Name: Oclusión de la arteria Cerebral Media permitiendo la reperfusión mediante la reparación de la arteria carótida común en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Aprende una técnica quirúrgica para reparar la arteria carótida común en ratones con oclusión de la arteria cerebral media. Este método mejora la reperfusión y reduce la variabilidad en modelos experimentales de ictus.

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Este trabajo fue financiado por el centro nacional para el reemplazo, el refinamiento y la reducción de animales en investigación (NC3Rs; NC/M000117/1 a CG). Los autores agradecen al personal de la división de servicios biomédicos de la Universidad de Leicester, por su cuidado de los animales de experimentación y Maria Viskaduraki por su asesoría estadística. Resultados representativos están adaptados con autorización de modelos de la enfermedad y mecanismos de11.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Inducción de filamento de MCAO transitorio en roedores es el más frecuentemente usado modelo experimental de movimiento, ya que permite reperfusión en el área afectada, mímico la ocurrencia de eventos de accidente cerebrovascular isquémico clínico7. Aquí es una alternativa quirúrgica para el método tradicional de MCAO transitorio filamento-inducida en ratones. El enfoque alternativo, con tratamiento de analgesia, cepa ligadura evitación y reparación de la incisión del CCA, se traduce en una variabilidad reducida de LV cuando se evaluó mediante resonancia magnética y de métodos tinción histológica11.
Los enfoques tradicionales para inducir MCAO en gran medida se basan en el corte transversal, o en la ligadura por lo menos, de la cepa, que se ha demostrado, en ratas, que afectan el comportamiento de beber y un aumento en la pérdida de peso después de la MCAO14. El protocolo definido aquí, en ratones, con la evitación de la ligadura de la cepa y además analgesia, sugirió una reducción en la pérdida de peso después de MCAO con ningún efecto sobre el volumen de la lesión. El uso de la analgesia es evitar, o al menos no registrado, en la mayoría de los estudios experimentales de la carrera, debido a posibles efectos de confusión sobre los resultados experimentales. Sin embargo, evitando completamente la analgesia no siempre está justificado y es necesario para equilibrar las necesidades de bienestar de los animales con el logro de los objetivos científicos.
Diferencias en el tamaño del animal, cepa y anatomía cerebrovascular, además de variaciones de tamaño y el tipo de filamento, se proponen influir en tiempos resultados23,24. El enfoque alternativo descrito aquí evita la dependencia de la vaca durante la reperfusión, reduciendo así, al menos en parte, la variabilidad entre animales en el volumen de la lesión. Anatomía de la vaca es muy variable en los ratones, en particular en la C57BL /6 cepa, que a menudo se utiliza en estudios experimentales de la carrera. 90% de ratones C57BL/6 tienen una vaca incompleta debido a una variada posterior comunicación arteria (PcomA) la permeabilidad, que puede tener un efecto sobre el volumen de daño isquémico debido a la insuficiente perfusión de estructuras fuera del territorio MCA13, 25. reparación de la CCA en los ratones, como se muestra aquí, se traduce en el restablecimiento de la sangre flujo a través de la CCA en el área isquémico, como se ha descrito en ratas15. Los datos representativos aquí muestran que la reparación de la CCA aumenta la reperfusión, aunque el flujo de sangre en el CCA no se midió directamente. Sin embargo, es posible que el cirujano pueda visualizar la reperfuse CCA con sangre después de la reparación del buque, como vuelve a un estado completo y pulsante a lo largo del tronco, proximal y distal a la localización de la reparación. Esta confirmación visual, junto con las lecturas de flujometría Doppler láser de la zona isquémica, puede utilizarse para confirmar la reparación exitosa de la nave. El tiempo entre la aplicación de la almohadilla de tejido y la eliminación del gancho del buque de la CCA puede tener un impacto sobre la permeabilidad resultante de la CCA, como reducir el tiempo entre la aplicación de la almohadilla de tejido y la eliminación de clip evitará la almohadilla de tejido adherido o frente lado del CCA. Aunque técnicamente difícil, el procedimiento alternativo de MCAO explicado aquí no requiere de ninguna habilidad adicional que los requeridos para llevar a cabo la inducción quirúrgica de MCAO en ratones.
Tradicionalmente asociados con una alta variabilidad en las medidas de resultado, los estudios experimentales de la carrera tenga una tendencia a ser underpowered. Requisitos éticos y de bienestar en combinación con las preocupaciones económicas y práctica pueden contribuir a estudios siendo underpowered. Reduciendo la variabilidad en el resultado y, por lo tanto, producir resultados de lesión más consistentes a través de un grupo experimental, se pueden realizar cálculos de energía más eficaces con el objetivo de los estudios adecuadamente alimentada.
En conclusión, este procedimiento de reparación alternativo del CCA, en ratones, produce menos variabilidad en el volumen de la lesión siguiendo el trazo experimental y cálculos de energía más pequeños grupos experimentales permite que se requerirán para las pruebas de un efecto del tratamiento cuando corresponda se utilizan.

Una de las principales causas de infarto cerebral son la isquemia focal en el territorio de la arteria cerebral media. Activador del plasminógeno tisular (tPA) es el tratamiento sólo farmacológico con eficacia demostrada, a pesar de numerosos ensayos clínicos de drogas dirigido a ictus isquémico1,2. Sin embargo, debido a preocupaciones de seguridad y una estrecha ventana terapéutica (< 4.5 h), sólo el ~ 15% de los pacientes con accidente cerebrovascular son elegible para recibir tPA, y las tasas de recanalización pueden ser < 50%3,4.
Reproducibles y clínicamente relevantes los modelos animales de accidente cerebrovascular se consideran esenciales para informar el desarrollo de tratamientos terapéuticos de tiempos nuevos y potenciales. Sin embargo, debido a las preocupaciones en cuanto a consistencia y variabilidad en los resultados con modelos animales, sigue siendo importante refinar en vivo los modelos existentes para mejorar la traducción de preclínica a la clínica. La falta de traducción de la eficacia preclínica experimental de tratamientos potenciales para uso clínico es una preocupación constante para el movimiento de investigación5. Razones de falta de traducción suelen ser múltiples y pueden estar relacionadas con, por ejemplo, el diseño del ensayo, tratamiento retrasos, heterogeneidad del movimiento clínico, y las limitaciones de los modelos animales utilizan6. Un desafío clave para la investigación del movimiento sigue siendo el desarrollo de tratamientos seguros y eficaces.
Oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) por la inserción del filamento de intramural es el modelo roedor más frecuentemente usado en vivo del movimiento experimental. Este modelo permite la restauración del flujo sanguíneo después de una inducción de isquemia, imitando los sucesos que ocurren en el movimiento humano7. Sin embargo, en particular en los ratones, volúmenes de lesión heterogénea con diferentes desviaciones estándar se producen aunque protocolos quirúrgicos son aplicadas8,9,10. Es típico ver una distribución bimodal de estriado pequeño y grande la lesión cortical striato volúmenes11. Para inducir isquemia, el filamento generalmente se inserta a través de una incisión de la CCA o cepa que luego permanecen permanentemente ligados12. La ligadura permanente de la CCA evita el restablecimiento del flujo sanguíneo en la arteria carótida interna (ACI) y, posteriormente, el territorio del MCA. Esto hace que la reperfusión que dependen de la fuente colateral dentro de círculo de Willis (vaca). La estructura de la vaca tiene variabilidad anatómica entre animales individuales, particularmente en C57BL/6 ratones una cepa típicamente usadas en vivo tiempos investigación13. Un método alternativo de inserción del filamento a través de la ECA, permitir la perfusión continua a través de la CCA, pero compromisos de este método la fuente arterial en el territorio de la cepa, que se ha demostrado, en ratas, a tener un efecto perjudicial sobre el animal bienestar,14.
La dependencia de la vaca para fuente colateral y reperfusión en el modelo establecido de MCAO puede, en parte, explicar la variabilidad del volumen de lesión después de la oclusión. Describimos un procedimiento quirúrgico murino alternativo donde se evita la ligadura de la cepa y la incisión de la CCA se repara, lo que permite reperfusión a través de la CCA, independiente de la vaca. La reparación de la incisión de la CCA ha demostrado previamente en ratas como resultado una reperfusión exitosa a través de la CCA15. Han aplicado este enfoque con éxito en ratones11 y presenta aquí el protocolo que se traduce en una menor variabilidad en el volumen de la lesión, la principal medida de resultado usada en estudios experimentales de la carrera.
En este protocolo, demostramos cómo MCAO se comprometen a través de la inserción de filamento CCA recipiente seguido de CCA buque reparación, que consiste en una aplicación de almohadilla y sellador de tejido para permitir la reperfusión.

<table><tbody><tr><td>Sonda flexible de fibra óptica única de 0,7 mm</td><td>Moor Instruments, Reino Unido</td><td>P10d</td><td>Uso con código de sonda maestra: VP10M200ST</td></tr><tr><td>7-0 monofilamento recubierto de silicona</td><td>Doccol, EE. UU</td>. <td>701956PKRe</td><td>El artículo depende del tamaño y el peso del animal: use las pautas del fabricante. El código de producto aquí se utilizó para los resultados representativos que se muestran en el artículo.</td></tr><tr><td>Sistema de resonancia magnética preclínica 9.4T</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, California, EE. UU</td><td>. MY11520101</td><td>Equipado con bobinas de gradiente y RF adecuadas para la obtención de imágenes del cerebro de ratón</td></tr><tr><td>Equipos de monitoreo y compuerta de animales</td><td>SA Instruments, Stony Brook, Nueva York, EE. UU.</td><td>22124005</td><td>Monitoreo de temperatura y respiración compatible con resonancia magnética</td></tr><tr><td>Servicios Veterinarios Nacionales de Bupivacaína, Stoke-on-trent, Reino Unido</td><td></td><td>512345</td><td>Marcaine</td></tr><tr><td>C57BL/6 Ratones</td><td>Charles River, Oxford, Reino Unido</td><td>B6JSIMA49D</td><td></td></tr><tr><td>Carprofeno</td><td>Norbrook Laboratories 143658</td><td></td><td>Carprieve 5% p/v Solución inyectable para animales pequeños</td></tr><tr><td>Solución limpiadora de manos con clorhexidina al 4%</td><td>VWR International Ltd, Lutterworth, Reino Unido</td><td>MOLN10008780</td><td>HibiScrub Limpiador de manos antimicrobiano, Molnlycke Health Care</td></tr><tr><td>Bastoncillos de</td> <td>algodónServicios Veterinarios Nacionales, Stoke-on-trent, Reino Unido</td><td>213512</td><td>Cualquier cuerpo de plástico, punta de bastoncillo de algodón es adecuado una vez que se esteriliza en autoclave.</td></tr><tr><td>Estereoscopio de disección</td><td>Carl Zeiss</td><td>OPMI99</td><td>Equipo residente. Cualquier estereoscopio de disección binocular capaz de aumentar x1-x5 será adecuado.</td></tr><tr><td>suturas solubles 6-0</td><td>Servicios Veterinarios Nacionales, Stoke-on-trent, Reino Unido</td><td>9544</td><td>Suturas absorbibles Ethicon Vicryl 6/0 recubierto (código Eticon: W9981)</td></tr><tr><td>Soporte de sonda de rosquilla</td><td>Moor Instruments, Reino Unido</td><td>PHDO</td><td>Soporte de sonda para ratón, requerido para ser utilizado con una sonda de fibra óptica única cuando se usa con una máquina de flujo láser doppler.</td></tr><tr><td>pinzas dumont #5</td><td>World Precision Instruments, Hertfordshire, Reino Unido</td><td>500342</td><td></td></tr><tr><td>Sellador de fibrinógeno y trombina</td><td>Baxter, Berkshire, Reino Unido</td><td>1502243</td><td>TISSEEL Soluciones listas para usar para Sellador 2 mL</td></tr><tr><td>Gel food</td><td>Datesand group, Manchester, Reino Unido</td><td>72065022</td><td>Diet Gel Recovery</td></tr><tr><td>Visualización de imágenes y paquete de software de medición</td><td>3D Slicer</td><td>https://www.slicer.org/</td><td>Versión 4.0</td></tr><tr><td>Paquete de software de visualización y medición de imágenes</td><td>NIH, Maryland, EE. UU.</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/index.html</td> Monitor LDF <td>NIH/ImageJ</td></tr><tr><td></td><td>Moor Instruments, Reino Unido</td><td>moorVMS-LDF</td><td></td></tr><tr><td>tijeras micro vannas</td><td>InterFocus Ltd, Linton, Reino Unido</td><td>15000-08</td><td>Otras tijeras de resorte microvannas se pueden usar como alternativa, aunque se requieren puntas finas.</td></tr><tr><td>Pinza microvascular</td><td>World Precision Instruments, Hertfordshire, Reino Unido</td><td>15911</td><td>10 G Clip para vasos</td></tr><tr><td>microvascular Soportes para pinzas microvasculares</td><td>World Precision Instruments, Hertfordshire, Reino Unido</td><td>14189</td><td></td></tr><tr><td>software de adquisición y análisis de resonancia magnética</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, California, EE. UU</td>. <td>VnmrJ Versión 4.2</td><td>Revisión</td></tr><tr><td>A n.º 15 bisturí</td><td>Suministros de laboratorio científico, Nottingham, Reino Unido</td><td>INS4678</td><td>Bisturí estéril n.º 15 - número de fabricante P305. Otros proveedores están disponibles.</td></tr><tr><td>Sutura 6-0 no disolvible</td><td>Servicios Veterinarios Nacionales, Stoke-on-trent, Reino Unido</td><td>W529</td><td>Suturas Ethicon Mersilk</td></tr><tr><td>Lubricante ocular</td><td>Servicios Veterinarios Nacionales, Stoke-on-trent, Reino Unido</td><td>847288</td><td>Lacrilube (5100G13)</td></tr><tr><td>Gel óptico a juego</td><td>Moor Instruments, Reino Unido</td><td>Lector</td> de oximetría de pulso PMG <td></td></tr><tr><td>Starr</td><td>Life Sciences Corp., Oakmont, PA, EE. UU</td>. <td>MouseOx</td><td>MouseOx - rata & oxímetro de pulso de ratón & monitor fisiológico Úselo con el sensor de muslo del ratón.</td></tr><tr><td>Gel de rehidratación</td><td>Datesand group, Manchester, Reino Unido</td><td>70015022</td><td>HydroGel</td></tr><tr><td>Cortapelos pequeños</td><td>vetproductsuk.com</td><td>HS61</td><td>Contura Recortadora/maquinilla inalámbrica</td></tr><tr><td>Solución estéril de NaCl al 0,9 %</td><td>VWR International Ltd, Lutterworth, Reino Unido</td><td>LOCA3528286</td><td>CLORURO DE SODIO AL 0,9% P/V INFUSIÓN INTRAVENOSA BP 500 ML EN ECOFLAC&frac12; Placa</td></tr> de <tr><td>Petri estéril</td> PLUS <td>VWR International Ltd, Lutterworth, Reino Unido</td><td>5168021</td><td>placa de Petri estéril de 50 mm. Cualquier marca es adecuada. Se requiere un diámetro mínimo de 50 mm.</td></tr><tr><td>Adhesivo tisular tópico</td><td>World Precision Instruments, Hertfordshire, Reino Unido</td><td>503763</td><td>GLUture Adhesivo tisular tópico</td></tr><tr><td>Superglue</td><td>Loctite</td><td>Loctite Superglue Precision Max</td><td>Disponible en la mayoría de las ferreterías.</td></tr><tr><td>Chip de papel blanco</td><td>Grupo Datesand, Manchester, Reino Unido</td><td>CS1BPB</td><td>Pure-O'Cel</td></tr></tbody></table>

oclusión de la arteria cerebral media permitiendo la reperfusión mediante la reparación de la arteria carótida común en ratones

Middle Cerebral Artery Occlusion Allowing Reperfusion via Common Carotid Artery Repair in Mice

El ictus isquémico es una causa importante de discapacidad a largo plazo de adultos y la muerte en todo el mundo. Los tratamientos actuales disponibles son limitados, con sólo activador del plasminógeno tisular (tPA) como un tratamiento farmacológico aprobado a accidentes cerebrovasculares isquémicos. La investigación actual en el campo del ictus isquémico se centra en la mejor comprensión de la patofisiología del accidente cerebrovascular, para desarrollar e investigar nuevas dianas farmacéuticas. Modelos de movimiento experimental confiable son cruciales para la progresión de tratamientos potenciales. El modelo de arteria cerebral media oclusión (MCAO) es clínicamente relevante y lo más frecuentemente usado modelo quirúrgico de ictus isquémico en los roedores. Sin embargo, los resultados de este modelo, tales como volumen de la lesión, están asociados con altos niveles de variabilidad, especialmente en ratones. El modelo alternativo de MCAO se describe aquí permite la reperfusión de la arteria carótida común (CCA) y la mayor perfusión del territorio arteria cerebral media (MCA), usar una almohadilla de tejido con sellador a base de fibrinógeno para reparar el buque y la mejor bienestar de los ratones al evitar la ligadura de la arteria carótida externa (CEPA). Esto reduce la dependencia del círculo de Willis, que se sabe para ser altamente anatómico variable en ratones. Datos representativos demuestran que utilizando esta alternativa quirúrgica disminuye la variabilidad en el volumen de la lesión entre el enfoque tradicional de MCAO y el enfoque alternativo descrito aquí.

Un total de 24 adultos C57BL/6 ratones machos, pesan entre 24-31 g en el momento de la cirugía, fueron utilizados en el estudio. Un animal murió tras oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) y uno fue excluido debido a complicaciones quirúrgicas. Los datos presentados aquí son tomados de un trabajo previamente publicado por los autores. Éstos fueron utilizados para ilustrar el efecto de la reparación del buque en MCAO resultados11. Todos los datos se expresan como media ± desviación típica thr. Los datos fueron evaluados estadísticamente para la normalidad mediante la prueba de normalidad de omnibus D'Agostino-Pearson. Datos paramétricos se compararon mediante de Student t-test (para dos medios) y una vía ANOVA con la prueba de Sidak (múltiples medios). Datos no-paramétricos se compararon mediante la prueba U de Mann-Whitney. La variabilidad de los datos paramétricos se evaluó mediante una F-ensayo, y variabilidad de los datos no paramétricos se evaluó mediante la prueba de Levene.
Por lo general, en procedimientos MCAO, el filamento de oclusión se inserta en el CCA y la cepa es ligarse para impedir este filamento que paso en el ECA, en lugar de la ACI. Una evitación de la ligadura de la cepa y la adición de analgesia mostraron una tendencia hacia la pérdida de peso reducida a 48 h post-MCAO, comparados con datos de anteriores estudios realizados por el mismo cirujano para el mismo tiempo MCAO con ligadura de la cepa no analgesia, mientras que el LV aparecían inafectados, vea la figura 1.
Ratones experimentaron una isquemia inducida por MCAO 60 min., seguida de reperfusión con reparación de buque CCA o con la ligadura típica del enfoque CCA. En figura 2se muestra un esquema del CCA reparado ligado y unligated.
Flujometría Doppler láser fue utilizada para confirmar el flujo perfusión de la sangre en el territorio de la MCA en MCAO, antes y después de la reparación del buque CCA. Figura 3 muestra 5 minutos después de la extirpación del filamento, el flujo de sangre cerebral regional (rCBF) aumentado significativamente en la región del cerebro de la MCA. La perfusión se mantuvo hasta la reparación de buques, con un aumento en la perfusión en el territorio del MCA que se muestra después de la reparación del buque CCA, lo que sugiere que la reparación CCA permite una perfusión de sangre creciente al territorio isquémico frente a la dependencia en el círculo de Willis solo.
T2-weighted MRI se utilizó para determinar el total LV, y DTI exploraciones fueron utilizadas para determinar la base del LV, 48 h después de la MCAO. Figura 4A no muestra ninguna diferencia significativa en el LV total o núcleo entre los grupos de procedimiento ligados y reparación. Sin embargo, la variabilidad de los datos para ambos total y base LV, evaluada mediante test de Lavene para no paramétrica o el F-test para datos paramétricos, se redujo significativamente en el grupo de reparación CCA. El LV total se desglosan en LV cortical y subcortical, como se muestra en la Figura 4B. La porción cortical fue significativamente menos variable en el grupo de reparación CCA, mientras que la porción sub cortical de la lesión fue afectada entre los dos grupos de procedimientos.
Un análisis indica que menos animales por grupo de tratamiento sería necesarios para demostrar una reducción del 30% en VI después de MCAO utilizando CCA reparación versus el procedimiento típico de ligarse por el CCA, vea la tabla 1. Una asunción de la energía 1-β = 0.8 y nivel de significación α = 0.05 y una predicción de la reducción de 30% en VI entre el hipotético control y prueba de grupos fueron utilizados para el análisis de poder. Además, se asumió una varianza igual entre los grupos. La tabla 1 muestra el número de animales necesarios para la prueba y los grupos de control cuando se utiliza o el método CCA ligada típico o el método de reparación CCA actualizado, como se describe aquí, se utiliza. Tenga en cuenta que el grupo de prueba se refiere a un hipotético grupo tratado de animales y el grupo de control se refiere a un grupo hipotético control; ambos grupos experimentaría MCAO.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58191/58191fig1v2.jpg"> Figura 1: combinado tratamiento analgesia y la omisión de la ligadura de la cepa en los resultados después de MCAO. (A) de peso corporal, se muestra como un porcentaje del peso pre-MCAO, disminuyó los primeros 2 d después de MCAO para ambos grupos. El grupo cepa unligated (tratados con analgesia con ninguna ligadura de cepa en MCAO) mostró una tendencia hacia la pérdida de peso reducido en el segundo día tras el MCAO. (B) este panel muestra el volumen de la lesión (mm3) medido por el estándar triphenyltetrazolium cloruro (TTC) coloración 48 h después de la MCAO. Los datos son la media ± desviación estándar. Ligada de ECA: n = 17, cepa unligated: n = 10. Esta figura ha sido modificada desde Lucas Trotman et al. 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58191/58191fig1v2large.jpg" target="_blank">por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58191/58191fig2.jpg"> Figura 2: esquema que muestra el método estándar de la CCA y la CCA alternativo reparación método MCAO. (A) este esquema representa un CCA permanentemente ligado utilizando suturas no absorbibles aplicadas a ambos lados de la incisión de la CCA, dando por resultado la ligadura permanente de la CCA derecha. (B) este esquema describe el método de reparación alternativo de CCA. Una almohadilla de tejido pequeño cubierto con el fibrinógeno y sellador de trombina se utiliza para cubrir la incisión de la CCA, sellándolo para permitir la perfusión completa del derecho de CCA. Esta figura ha sido modificada desde Lucas Trotman et al. 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58191/58191fig2large.jpg" target="_blank">por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58191/58191fig3.jpg"> Figura 3: parámetros de flujo (rCBF) de sangre cerebral Regional después de MCAO. El rCBF cambió 5 min después de la retirada del filamento MCAO para ambos el ligarse de CCA y reparado CCA grupos (post-MCAO), en relación con el rCBF medido durante MCAO. Este panel muestra los datos de rCBF inmediatamente antes de la reparación de buque CCA (la reparación) y 5 min después de la reparación de la CCA (reparación posterior). Aumentos significativos en el rCBF aparecen 5 min después del retiro del filamento (post-MCAO) en ambos grupos. Un incremento adicional en el rCBF aparece después de la reparación de la CCA (reparación posterior) en el grupo de reparación CCA. Ninguna diferencia en el rCBF aparece entre 5 min post-MCAO y reparación previa. Los datos mostrados se condensan desde el curso del tiempo datos informes momentos clave, aquí como la media ± desviación estándar. CCA ligada: n = 10, CCA reparado: n = 10; P &lt; 0.01, ***P &lt; 0.001, ns: no significativo. Esta figura ha sido modificada desde Lucas Trotman et al. 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58191/58191fig3large.jpg" target="_blank">por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58191/58191fig4.jpg"> Figura 4: análisis del volumen de lesión obtienen por técnicas de MRI. (A) este panel muestra el volumen de la lesión (LV; mm3) a las 48 h después de MCAO, LV total tomado de imágenes de T2-weighted MRI (LV Total) y el LV de núcleo de DTI exploraciones y análisis (LV base). Imágenes representativas muestran el volumen total de la lesión de una exploración T2 slice imagen con la máscara de volumen de lesión núcleo DTI aplicada. La variabilidad dentro de los grupos se redujo significativamente para ambas total LV (P = 0.015, reparación CCA: n = 10, CCA ligada: n = 10, F-test) y el núcleo del LV (P = 0.043, reparación CCA: n = 9, CCA ligada: n = 6, prueba de Lavene), evaluó mediante una F-ensayo para datos paramétricos o prueba de Levene para datos no paramétricos. (B) este panel muestra el LV a las 48 h después de MCAO, tomado de las imágenes de T2-weighted MRI y dividida en zonas de lesión cortical y subcortical. La reparación CCA redujo significativamente la variabilidad de los datos (P = 0,03, F-test) en la porción cortical de la lesión, pero ningún efecto sobre los datos se muestra variabilidad en la porción subcortical de la lesión. Reparación CCA: n = 10, CCA ligada: n = 10. Los datos son la media ± desviación estándar. # P &lt; 0.05 (F-test), xP &lt; 0.05 (prueba de Lavene). Esta figura ha sido modificada desde Lucas Trotman et al. 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58191/58191fig4large.jpg" target="_blank">por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Enfoque</td>
			<td>Volumen de la lesión (Mm3, LV; media ± d.e.)</td>
			<td>Energía</td>
			<td>Nivel de significancia</td>
			<td>Anticiapted diferencia</td>
			<td>Tamaño de grupo necesaria</td>
		</tr>
<tr>
<td>CCA ligada (enfoque tradicional)</td>
			<td>94.08 ± 53.79</td>
			<td>0,8</td>
			<td>0.05</td>
			<td>30%</td>
			<td>
n = 58</td>
		</tr>
<tr>
<td>CCA reparado (nuevo enfoque)</td>
			<td>51.73 ± 22.78</td>
			<td>0,8</td>
			<td>0.05</td>
			<td>30%</td>
			<td>
n = 35</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Representante análisis comparando la ligadura CCA tradicional con la alternativa CCA reparación método explicado aquí. Esta tabla muestra la potencia del análisis realizado para calcular el tamaño de grupo anticipado requerido para detectar una diferencia significativa en el LV entre un grupo de control, el enfoque tradicional o alternativo (nuevo) y un grupo de prueba (predicho). La tabla muestra los tamaños del grupo como necesaria si se supone una potencia de 0,8, se aplica un nivel de significancia de 0.05, y si el grupo de prueba prevista muestra una diferencia de 30% en el LV en comparación con el grupo de control. La tabla muestra los resultados de ambos enfoques MCAO (CCA-ligarse y reparado el CCA) para determinar si existe una diferencia en el número de animales necesarios para obtener una diferencia de 30% en VI. Para ambos métodos, se supone una varianza igual entre la prueba y el grupo control. Esta figura ha sido modificada desde Lucas Trotman et al. 11.

Obstrucción de filamento intraluminal de la arteria cerebral media es el modelo más frecuentemente utilizado en vivo del movimiento experimental en roedores. Una alternativa quirúrgica para permitir la reparación de la arteria carótida común se realiza aquí, lo que permite la reperfusión de la arteria carótida común y una reperfusión completa para el territorio de la arteria cerebral media.

Oclusión de la arteria Cerebral Media permitiendo la reperfusión mediante la reparación de la arteria carótida común en ratones

The ischemic stroke is a major cause of adult long-term disability and death worldwide. The current treatments available are limited, with only tissue ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de trazo experimental, como cómo reducir asociado con estos modelos y cómo mejorar la reproducibilidad. La principal ventaja de esta técnica es que permite la reperfusión a través de la arteria carótida común, y por lo tanto no depende del círculo de Willis, que puede variar anatómicamente entre los animales, y por lo tanto puede contribuir a la variabilidad observada en las medidas de resultado experimental. La demostración visual de este método es crítica, ya que los pasos de reparación del recipiente CCA son difíciles de aprender debido a la dificultad técnica que implica el uso del sellador para asegurarse de que el CCA es completamente patentado, después de la reparación.Para empezar, preparar y anestesiar el ratón de acuerdo con el protocolo de prueba. Luego usa una cuchilla de bisturí número 15 para hacer una incisión de línea media de 1,5 cm en el cuello ventral expuesto. Usando técnicas de disección contundente, retrae suavemente las glándulas salivales hacia un lado, para exponer la tráquea.Luego disecciona la arteria carótida común, o CCA, libre del tejido circundante y del nervio vagal. Después de esto, pase dos pequeñas secciones de una sutura no disoluble 6-0 por debajo de la CCA, dorsal a la CCA, y ventral al nervio vagal. Dibuje una corbata de seda más cerca del cirujano y átela libremente alrededor de la CCA.A continuación, ate libremente una segunda corbata de seda hacia la bifurcación de las arterias carótidas internas y externas. A continuación, aplique un clip microvascular justo encima de la corbata distal, asegurándose de que la bifurcación no esté obstruida. Utilice tijeras micro venosas para hacer un pequeño agujero en el CCA.Inserte un micro filamento recubierto de silicona 7-0 en el CCA y avance hacia el clip microvascular. A continuación, apriete la corbata distal para fijar el filamento en su lugar. Y utilice los soportes de clip para quitar el clip microvascular.A continuación, avance el filamento hacia la arteria carótida interna, o ICA. Una vez que la cabeza del filamento pase la corbata distal, tire de la corbata más apretada, para evitar la pérdida de sangre. Usando la corbata de seda distal, levante y tire de la CCA hacia el lado externo del cuerpo del ratón, y dirija el filamento a la curva, pasando la abertura de la arteria pterigopalatina, o PPA.Una vez que el filamento esté en su lugar, asegúrelo apretando aún más la corbata de seda distal. Al final del período MCAO, retraiga el filamento hasta que la cabeza del filamento blanco sea claramente visible. A continuación, afloje la corbata distal de CCA lo suficiente para quitar la cabeza del filamento la mayor parte del camino, fuera del recipiente.A continuación, retire completamente la cabeza del filamento del recipiente. Después de esto, coloque un clip microvascular en la posición horizontal, hacia la bifurcación CCA, y al lado de la corbata distal. Luego coloque otro clip debajo de la corbata proximal CCA, hacia el cirujano.Utilice cuidadosamente los fórceps Dumont 5 para eliminar los dos lazos de seda. Y seque la zona con cogollos de algodón estériles. A continuación, agregue las soluciones sellantes de fibrinógeno y trombina uno y dos, a un plato estéril de Petri.Usando tijeras micro venosas y técnica de disección contundente, obtener una fina rebanada ventral de músculo esternocleidomastoideo. Luego, usando fórceps Dumont 5, tome la almohadilla de tejido y mezcle uniformemente a través de las soluciones sellantes fibrinógeno y trombina. Aquí es importante asegurarse de que la almohadilla de tejido es lo suficientemente grande como para cubrir la incisión CCA.Y una vez que se mezcla a través de las dos soluciones, se debe colocar inmediatamente sobre la incisión, para evitar la sobre-coagulación y la mala adherencia. Una vez mezclado entre las dos soluciones, retire la almohadilla de tejido a la incisión CCA. Coloque la almohadilla de tejido plana hacia abajo en la incisión con presión media y abra los fórceps.Retire rápidamente el clip microvascular distal, mientras mantiene la almohadilla de tejido en su lugar. A continuación, aliviar lentamente la presión de la almohadilla de tejido, permitiendo que la sangre fluya debajo del área de la incisión. Ahora, suelte lentamente y suavemente la presión del clip microvascular proximal, luego retírela por completo.La eliminación del clip superior permite que una pequeña cantidad de sangre active el sellador. Una liberación constante del clip distal permite un aumento gradual de la presión en el sitio de la incisión, activando más y ayudando a prevenir una reparación fallida. Finalmente, una vez sellado el recipiente, suturar la herida con suturas dissololubles 6-0.En este protocolo, la oclusión de la arteria cerebral media, o MCAO, se realizó en 24 ratones macho adultos. Una evitación de la ligadura ECA y la adición de analgesia mostró una tendencia hacia la reducción de la pérdida de peso a las 48 horas después de MCAO. Cinco minutos después de la extracción del filamento, el flujo sanguíneo cerebral regional aumentó significativamente en la región cerebral del MCA.La perfusión se mantuvo hasta la reparación del recipiente, con un aumento en la perfusión al territorio MCA, después de la reparación del recipiente CCA. Esto sugiere que la reparación de CCA permitió un aumento de la perfusión sanguínea al territorio isquémico, en comparación con la dependencia del círculo de Willis solo. Se utilizó una resonancia magnética ponderada T2 para determinar el total de exploraciones de LV y DTI para determinar el LV principal a las 48 horas después de la MCAO.No hubo diferencia significativa entre estos dos grupos. Curiosamente, que una variabilidad para el LV total y el núcleo se redujo significativamente en el grupo de reparación CCA. Nuestro análisis indicó que se requeriría menos animales por grupo de tratamiento para demostrar una reducción del 30% en el VI, después de la MCAO, utilizando la reparación de CCA, en comparación con el procedimiento ligado típico de la CCA.Al intentar este procedimiento, es importante recordar asegurarse de que el paquete de tejido es de tamaño suficiente para cubrir la incisión CCA. Además, la velocidad es importante, para evitar que el sellador sobre-coagulante, antes de colocar la almohadilla en el CCA.

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Investigación

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Oclusión filamentosa de la arteria cerebral media es un modelo común para el estudio de ACV isquémico en los ratones.

Modelado de accidente cerebrovascular en ratones - Oclusión arteria cerebral media con el modelo de filamento

El intraluminal de arteria cerebral media oclusión (MCAO) es el modelo más empleado entre los modelos experimentales de ictus isquémico. Aquí vamos a demostrar todo el modelo en detalle con la guía de la flujometría láser Doppler, y sus resultados representativos.

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El medio de oclusión intraluminal modelo cerebral en ratones se presentan en la presente memoria. La extensión del infarto cerebral se evaluó mediante una puntuación neurológica y tinción con violeta de cresilo, una alternativa a la tinción con TTC, que ofrece la gran ventaja de prueba en paralelo marcadores de interés muchos.

Modelo de ratón de MCAO intraluminal: Evaluación del infarto cerebral mediante tinción con violeta de cresilo

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Inducción de isquemia a través de la oclusión de la arteria carótida común y cerebral media en un modelo de rata

Con el fin de entender la fisiopatología del accidente cerebrovascular, es importante utilizar modelos fiables. En este trabajo se va a describir uno de los modelos de accidente cerebrovascular de uso más frecuente en los ratones, llamado el medio modelo de oclusión de la arteria cerebral (MCAO) (también llamado el filamento de sutura intraluminal o modelo) con reperfusión.

Técnica quirúrgica para la oclusión de la arteria cerebral media y la reperfusión del movimiento inducidos en ratones

Describimos un modelo de ratón de accidente cerebrovascular inducido por la oclusión de la arteria cerebral media utilizando una sutura recubierta de silicona. El protocolo se puede aplicar para inducir una oclusión permanente o una isquemia temporal, seguida de reperfusión.

La inducción de ictus isquémico y la isquemia-reperfusión en ratones con la técnica de oclusión de la arteria Medio y Visualización de un infarto Área

Un modelo murino de isquemia-reperfusión cerebral es establecido para investigar la patofisiología del accidente cerebrovascular. Distal, ligar la arteria cerebral media derecha y la arteria carótida común derecha y restablecer el flujo sanguíneo después de 10 o 40 min de isquemia.

Oclusión de los vasos dos ratón modelo de isquemia-reperfusión Cerebral

El protocolo tiene como objetivo proporcionar métodos para la encefalomiosinangiosis (injerto de un colgajo de músculo vascular temporal en la superficie pial del tejido cerebral isquémico) para el tratamiento del accidente cerebrovascular isquémico agudo no moyamoya. La eficacia del enfoque en el aumento de la angiogénesis se evalúa utilizando un modelo transitorio de oclusión de la arteria cerebral media en ratones.

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