Evaluación del impacto de la agregación de proteína sobre el estrés oxidativo celular en levaduras

El objetivo general de este procedimiento es determinar la relación entre la formación de agregados proteicos intracelulares y su impacto sobre el estrés oxidativo celular utilizando la levadura de panadería Saccharomyces cerevisiae. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las enfermedades de mal plegamiento y agregación de proteínas, como los trastornos neurodegenerativos y las amiloidosis no neuropáticas. La principal ventaja de esta técnica es que es sencilla, rápida y permite cuantificar el daño del estrés oxidativo celular en una gran población de levaduras.

Con este método, podemos proporcionar información sobre la correlación entre el estado soluble o agregado intracelular de una proteína amiloidogénica con los niveles de estrés oxidativo en levaduras. Además, también se puede aplicar a otros organismos modelo que expresan proteínas recombinantes. La demostración del análisis de citometría de flujo correrá a cargo de Manuela Costa, técnica del Servicio de Citometría de Flujo de la UAB.

En este estudio, se rastrea el estado de agregación intracelular de diferentes variantes del péptido A-beta-42 utilizando S. cerevisiae transformado con un plásmido que codifica para A-beta-42 fusionado con GFP bajo el control de un promotor inducible por galactosa. Elija una colonia de las células de levadura transformadas e inocule en 20 mililitros de medio SC menos Ura que contenga 2% de glucosa. Cultive el cultivo a 30 grados centígrados bajo agitación durante la noche.

Al día siguiente, inocule 100 microlitros del cultivo durante la noche en cinco mililitros de medio SC fresco menos Ura, y cultive las células a 30 grados Celsius durante dos o tres horas. Cuando el cultivo se encuentra a una densidad óptica de 590 nanómetros o DE 590 de 0,5, centrifugar el cultivo a 3.000 veces g durante cuatro minutos, desechar el sobrenadante y resuspender las células en cinco mililitros de medio SC fresco menos Ura que contenga 2% de rafinosa. Incubar las células a 30 grados centígrados bajo agitación durante 30 minutos.

Después de 30 minutos, centrifugue las células a 3.000 veces g durante cuatro minutos, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en un medio SC fresco menos Ura que contenga 2% de galactosa para inducir la expresión de proteínas recombinantes. Regrese las células a la incubadora durante 16 horas. Después de 16 horas, recoja las células transfiriendo alícuotas de un mililitro del cultivo a tubos de microcentrífuga estériles y centrifugando a 3.000 veces g durante cuatro minutos.

Comience este procedimiento determinando el OD 590 de las células de levadura inducidas durante 16 horas. A continuación, diluya las células en PBS estéril hasta un DE 590 de 0,1. Transfiera las suspensiones de células de extracción a tubos de poliestireno de fondo redondo debidamente etiquetados y protéjalos de la luz.

Preparar células no inducidas como control negativo para el análisis de citometría de flujo. Agregue la sonda de estrés oxidativo a cada muestra a una concentración final de cinco micromolares. Cubra las muestras con papel de aluminio e incube a 30 grados centígrados durante 30 minutos.

Una vez finalizada la incubación, centrifugar las células, eliminar el sobrenadante y volver a suspender los gránulos de células en PBS. Lave las células tres veces de esta manera con PBS. Después del tercer lavado, vuelva a suspender las células en el mismo volumen de PBS.

Asegúrese de que las células no teñidas estén incluidas en el análisis de citometría de flujo. Utilizando los láseres y filtros adecuados, realice el análisis de citometría de flujo para detectar GFP y la señal fluorescente de la sonda de estrés oxidativo. Comience haciendo clic en el panel Abrir nueva hoja de trabajo y asigne un nombre al experimento.

En la barra de herramientas, seleccione la herramienta Diagrama de dispersión y cree un gráfico con las variables Área de dispersión lateral en el eje Y frente Área de dispersión directa en una escala lineal en el eje X. Haga clic en la herramienta Diagrama de dispersión y cree una gráfica con las variables Área FITC en el eje x frente a Área APC en una escala logarítmica en el eje y. Haga clic en el icono Configuración del instrumento y establezca todos los niveles de compensación en cero en la pestaña Compensación.

A continuación, haga clic en la pestaña Adquisición y seleccione un número total de 20.000 eventos para registrar con un caudal bajo. Debido a que la señal de emisión fluorescente de un fluorocromo puede ser detectada por otro detector, es importante realizar un proceso de compensación para igualar la señal mínima de cada fluorocromo en todos los detectores mediante un control de un solo color. Cambie el nombre del tubo 001 a control negativo y haga clic en la pestaña Adquirir para comenzar a ejecutar las células no inducidas y sin teñir.

Ajuste el voltaje en la configuración del instrumento de la dispersión frontal y lateral hasta que la población se distribuya en el cuadrante central izquierdo. Haga clic en el icono Polígono para establecer una región R1 alrededor de la población de celdas, excluyendo los restos de celdas, y use esta población cerrada P1 igual a R1 para todos los diagramas de puntos fluorescentes y representaciones de histograma. Para ajustar el voltaje PMT de la señal de fluorescencia, ejecute las celdas sin teñir en el diagrama de puntos FL1 a FL3, ajustando la ganancia en la pestaña Configuración del instrumento, hasta que las celdas se distribuyan en el cuadrante inferior izquierdo.

Con la herramienta Diagrama de dispersión, cree un diagrama de puntos con las variables FITC-A en el eje x frente a FSC-A y un segundo diagrama de puntos con las variables APC-A en el eje x frente a FSC-A. A continuación, cambie la muestra a las células inducidas para medir la fluorescencia de GFP. En la pestaña Configuración del instrumento, establezca la ganancia en el FSC-A frente al FITC cuando la población se distribuye en el cuadrante inferior derecho.

Defina la población de células GFP positivas con una puerta. Cambie la muestra a las células teñidas no inducidas. Visualización del estrés oxidativo por fluorescencia en un diagrama de puntos FSC-A frente a APC-A.

Ajuste la ganancia hasta que la población de células se distribuya en el cuadrante superior izquierdo. Controlar la población de células positivas en P3. Con el icono Histograma, cree dos gráficos de histograma para representar la fluorescencia de la célula, uno para FITC y otro para la fluorescencia APC. Cree una tabla que muestre la intensidad fluorescente media y la fluorescencia mediana con su correspondiente error estándar y/o el coeficiente de varianza para la fluorescencia GFP y los niveles de estrés oxidativo.

Haga clic en la pestaña Compensación y establezca todos los niveles de compensación en cero. Haga clic en la pestaña Adquisición y seleccione un número total de 20.000 eventos para registrar. Prepare tres nuevos tubos de muestras y nómbralos no inducidos, solubles inducidos e inducidos agregados.

Adquiera datos de las muestras con los ajustes preestablecidos. Analice los datos abriendo una nueva hoja y creando un diagrama de puntos para las variables FITC-A y APC-A, comprobando las celdas positivas para la tinción de CellROD. Para cada muestra, cree una tabla estadística con la fluorescencia media y el error estándar para los canales FITC y APC.

También es posible clasificar las células con un clasificador FACS siguiendo el recuento de proteínas agregadas. Las células de levadura que expresan variantes de A-beta-42 después de un período de inducción de 16 horas se visualizan bajo un microscopio de fluorescencia para determinar la distribución de proteínas recombinantes dentro de las células. Estas imágenes son representativas de variantes seleccionadas de A-beta-42 GFP.

La formación de inclusiones proteicas, o PI, se confirmó en 10 de las 20 variantes de la colección analizada. Este gráfico de barras indica el porcentaje de células que contienen diferentes números de PI calculado a partir de un total de 500 células fluorescentes para cada variante en réplicas biológicas. Se observó una excelente concordancia entre las propiedades de agregación predichas e in vivo.

Los niveles de expresión de proteínas en extractos celulares se cuantificaron utilizando un anticuerpo A-beta específico. Como tendencia general, las variantes A-beta-42 formadoras de PI, coloreadas en verde, están presentes en niveles más bajos que las distribuidas difusamente en el citosol, coloreadas en rojo. Se observaron diferencias importantes entre las variantes de A-beta-42 cuando se representaron sus propiedades de fluorescencia de la sonda de estrés oxidativo, los niveles de proteínas y la fluorescencia de GFP en relación con su capacidad para formar PI y sus propensiones de agregación intrínsecas predichas por el algoritmo bioinformático AGGRESCAN o TANGO.

Las variantes formadoras de PI están en verde y las variantes no formadoras de PI están en rojo. Siguiendo este procedimiento, también se pueden realizar otros métodos, como el yoduro de propidio o la tinción con anexina V, para responder a preguntas adicionales, como determinar el impacto de una variante de proteína expresada intracelular en la apoptosis celular o la citotoxicidad.