada por el NIH 1R15GM094770.

1. Colonia El aislamiento y la fijación <ol><li> Incubar 300 colonias en un medio de agar durante el tiempo indicado (una colonia aislada debe ser de 1-2 mm de diámetro). </li><li> Retire la colonia (boca arriba) y medio subyacente utilizando una espátula. </li><li> Coloque varias gotas de 2% de agar 42 ° C en un portaobjetos con 1 mL Pipetman punta y de inmediato el lugar de colonias en el rostro de agar antes de que se solidifica. </li><li> Coloque varias gotas de 2% de agar 42 ° C en la colonia y dejar que se solidifique. </li><li> Use guantes para todos los pasos en lo que resta de este protocolo </li><li> Bloque de corte con cuchilla de afeitar y colocarlos en un 3,5 ml de borosilicato con tapón de rosca vial que contiene 2% de paraformaldehído / 2% fijador de glutaraldehído durante 7 días a 4 ° C. </li></ol> 2. Se lava y tratamiento de osmio <ol><li> Después de aproximadamente una semana, lavado de bloques de agar en el hielo bajo campana para sustancias químicas mediante la incubación de dos veces durante 15 minutos con cacodilato de sodio 0,15 M suficiente (pH 7,2) para cubrir por completo la colonia (aproximadamente 1,5 ml) y luego dos veces más durante 5 minutos con el mismo volumen 1X buffer de SO (100 mM KH 2 PO 4 10 mM MgCl 2, pH 6,0). </li><li> Añadir el mismo volumen de 1% de OsO 4 [2 ml OsO 4 (2%) + 2 ml de 2x OS Buffer] para viales (en hielo) para cubrir los bloques de agar en campana para sustancias químicas de 1 hora y luego lavar dos veces con la misma cantidad 1X buffer de SO durante 10 minutos cada uno. </li><li> Deja viales durante la noche a 4 ° C en 1X buffer del sistema operativo. </li><li> Fijador y todos los lavados en este paso se eliminan como residuos peligrosos. Todas las pipetas contienen OsO4 se lavaron 3X con aceite vegetal. </li></ol> 3. Lavado y deshidratación <ol><li> A la mañana siguiente bloques de agar lavado dos veces en el hielo con el mismo volumen que el anterior de agua fría durante 10 minutos cada uno con una pipeta Pasteur. </li><li> Lavar sucesivamente con el mismo volumen de 25%, 50%, 75%, 95% de etanol durante 10 minutos cada uno seguido por dos lavados con etanol al 100% durante 10 minutos. Dejar toda la noche a 4 ° C en el 100% de etanol. </li><li> Todos los lavados en este paso se eliminan como residuos peligrosos. </li></ol> 4. Preparación de Spurr <ol><li> A la mañana siguiente (lo más temprano posible) pesan las siguientes soluciones (Ciencias de la EM) en un vaso de plástico desechable en una campana de extracción para preparar reactivos de Spurr. Para todos los trabajos posteriores de este método, siga utilizando una campana de humos. (ERL 4221 solución de 5 gramos) (DER 736 solución de 4 gramos) (Solución NSA 13 gramos) </li><li> mezcla de estas soluciones (lentamente) durante 20 minutos en campana es suficiente utilizar una barra de agitación </li><li> Añadir la solución de DMAE 0,15 gramos y revuelva 20 minutos anteriores. </li><li> Degas por encima de la mezcla durante 1-2 horas en la campana. </li></ol> 5. La infiltración de Spurr <ol><li> Tan pronto como Spurr se lave bloques de agar 5 veces con un volumen igual al anterior de 100% de etanol temperatura ambiente durante 10 minutos cada uno. Después del lavado de etanol última separar el etanol con una pipeta Pasteur para que el etanol restante apenas cubre los bloques de agar. </li><li> Añadir aproximadamente la misma cantidad de reactivo de Spurr (aproximadamente 0,5 ml) y girar viales en la rueda durante 15 minutos a temperatura ambiente y se deja reposar durante 30 minutos. Después de 30 minutos, retire la solución completa con una pipeta Pasteur, añadir Spurr de cubierta del bloque de agar (aproximadamente 1,5 ml), gire viales en la rueda durante 15 minutos a temperatura ambiente y dejar reposar durante 30 minutos. Repita el reemplazo de Spurr, rotación, y la incubación de 3 veces más. </li><li> Después de los últimos 30 minutos, retire los reactivos de Spurr y añadir nuevas Spurr para cubrir los bloques. Permita que los bloques de agar para estar a temperatura ambiente durante 4 horas. </li><li> Vuelva a colocar la de Spurr y rotar durante la noche. </li><li> En la mañana reemplazar Spurr y dejar girando hasta el día siguiente. </li><li> El Spurr mañana siguiente lugar en moldes de silicona numeradas (Fisher Scientific) sólo para cubrir el fondo de los moldes a continuación, añadir bloques de agar a los moldes. Se incuba a 60 ° C durante 4 horas </li><li> Después de 4 horas, parte superior de los moldes, con los más Spurr y se incuba a 60 ° C durante la noche. </li><li> Si después de retirar los bloques de los moldes de los bloques son todavía un poco flexibles, volver a los moldes y se incuba un adicional de 2 días </li></ol> 6. Seccionamiento <ol><li> Un microtomo Ultracut Leica S fue utilizado para cortar secciones de 0,5 μ de espesor para microscopía de luz y 0,1 μ secciones delgadas de EM de transmisión. </li><li> Para microscopía de luz, ya que se cortaron secciones, que fueron colocados en una gota de dH 2 O, y se seca en un 52 ° C del bloque de calor. Secciones de secado fueron teñidas con una caída de 1,0% de azul de toluidina, el 1% borato de sodio de 5.15 segundos. Después de la tinción, las secciones se lavaron inmediatamente bajo un chorro de agua, se seca, cubierta en medio de montaje (KPL) y una hoja de cubierta sellada en la muestra. </li></ol> La amplia relevancia de la medición de la formación de patrones en la levadura y otros microorganismos han sido revisados ​​previamente 1. De particular interés es el aumento de la funcionalidad de las colonias microbianas organizadas en relación con las comunidades desorganizadas. El método descrito es una modificación de un método para la incorporación de grandes colonias especializados 2, y una breve descripción de nuestras modificaciones se han publicado 3. Un ejemplo de una micrografía de luz de una sección a través del centro de una colonia salvaje de S. colonia de levadura Saccharomyces se muestra en la Figura 1. Ascos, pseudohifas y levaduras ovoides son fácilmente distinguibles, y en la región de la colonia invadir el agar subyacente es también evidente. Un ejemplo de una micrografía electrónica de una cepa de laboratorio de la levadura (W303 de fondo) se muestra en la Figura 2. La imagen es de una región de la colonia que contiene una alta frecuencia de células esporuladas. <img src="/files/ftp_upload/2510/2510fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Microscopía de luz de una colonia de hongos silvestres. Esta levadura (YPS133) fue aislada recientemente de 4 exudados de árboles. La colonia se incubó durante 6 días en medio de YNA 5 antes de cortar. Flechas abiertas indican representante ascos, lleno de flechas indican las células vegetativas representante ovoide, puntas de flecha indican lleno de cadenas de células alargadas (pseudohifas) y ascos. <img src="/files/ftp_upload/2510/2510fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Microscopia electrónica de una cepa de levadura de laboratorio. La colonia de SH1020 (W303 de fondo) se incubó durante 6 días en el medio YNA antes de seccionar 3. La imagen muestra una región de la sección con una alta frecuencia de ascos. Una flecha indica la estructura de dos capas de la pared de la espora. <img src="/files/ftp_upload/2510/2510fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. La cuantificación de la distribución de células esporuladas en las colonias de: A) una cuadrícula que contiene 15 rectángulos contiguos apilados a lo largo de su lado más largo se superpone a la región central de la imagen de una sección de la colonia. La red es reducido, manteniendo sus proporciones constantes, que sólo cubre la parte superior e inferior de la colonia. (B &amp; C) La fracción de células esporuladas en cada rectángulo en relación con el total de células en el rectángulo que se determina por inspección visual de las imágenes de los viejos de 4 días (B) y 8 días de las antiguas colonias (C). Por ejemplo, el rectángulo en la parte superior de la colonia ("1") corresponde a la parte izquierda de la gráfica. La media de cuatro colonias se muestra, las barras de error de visualización de la std. error.

<ol><li>Kimmel, A. R., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+symmetries%3A+regulation+of+Dictyostelium+development+through+chemoattractant+and+morphogen+signal-response%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Breaking symmetries: regulation of Dictyostelium development through chemoattractant and morphogen signal-response.</a> Curr Opin Genet Dev. 14, 540-540 (2004).</li>
<li>Palkova, Z., Vachova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+within+a+community%3A+benefit+to+yeast+long-term+survival%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Life within a community: benefit to yeast long-term survival.</a> FEMS Microbiol Rev. 30, 806-806 (2006).</li>
<li>Shapiro, J., Vachova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+significances+of+bacterial+colony+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">The significances of bacterial colony patterns.</a> Bioessays. 17, 597-597 (1995).</li>
<li>Shapiro, J., Vachova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinking+about+bacterial+populations+as+multicellular+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Thinking about bacterial populations as multicellular organisms.</a> Annu Rev Microbiol. 52, 81-81 (1998).</li>
<li>Engelberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+stalk-like+structures+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Multicellular stalk-like structures in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Bacteriol. 180, 3992-3992 (1998).</li>
<li>Scherz, R., Shinder, V., Engelberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+analysis+of+Saccharomyces+cerevisiae+stalk-like+structures+reveals+spatial+organization+and+cell+specialization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Anatomical analysis of Saccharomyces cerevisiae stalk-like structures reveals spatial organization and cell specialization.</a> J Bacteriol. 183, 5402-5402 (2001).</li>
<li>Piccirillo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rim101p%2FPacC+pathway+and+alkaline+pH+regulate+pattern+formation+in+yeast+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Rim101p/PacC pathway and alkaline pH regulate pattern formation in yeast colonies.</a> Genetics. 184, 707-707 (2010).</li>
<li>Sniegowski, P. D., Dombrowski, P. G., Fingerman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+cerevisiae+and+Saccharomyces+paradoxus+coexist+in+a+natural+woodland+site+in+North+America+and+display+different+levels+of+reproductive+isolation+from+European+conspecifics%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Res%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus coexist in a natural woodland site in North America and display different levels of reproductive isolation from European conspecifics.</a> FEMS Yeast Res. 1, 299-299 (2002).</li>
<li>Piccirillo, S., Honigberg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporulation+patterning+and+invasive+growth+in+wild+and+domesticated+yeast+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Sporulation patterning and invasive growth in wild and domesticated yeast colonies.</a> Res Microbiol. 161, 390-390 (2002).</li>
<li>Vachova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+developing+multicellular+yeast+colony%3A+spatio-temporal+expression+of+Ato1p+ammonium+exporter%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter.</a> Environ Microbiol. , (2009).</li>
</ol>

El método presentado revela las estructuras interiores de las colonias. Debido a que el método es eficaz en la determinación de patrones de tipos de células en una variedad de S. cerevisiae con morfologías diferentes colonias, y también en una especie relacionada S. paradoxus 5, el método también es probable que trabajar en una amplia gama de hongos y otros microorganismos. Un paso fundamental para el éxito del método es asegurar que toda la colonia, incluyendo la parte s...

<table><tbody><tr><td>Tetraóxido de osmio</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 19152</td><td></td></tr><tr><td>Moldes de silicona para inclusión</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC 9975029</td><td></td></tr><tr><td>Resina epoxi cicloalifática</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 15004</td><td>ERL 4221</td></tr><tr><td>Resina epoxi</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 13000</td><td>DER 736</td></tr><tr><td>Anhídrido nonenil succínico</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 19050</td><td>NSA</td></tr><tr><td>2-Dimetil amino&amp;#8211;etanol</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 13300</td><td>DMAE</td></tr><tr><td>Medio de montaje</td><td>KPL Inc</td><td>71-00-16</td><td></td></tr><tr><td>Rueda giratoria</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>Pelco 1055</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo</td><td>Leica Microsystems</td><td>Ultracut S</td><td></td></tr></tbody></table>

colonia de levaduras método de anidamiento

Yeast Colony Embedding Method

Patrón de los diferentes tipos de células en embriones es un mecanismo clave en el desarrollo de los metazoos. Comunidades de microorganismos, tales como colonias y biofilms también muestran patrones de tipos de células. Por ejemplo, en el de levadura de S. cerevisiae, células y las células esporuladas pseudohyphal no están distribuidas uniformemente en las colonias. La importancia funcional de los patrones y los mecanismos moleculares que subyacen a estos modelos son aún poco conocidos. Uno de los retos con respecto a la investigación de patrones de tipos de células en las colonias de hongos es que a diferencia del tejido metazoos, las células en las colonias son relativamente débilmente unidas entre sí. En particular, las colonias de hongos no contienen el mismo nivel amplio de la matriz extracelular en la mayoría de los tejidos. Aquí nos informe sobre un método para la inclusión y corte de colonias de levaduras que revela los patrones interior de tipos de células en estas colonias. El método puede ser usado para preparar secciones gruesas (0,5 μ) es útil para microscopía óptica y secciones delgadas (0,1 μ) adecuada para la microscopía electrónica de transmisión. Células ascos y pseudohyphal se pueden distinguir fácilmente de las células de levadura ovoide por microscopía de luz, mientras que la estructura interior de estas células puede ser visualizado por EM. El método se basa en los alrededores de las colonias con agar, infiltrándose en ellos con el medio de Spurr, y luego el corte. Las colonias con un diámetro en el rango de 1-2 mm son adecuados para este protocolo. Además de visualizar el interior de las colonias, el método permite la visualización de la región de la colonia que invade el agar subyacente.

Un método para la incorporación de colonias de levadura que permite el corte de luz y microscopía electrónica. Este protocolo permite la determinación de la distribución de células y las células esporuladas pseudohyphal dentro de las colonias de proporcionar una nueva herramienta en la comprensión de la organización de los tipos de células dentro de una comunidad de hongos.

Colonia de levaduras Método de anidamiento

El patrón de distribución de diferentes tipos celulares en los embriones es un mecanismo clave en el desarrollo de los metazoos. Las comunidades de microorganismos, tales como las colonias y las biopelículas...

El objetivo general de este procedimiento es incrustar colonias de levadura. Esto se logra primero retirando una colonia junto con el agar debajo de ella desde una placa de agar, colocándola sobre varias gotas de agar fundido y cubriéndola rápidamente con más agar fundido. A continuación, se recorta el exceso de AER de la colonia para hacerla lo suficientemente pequeña como para que quepa en un molde.La colonia incrustada en la EMA se fija, tiñe, deshidrata e, finalmente, se infiltra con resina de spurs. El bloque se coloca entonces en un molde con resina de spurs adicional y se incuba hasta que endurezca, para luego seccionarlo. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren la distribución de los tipos celulares dentro de una colonia de levadura mediante microscopía óptica o electrónica.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la microscopía electrónica de barrido es que permite determinar la estructura interna de la colonia. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del desarrollo microbiano, como la distribución de los tipos celulares dentro de las colonias. Este método proporcionó información sobre la estructura de las colonias de croce CAC, pero es probable que también pueda aplicarse a otros microorganismos.La demostración visual de este método es fundamental, ya que la manipulación e inclusión de colonias puede ser difícil de aprender a partir de un protocolo escrito. La idea para este método se inspiró en algunos datos genéticos que publicamos en 2002, los cuales sugerían que las esporas no estaban distribuidas uniformemente en las colonias. Adaptamos un método para seccionar colonias que fue desarrollado por engelberg en el laboratorio de fin.Así que comencemos. Incube inicialmente levadura Wild S visi en placas con agar a 30 grados hasta que haya aproximadamente 300 colonias. Utilizando una espátula estrecha, retire las colonias de uno a dos milímetros de diámetro, una a la vez, de la placa.Luego, utilizando una punta para pipeta de un mililitro, coloque varias gotas de agar al 2% a 42 grados Celsius sobre un portaobjetos de microscopio, y coloque inmediatamente la colonia sobre el agar con la cara hacia arriba antes de que el AER se solidifique. Añada varias gotas más de agar sobre la colonia y deje que el agar se solidifique, asegurándose de que toda la colonia, incluida su parte superior, quede completamente rodeada por el agar. En todos los pasos posteriores del protocolo, utilice una cuchilla de afeitar.Recorte el AER alrededor de la colonia y coloque el bloque de AER que contiene la colonia. En un vial de 3,5 mililitros de borosilicato con tapa roscada que contenga fijador de paraformaldehído al 2% y glutaraldehído al 2%, las colonias deben procesarse, una a la vez para evitar el secado, aunque se pueden colocar hasta 10 colonias en el mismo vial. Deje las colonias durante siete días a cuatro grados Celsius.Después de una semana, retire el fijador y lave las colonias de agri dos veces, utilizando aproximadamente 1,5 mililitros de cloruro de sodio 0,15 molar a pH 7,2 e incube en hielo tras cada lavado durante 15 minutos sin agitación. A continuación, lávese dos veces más.Utilizando 1,5 mililitros de un tampón X OS, compuesto por fosfato monopotásico 100 milimolar, cloruro de magnesio 10 milimolar a pH 6,0, incubar en hielo durante cinco minutos tras cada lavado. A continuación, utilizando el mismo vial, realizar el tratamiento con osmio y los lavados indicados aquí y en la parte escrita de este protocolo. Luego nuevamente, utilizando el mismo vial, realizar las deshidrataciones escalonadas indicadas aquí y en el protocolo escrito adjunto a primera hora de la mañana siguiente.Prepare el reactivo spurs como se muestra aquí y en el protocolo escrito adjunto. Lave inmediatamente los bloques de agri cinco veces durante 10 minutos cada uno con 1,5 mililitros de etanol al 100 % a temperatura ambiente. Después del último lavado con etanol, retire solo la cantidad suficiente de etanol para que el bloque de agri permanezca cubierto.Usando una pipeta Pasteur, coloque aproximadamente 0.5 mililitros del reactivo de espolones en el vial y rote en una rueda a baja velocidad durante 15 minutos. A temperatura ambiente después de la rotación, deje reposar el vial durante 30 minutos. A continuación, retire completamente la solución.Luego, agregue 1.5 mililitros del reactivo spurs para cubrir el bloque agri. Nuevamente, rote el vial en una rueda durante 15 minutos a temperatura ambiente y déjelo reposar durante 30 minutos. Repita este lavado.Repita el paso tres veces más. Después de los últimos 30 minutos, retire el reactivo spurs y agregue reactivo spurs fresco para cubrir los bloques. Deje reposar los bloques agri a temperatura ambiente durante cuatro horas.Sustituya el reactivo Spurs y rote durante la noche. A la mañana siguiente, sustituya el reactivo Spurs y deje los viales rotando hasta el día siguiente. A la mañana siguiente, coloque el reactivo Spurs en moldes de silicona numerados para cubrir apenas el fondo de los moldes.A continuación, coloque los bloques de agar en los moldes e incube a 60 grados Celsius durante cuatro horas. Después de cuatro horas, complete los moldes con más espumas, reactivo, e incube a 60 grados Celsius durante la noche. Retire los bloques del molde para su seccionado.Se muestra aquí un ejemplo de una micrografía luminosa de una sección a través del centro de una colonia de levadura Silvestre S Visia. Esta levadura es una cepa tipo silvestre aislada de exudados de árboles. La colonia se incubó durante seis días en medio YNA antes de la sección. En esta imagen, las formas asai, pseudo hyphy y las levaduras ovoides son fácilmente distinguibles, y también es evidente la región de la colonia que invade el agar subyacente. Las flechas abiertas indican representantes asai, las flechas rellenas indican células vegetativas ovoides representativas y las puntas de flecha rellenas indican cadenas de células alargadas y si. Esta imagen es un ejemplo de un micrografía electrónica de un corte delgado de una cepa de laboratorio de levadura SH 1 0 2 0 y W 3 0 3. Antecedentes.La colonia se incubó durante seis días en medio YNA antes de la sección. La imagen muestra una región de la colonia que contiene una alta frecuencia de células esporuladas. Una flecha indica la estructura de doble capa de la pared del esporo.En la parte A, se muestra una sección de una colonia de cuatro días con una cuadrícula compuesta por 15 rectángulos superpuestos sobre la imagen en la parte B. La frecuencia de células relacionadas con esporas en cada rectángulo se representa mediante 15 barras que corresponden a los 15 rectángulos mostrados en la parte A. Los datos corresponden a la media y al error estándar de cuatro colonias independientes de cuatro días. En la parte C, se presentan las medias y los errores estándar de cuatro colonias independientes de ocho días. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en dos semanas con un día completo y varios días de una a tres horas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar agregar las soluciones inmediatamente para que los bloques no se sequen tras seguir este procedimiento.Otros métodos, como la microscopía electrónica inmunológica, podrían utilizarse posiblemente para determinar la distribución de células que expresan proteínas particulares tras su desarrollo. Esta técnica nos permitió observar no solo el patrón de las células esporuladas, sino también el patrón de las células pseudo hifales en colonias croce CCI. Tras ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo incrustar colonias de levadura para su seccionado.No olvide que muchos de los reactivos de microscopía utilizados en este protocolo pueden ser extremadamente peligrosos. Recuerde utilizar una campana extractora, usar ropa protectora y desechar los reactivos adecuadamente. Bien, eso es todo.Gracias por ver el video. Buena suerte con sus experimentos.

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Biología

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