Montaje y Seguimiento de Desarrollo Comunitario Microbiano dentro de una Plataforma de Matriz de Micropedulos

El desarrollo de las comunidades microbianas depende de una combinación de factores, incluyendo la arquitectura ambiental, la abundancia de los miembros, los rasgos y las interacciones. Este protocolo describe un ambiente sintético y microfabricado para el seguimiento simultáneo de miles de comunidades contenidas en pozos de femtoliter, donde factores clave como el tamaño de nicho y el confinamiento pueden ser aproximados.

El objetivo general de este método es el análisis paralelo de alto rendimiento de comunidades microbianas de múltiples miembros en entornos confinados utilizando matrices de micropocillos de silicio. La principal ventaja de esta técnica es que permite un cribado altamente paralelo de alto rendimiento de interacciones microbianas finamente localizadas que son significativas para la industria, la medicina y el medio ambiente. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la biomedicina y la ecología microbiana, tales como: ¿cómo las restricciones espaciales inherentes a las escalas finas impulsan los parámetros deterministas y estocásticos del desarrollo de la comunidad, y cuáles son los efectos clave en la abundancia y organización de los miembros microbianos?

Comience con la preparación de las matrices de micropozos. En primer lugar, corte chips individuales de micro pocillos de obleas de silicio impresas con múltiples matrices utilizando un trazador de diamante. Cada chip individual contiene submatrices de pocillos con diámetros que van de cinco a 100 micras a tres densidades de espaciado diferentes.

En cada chip, el motivo completo de los pozos también se repite cuatro veces. A continuación, haga una cámara humidificada con una caja de puntas de pipeta y una toallita empapada en PBS. A continuación, aplique una gota de 150 microlitros de solución BSA a cada chip e incube los chips en la caja durante una hora a temperatura ambiente.

Mientras tanto, prepare las bacterias. Centrifugar un cultivo y volver a suspenderlo en 500 microlitros de medio R2A fresco con dos por ciento de glicerol. A continuación, mida la densidad de cultivo a 600 nanómetros y ajuste la concentración a una densidad óptica de 0,02.

Después de la incubación de las virutas, retire la solución de BSA y enjuague las virutas tres veces con PBS. Después de los enjuagues, seque las virutas con gas nitrógeno y devuélvalas a la cámara humidificada. A continuación, agregue 150 microlitros de suspensión de cultivo a cada chip seco e incube los chips durante una hora a cuatro grados centígrados para que las bacterias tengan tiempo de adherirse a los pocillos, pero la división celular de cualquier posible contaminante sea lenta.

Para preparar un chip para la obtención de imágenes, primero haga un cubrebocas recubierto de agarosa para cada chip. Licuar un pequeño volumen de agarosa, se necesitan unos cinco mililitros por cada cubreobjetos. A continuación, lave un lado de un cubreobjetos con etanol y céntrelo en un portaobjetos de vidrio con el lado lavado hacia arriba.

A continuación, coloque dos espaciadores PDMS de un milímetro de grosor a lo largo de los bordes largos del cubreobjetos y desplácelo de modo que cuelgue un milímetro del portaobjetos. Ahora, vierta suficiente agarosa en el cubreobjetos para cubrirlo por completo. Luego use un segundo portaobjetos de vidrio para aplanar la agarosa en un grosor uniforme.

Prepare varios conjuntos de correderas de este tipo en paralelo. Cuando la agarosa comience a solidificarse, transfiera los ensamblajes a cuatro grados centígrados. Después de 15 minutos de enfriamiento, recorte el exceso de agarosa alrededor de los cubreobjetos.

Luego, coloque los ensamblajes en placas de Petri y guárdelos a cuatro grados centígrados. Después de que las papas fritas se hayan incubado con las bacterias, sumerja las papas fritas en agua ultrapura una a la vez durante 10 segundos cada una. A continuación, coloque las patatas fritas húmedas en sus bordes sobre un pañuelo de papel hasta que se haya escurrido la mayor parte del líquido.

Ahora, elimine las bacterias que no se depositaron en los pozos. Corta un trozo de cinta adhesiva de la longitud del chip de silicona y adhiérelo a la capa de parileno sobre la silicona. A continuación, retire la cinta para eliminar la capa de parileno e inmediatamente prepárese para invertir el chip.

Ahora, coloque el chip en un conjunto de corredera de modo que los micropocillos estén en contacto con la agarosa. Tenga mucho cuidado de no mover o mover el chip una vez que esté en contacto con la agarosa. Ahora, transfiera el conjunto completo al soporte de portaobjetos de una cámara de control ambiental superior al escenario y adquiera imágenes de lapso de tiempo durante las próximas 24 horas en el intervalo deseado y con un aumento de 10x.

Procese las pilas de imágenes utilizando software convencional y de libre acceso. En primer lugar, importe la secuencia de imágenes. Para promediar, cargue la corrección o las imágenes de campo oscuro.

A continuación, realice una resta de fondo. Proporcione un valor de radio, como 135 píxeles, y seleccione paraboloide deslizante. A continuación, elimine la imagen de campo oscuro promedio de la imagen de campo de iluminación promedio seleccionando las dos imágenes y utilizando la operación de restar.

Ahora, aplique una corrección de iluminación de la siguiente manera. Establezca la operación en dividir, establezca i1 en la imagen del pozo, establezca i2 en la imagen de corrección, establezca k1 en la media de la imagen de corrección y establezca k2 en cero. A continuación, haga clic en Crear nueva ventana.

Para cuantificar el crecimiento bacteriano en los micro pocillos, primero seleccione las regiones de interés con el complemento de micro matriz. En el menú del mapa, haga clic en restablecer cuadrícula y especifique las filas, las columnas y los diámetros de los pozos. A continuación, en el menú de formas ROI, seleccione círculo.

Para ajustar la matriz de ROI a la imagen, la matriz de ROI se puede mover presionando la tecla ALT o ALT+SHIFT y seleccionando el ROI superior izquierdo con el mouse. Para cambiar el tamaño de los ROI, presione la tecla Mayús mientras selecciona la parte inferior derecha de la matriz de ROI. Para ajustar el espaciado entre las ROI, presione la tecla Mayús mientras arrastra la parte superior o inferior de la matriz.

Una vez que la matriz de ROI se ajuste a los pocillos de la imagen, haga clic en Medir RT. A continuación, se generará una tabla con todas las mediciones de cada imagen o punto de tiempo y se podrá copiar en una hoja de cálculo para su análisis. Se comparó el crecimiento de dos cepas de Pseudomonas aeruginosa. Una cepa expresa constitutivamente proteínas efectoras tóxicas asociadas con las secreciones de tipo seis.

El otro es susceptible a la patogénesis de tipo seis debido a la pérdida de función. Ambos expresan una proteína fluorescente diferente. Los cocultivos se estudiaron longitudinalmente y en diferentes tamaños de pozos.

Las bacterias se cultivaron individualmente y como co-cultivo, y se obtuvieron imágenes de 20 horas de crecimiento en intervalos de 30 minutos. Después de realizar correcciones de software en los datos de imagen, se trazaron las trayectorias de crecimiento cuantitativo.

En la cocultura, los datos no sugieren un cambio excesivo en el crecimiento. Para avanzar en el análisis, cada trayectoria se ajustó a una función logística modificada con tres parámetros, señal máxima, velocidad máxima y tiempo de retraso. Este análisis sugiere que el cocultivo de estas especies tuvo un efecto insignificante en su crecimiento general y su variabilidad observada en las curvas de crecimiento se debe probablemente a factores ambientales.

Una vez dominado, la configuración se puede ejecutar en solo unas horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante tener celdas de crecimiento robusto para ajustar adecuadamente los valores finales de diámetro exterior de la celda para tener capas de barrena uniformes en los ensamblajes de chips y tener cuidado durante el paso de despegue del parileno. Siguiendo este procedimiento, el análisis de material genético puede abordar preguntas como cómo cambia la expresión génica dentro de cada comunidad en función de la composición y organización de la comunidad.

No olvide que trabajar con Pseudomonas aeruginosa puede ser potencialmente peligroso, y siempre se deben usar precauciones como guantes, chaqueta, gafas y técnicas asépticas adecuadas al realizar este procedimiento.