Montaje y Seguimiento de Desarrollo Comunitario Microbiano dentro de una Plataforma de Matriz de Micropedulos

El objetivo general de este método es el análisis paralelo de alto rendimiento de comunidades microbianas con múltiples miembros en entornos confinados, mediante el uso de matrices de micropozos de silicio. La principal ventaja de esta técnica es que permite un cribado altamente paralelo y de alto rendimiento de interacciones microbianas finamente localizadas, que son significativas para la industria, la medicina y el medio ambiente. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la ecología microbiana y la biomedicina, como por ejemplo: ¿cómo influyen las restricciones espaciales inherentes a escalas finas en los parámetros deterministas y estocásticos del desarrollo de la comunidad?, y ¿cuáles son los efectos clave sobre la abundancia y organización de los miembros microbianos?

Comience preparando las matrices de micropozos. Primero, corte chips individuales de matriz de micropozos de obleas de silicio impresas con múltiples matrices utilizando un trazador de diamante. Cada chip individual contiene submatrices de pozos con diámetros que varían entre cinco y 100 micrones a tres densidades de espaciado diferentes.

En cada chip, el motivo completo de pozos también se repite cuatro veces. A continuación, prepare una cámara humidificada utilizando una caja para puntas de pipeta y una toallita empapada en PBS. Luego, aplique una gota de 150 microlitros de solución de BSA a cada chip e incube los chips en la caja durante una hora a temperatura ambiente.

Mientras tanto, prepare las bacterias. Centrifugue una cultivo y resuspenda en 500 microlitros de medio R2A fresco con dos por ciento de glicerol. Luego mida la densidad del cultivo a 600 nanómetros y ajuste la concentración a una densidad óptica de 0,02.

Después de la incubación del chip, retire la solución de BSA y enjuague los chips tres veces con PBS. Tras los enjuagues, seque los chips con gas nitrógeno y devuélvalos a la cámara humedecida. A continuación, agregue 150 microlitros de suspensión de cultivo a cada chip seco e incube los chips durante una hora a cuatro grados Celsius para que las bacterias tengan tiempo de adherirse a los pocillos, pero la división celular de cualquier posible contaminante sea lenta.

Para preparar un chip para la obtención de imágenes, primero prepare un cubreobjetos recubierto con agarosa para cada chip. Licúe un pequeño volumen de agarosa; se necesitan aproximadamente cinco mililitros por cubreobjetos. A continuación, lave un lado del cubreobjetos con etanol y colóquelo centrado sobre un portaobjetos, con el lado lavado hacia arriba.

Luego, coloque dos separadores de PDMS de un milímetro de grosor a lo largo de los bordes largos del cubreobjetos y desplace el cubreobjetos de manera que un milímetro quede sobresaliendo del portaobjetos. A continuación, vierta suficiente agarosa sobre el cubreobjetos para cubrirlo completamente. Después, utilice un segundo portaobjetos de vidrio para aplanar la agarosa hasta obtener un espesor uniforme.

Prepare varios de estos conjuntos de portaobjetos simultáneamente. Cuando el agarosa comience a solidificarse, transfiera los conjuntos a cuatro grados Celsius. Tras 15 minutos de enfriamiento, corte el exceso de agarosa alrededor de las laminillas.

Luego, coloque los ensamblajes en placas de Petri y almacénelos a cuatro grados Celsius. Después de que los chips hayan incubado con las bacterias, sumerja los chips en agua ultrapura uno por uno durante 10 segundos cada uno. A continuación, coloque los chips mojados sobre sus bordes encima de un papel absorbente hasta que se haya drenado la mayor parte del líquido.

Ahora, retire las bacterias que no se asentaron en los pocillos. Corte un trozo de cinta del largo del chip de silicio y adhiéralo al recubrimiento de parylene sobre el silicio. Luego, desprenda la cinta para eliminar el recubrimiento de parylene y prepare inmediatamente para invertir el chip.

Ahora, coloque el chip sobre un ensamblaje de portaobjetos de manera que los micropozos estén en contacto con el agarosa. Tenga mucho cuidado de no mover ni desplazar el chip una vez que esté en contacto con el agarosa. A continuación, transfiera el ensamblaje completo al soporte del portaobjetos de una cámara de control ambiental para microscopio y adquiera imágenes de lapso de tiempo durante las próximas 24 horas a intervalos deseados y bajo un aumento de 10x.

Procese las pilas de imágenes utilizando software convencional disponible gratuitamente. Primero, importe la secuencia de imágenes. Para el promediado, cargue las imágenes de corrección o de campo oscuro.

A continuación, realice una sustracción del fondo. Proporcione un valor de radio, como 135 píxeles, y seleccione paraboloide deslizante. Luego, elimine la imagen promedio del campo oscuro de la imagen promedio del campo de iluminación seleccionando ambas imágenes y utilizando la operación de sustracción.

Ahora, aplique una corrección de iluminación de la siguiente manera. Establezca la operación en dividir, configure i1 como la imagen del pocillo, configure i2 como la imagen de corrección, configure k1 como el valor medio de la imagen de corrección y configure k2 como cero. Luego, haga clic en Crear nueva ventana.

Para cuantificar el crecimiento bacteriano en los micropozos, primero seleccione las regiones de interés con el complemento de microarreglo. En el menú de mapa, haga clic en restablecer cuadrícula y especifique las filas, columnas y diámetros de los pozos. Luego, en el menú de forma de ROI, seleccione círculo.

Para ajustar la matriz de ROI a la imagen, se puede mover la matriz de ROI presionando la tecla ALT o ALT+MAYÚS y seleccionando el ROI superior izquierdo con el ratón. Para cambiar el tamaño de los ROI, presione la tecla MAYÚS mientras selecciona la esquina inferior derecha de la matriz de ROI. Para ajustar el espaciado entre los ROI, presione la tecla MAYÚS mientras arrastra el lado superior o inferior de la matriz.

Una vez que la matriz de ROI se ajuste sobre los pocillos de la imagen, haga clic en Medir RT. A continuación, se generará una tabla con todas las mediciones para cada imagen o punto temporal, la cual puede copiarse en una hoja de cálculo para su análisis. Se comparó el crecimiento de dos cepas de Pseudomonas aeruginosa. Una cepa expresa constitutivamente proteínas efectoras tóxicas asociadas con la secreción de tipo seis.

El otro es susceptible a la patogénesis tipo seis debido a la pérdida de función. Ambos expresan una proteína fluorescente diferente. Se estudiaron cultivos mixtos longitudinalmente y en pozos de diferentes tamaños.

Las bacterias se cultivaron individualmente y en co-cultivo. Se realizó la adquisición de imágenes durante 20 horas a intervalos de 30 minutos. Tras realizar correcciones por software en los datos de imágenes, se trazaron trayectorias cuantitativas de crecimiento.

En el cultivo mixto, los datos no indican un cambio muy significativo en el crecimiento. Para avanzar en el análisis, cada trayectoria se ajustó a una función logística modificada con tres parámetros: señal máxima, velocidad máxima y tiempo de latencia. Este análisis sugiere que el cultivo mixto de estas especies tuvo un efecto despreciable en su crecimiento general, y la variabilidad observada en las curvas de crecimiento probablemente se deba a factores ambientales.

Una vez dominado, el montaje puede realizarse en solo unas pocas horas si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante contar con células que crezcan de manera robusta para ajustar adecuadamente los valores finales de densidad óptica celular y obtener capas uniformes de auger en los ensamblajes del chip, además de ser cuidadoso durante el paso de separación del parylene. Tras seguir este procedimiento, preguntas como cómo cambia la expresión génica dentro de cada comunidad en función de la composición y organización de la comunidad pueden abordarse mediante el análisis del material genético.

No olvide que trabajar con Pseudomonas aeruginosa puede ser potencialmente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes, bata, gafas de protección y técnicas asépticas adecuadas al realizar este procedimiento.