Infusiones de la arteria carótida para farmacocinéticas y farmacodinámicas Análisis de taxanos en ratones

El objetivo general de este procedimiento es infundir un fármaco de interés a través de la arteria carótida para analizar el perfil farmacocinético del fármaco. Esto se logra primero fabricando un catéter personalizado a partir de tubos de polietileno y luego asegurando el catéter dentro de la arteria carótida del ratón. A continuación, el ratón se conecta a una bomba de infusión automatizada a través del catéter de la arteria carótida.

En el paso final, el medicamento se infunde en el ratón a un ritmo constante y se recolectan muestras de sangre a intervalos regulares. En última instancia, la cromatografía líquida y la espectrometría de masas se utilizan para determinar la concentración del fármaco dentro de las muestras de tejido y plasma. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la inyección en bolo, intraperitoneal, vena de cola o infusión yugular, es que es representativa de las tasas de infusión clínica, así como generalmente más fácil de realizar que la inserción yugular.

Este método puede responder a preguntas clave en farmacología, como cuál es la distribución in vivo de un fármaco, o podemos determinar si un inhibidor o modulador afecta a la función de la proteína. Para preparar un catéter para el experimento, primero, establezca una llama baja y constante en un mechero Bunsen. Luego, sostenga un trozo de tubo cerca de la llama para ablandar el polietileno.

Cuando el tubo comience a derretirse, separe lentamente los dos extremos para crear una sección delgada de tubo, de aproximadamente 0,25 milímetros de diámetro. A continuación, corte un extremo biselado en el tubo de aproximadamente 0,75 centímetros a lo largo de la sección delgada y luego pase el extremo rápidamente a través de la llama para que se redondee y agrande ligeramente. La punta se enganchará ligeramente hacia atrás, lo que ayudará a anclar el tubo durante la inserción en la arteria.

Corte el tubo a 6,0 centímetros del punto donde comienza a adelgazarse para hacer un catéter, y luego llene una jeringa equipada con una aguja desafilada con 200 microlitros de solución de heparina. Inserte la aguja en el extremo ancho del catéter y llene el catéter con heparina. Teniendo cuidado de evitar burbujas.

Luego, guarde la aguja y el catéter en un lugar estéril para aislar la arteria carótida. Comience haciendo un corte longitudinal de un centímetro ligeramente a la derecha de la línea media del cuello del animal, y luego use pinzas para separar la grasa y el músculo y exponer la tráquea. La arteria carótida corre paralela a la tráquea.

A continuación, separe con cuidado la fascia que recubre la arteria y luego tire ligeramente del nervio VAs a un lado. Inserte las pinzas en el espacio entre la arteria carótida y el nervio VA, y abra suavemente las pinzas para crear un espacio en la facia. Retire con cuidado el nervio de la arteria, despejando un espacio desde la horquilla en el extremo anterior cerca de la laringe hasta el extremo posterior más expuesto, aislando al menos una arteria de tres milímetros de longitud.

Luego, use fórceps para dibujar un hilo de sutura de seda debajo de la arteria y haga un nudo seguro para cerrar la arteria lo más cerca posible del extremo anterior. Después de colocar un segundo hilo, haga un nudo retráctil para cerrar temporalmente la arteria lo más lejos posible hacia el extremo posterior. A continuación, utilice un tercer hilo para hacer un nudo muy flojo entre las dos primeras suturas que se utilizará para asegurar rápidamente el catéter después de la colocación.

Para insertar el catéter, agarre el nudo de sutura inferior para tensar ligeramente la arteria. A continuación, corte la arteria por encima y muy cerca de la sutura anterior. Tenga cuidado de no cortar demasiado profundamente.

Revise la ranura para asegurarse de que la abertura no esté obstruida. Retire el catéter lleno de heparina de la aguja de la jeringa y luego tenga cuidado de no crear grandes bolsas de aire. En cualquiera de los extremos, manipule el catéter para colocar el extremo biselado en un ángulo cómodo hacia abajo y ligeramente hacia la mano dominante.

A continuación, mientras sujeta la sutura, para mantener la arteria ligeramente tensa, inserte suavemente el catéter en la hendidura. Luego, use las pinzas para agarrar el nudo de sutura anterior y tirar suavemente de la arteria hacia abajo sobre el catéter. Retire con cuidado el catéter y la sutura anterior.

A continuación, apriete el nudo central para asegurar el catéter cerca de la entrada del catéter en la arteria, teniendo cuidado de no obstruir el flujo a través del catéter. Haga un nudo triple apretado con la sutura central y luego use la sutura anterior para asegurar el catéter en su lugar debajo de la entrada a la arteria. Ahora use un enchufe conector para conectar un cable de solución salina al catéter, teniendo cuidado de no crear burbujas.

A continuación, agarre los extremos de la sutura posterior y tire suavemente de ella para liberar el nudo, maniobre la sutura por la arteria y sobre el extremo del catéter sin quitar el hilo. La sangre debe fluir hacia el catéter cuando el flujo parece no estar obstruido. Usa el hilo de la sutura posterior para hacer un nudo adicional ligeramente por encima de la sutura central.

Luego, enjuague el catéter de sangre y use un hemostático para sujetar el extremo del catéter cerca del enchufe del conector. Reemplace el conector con un enchufe de puerto para sellar el extremo del catéter y quitar el hemostático. Luego, use un par de pinzas para sujetar el catéter justo debajo de la sutura anterior, y otra pinza para presionar una torcedura en el catéter para que se doble fácilmente hacia un lado después de crear una segunda torcedura.

De la misma manera, gire el ratón sobre su lado izquierdo y limpie el área debajo y justo detrás de la oreja del animal con etanol al 70% y yodo povidona. Cuando se haya desinfectado la zona, haga una pequeña incisión de cuatro milímetros en la piel. Luego, use fórceps para mantener abierto el colgajo de tejido y coloque una sonda hueca roma debajo de la piel para crear un canal a través de la mejilla hasta la cavidad en el cuello.

Use las pinzas para liberar con cuidado un espacio para que salga la sonda y luego pase suavemente el tapón del puerto y el catéter a través de la sonda hasta el orificio de salida. Teniendo cuidado de no aplastar o contraer ningún vaso sanguíneo u órgano después de que se haya permitido que el animal se recupere durante 30 a 60 minutos, conecte una aguja desafilada a un extremo de un trozo de tubo de polietileno de 40 centímetros y un puerto de conexión al otro. A continuación, extraiga el fármaco de interés en una jeringa con un diámetro interior conocido.

Conecte la aguja a la jeringa y cargue el medicamento a través de la aguja y el tubo. Después de colocar la jeringa en la bomba, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, cebe la bomba para que el medicamento fluya suavemente fuera del conector. A continuación, para conectar el animal a la bomba, sujete el ratón y utilice el hemostático para sujetar el catéter cerca del enchufe del puerto.

Finalmente, reemplace el enchufe con un conector conectado a la jeringa y al tubo. Administre rápidamente una bomba rápida para eliminar el volumen del catéter y, a continuación, cambie inmediatamente a la velocidad de infusión deseada. En esta primera figura, se muestra una comparación de la concentración plasmática de Paclitaxel después de la infusión de la vena yugular y la infusión de la arteria carótida.

La concentración del fármaco disminuye rápidamente en los primeros 15 minutos después de una infusión inicial de alto volumen y luego se estabiliza durante los siguientes 150 minutos. En comparación, los niveles de paclitaxel en una infusión deficiente comienzan relativamente bajos y suben y bajan a lo largo del ensayo, muy probablemente debido a un bloqueo en la línea al principio de la perfusión. Aquí, se muestran los niveles relativos de paclitaxel en el hígado, el cerebro y el plasma sanguíneo al final de una infusión de tres horas. Como era de esperar, el animal exhibe una alta unión a proteínas plasmáticas, junto con bajas concentraciones de fármaco en el tejido cerebral. Una vez dominada, esta técnica debería tomar de 45 a 60 minutos si se realiza correctamente.

Después de ver el video, debe tener una buena comprensión de cómo aislar una arteria carótida, insertar un catéter y realizar una infusión.