El análisis de microarrays para Saccharomyces cerevisiae

El objetivo general de este procedimiento es introducir a los estudiantes de ciencias de pregrado a la tecnología de microarrays mediante el examen de las diferencias de expresión en levaduras sometidas a estrés oxidativo. Esto se logra aislando primero el ARN total de los cultivos de levadura tratados con peróxido de hidrógeno y los controles no tratados. El segundo paso del procedimiento es generar y purificar CDNA a partir de estas muestras de ARN.

A continuación, el CDNA se utiliza para preparar el ARNC marcado con biotina mediante transcripción in vitro. El paso final del procedimiento es la fragmentación de los CRNA marcados con biotina para la hibridación con los chips genéticos de levadura AFI metrics. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran las diferencias de expresión en las dos muestras de levadura y, a través de la bioinformática, demuestran el poder del análisis de microarrays a los estudiantes de pregrado.

El equipo de Vermont Genetics Network Outreach tuvo por primera vez la idea de este método cuando se les encargó la tarea de entregar tecnología de microrrayos a los estudiantes de ciencias de todo el estado de Vermont para mejorar su educación científica. Hasta la fecha, este método se ha entregado en múltiples sitios en ocho colegios de bachillerato en todo el estado. Por lo tanto, la principal ventaja de usar microrrayos en los módulos de enseñanza es que nos da la capacidad de enseñar técnicas generales de biología molecular que se utilizan todos los días en todo el laboratorio a un grupo de personas.

Y también podemos usar esto para enseñar a estudiantes y maestros por igual y a nuestros grupos. De hecho, tenemos estudiantes y profesores trabajando juntos en el mismo proyecto. Aprenden ciertas técnicas que requieren mucha delicadeza, como el manejo del ARN, que no es una tarea fácil.

Aprenden a precipitar el ADN utilizando reactivos de visualización. De hecho, pueden utilizar las técnicas que van a encontrar en los estudios de posgrado o en los laboratorios de biología molecular de todos los días. Aunque este método es adecuado para obtener información sobre el estrés oxidativo y la levadura, ciertamente es aplicable a otros organismos modelo y otros sistemas biológicos que desee observar.

La expresión génica cambia, ya sea que estén asociados con cambios en el desarrollo, toxinas ambientales, estados de enfermedades específicos y muchos más. Para examinar las diferencias de expresión en levaduras sometidas a estrés oxidativo, primero se extrae ARN total de dos cultivos de levadura mediante lisis enzimática. Un cultivo se expuso a estrés oxidativo mediante un tratamiento de una hora con peróxido de hidrógeno de 0,5 milimolares en solución salina tamponada de Hank, mientras que el otro cultivo se trató solo con HBSS como control.

Comience etiquetando dos tubos de microcentrífuga de 1,7 mililitros con la información de identificación adecuada. Transfiera 1,5 mililitros del cultivo de levadura apropiado a cada tubo. Centrifugar los tubos a 5.000 Gs durante dos minutos a temperatura ambiente.

Después de la centrifugación, utilice una micropipeta para retirar y desechar con cuidado el sobrenadante sin alterar el pellet. Compruebe que el pellet es lo suficientemente grande antes de continuar con el procedimiento. Si el pellet es demasiado pequeño, agregue 1,5 mililitros de cultivo en el mismo tubo que contiene el pellet y luego centrifugue para obtener un pellet más grande.

Deseche el sobrenadante con una micropipeta, eliminando la mayor cantidad de líquido posible del pellet de levadura. A continuación, añada 100 microlitros de tampón SG y 30 microlitros de solución de liasa al vórtice de pellets de levadura para mezclar. Incube ambos tubos durante 30 minutos a temperatura ambiente durante la incubación.

Agite suavemente cada tubo cada 10 minutos para generar platos. Uno de los pasos más críticos cuando se realiza el recubrimiento de levadura es asegurarse de que realmente se ha creado un plast Sphero al cien por cien después del tratamiento. Eso significa que no todas las enzimas líticas son iguales.

Por lo tanto, debe verificar para asegurarse de que una buena enzima lítica le brinde una buena placa de esferón, lo que significa que debe tomar estas muestras, colocarlas en un portaobjetos de microscopio y verificar bajo el microscopio agregando 0.1% SDS para asegurarse de que tenga formación de protoplastos. Para observar el recubrimiento completo de esfero, pipetee 10 microlitros de la muestra de levadura en un portaobjetos de microscopio mientras examina la muestra bajo el microscopio a un microlitro de 0,1% SDS para hacer que las células de levadura se hinchen y formen esferas perfectas o esferoides. Es importante observar que las células en ciernes también forman esferoides S.

Si se observa un recubrimiento parcial de esfero, se recomienda un tratamiento prolongado con liase. Una vez que se haya confirmado la finalización de la enchapado de esfero a 350 microlitros de tampón BRLT en cada tubo, agregue 250 microlitros de etanol al 100%. Asegúrese de que el tubo esté bien tapado manteniendo la tapa cerrada y el vórtice vigorosamente durante un minuto.

Este procedimiento cortará los dientes de Sphero. Después de esto, use las columnas de espín R y Z fáciles para recolectar y limpiar el ARN de los dos cultivos. Por último, evaluar la calidad del ARN extraído utilizando gel de aros prefabricado al 1,2% para electroforesis para preparar ARNc marcado con biotina.

El ARN total extraído de las células de levadura se utiliza primero para sintetizar CD NA mediante transcripción inversa. Después de la generación de CD NA, prepare los tubos de gel de bloqueo de fase para su uso en los tubos de gel de bloqueo de fase centrífugos de precipitación CD NA a toda velocidad durante un minuto para asegurarse de que el gel esté en el fondo del tubo. No agite los tubos de bloqueo de fase en vórtice para precipitar la pipeta CD NA de 162 microlitros de la capa inferior de una mezcla de fenil cloroformo, alcohol isoamílico o PCI tamponada con pH 8.0 y agregue a los contenidos de 162 microlitros de la segunda hebra, se requieren volúmenes iguales de mezclas acuosas y orgánicas para este paso.

Vórtice durante cinco segundos para mezclar el contenido. A continuación, utilice una micropipeta, transfiera toda la mezcla CD N-A-P-C-I al tubo de gel de bloqueo de fase. No agite la centrífuga de tubo de gel de bloqueo de fase a toda velocidad durante dos minutos.

A continuación, utilice una micropipeta para transferir la capa superior del tubo de gel de bloqueo de fase a un tubo de 1,7 mililitros recién etiquetado. Trate de recolectar la mayor cantidad posible de la capa. Agregue lo siguiente al tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitros, 405 microlitros de etanol al 100%, 80 microlitros de acetato de amonio y un microlitro de vórtice de pintura en pellets.

Coloque brevemente el tubo en la centrífuga con la bisagra del tubo hacia afuera y centrifugue a toda velocidad durante 20 minutos. A temperatura ambiente, cuando se complete la centrifugación, retire suavemente el tubo de la centrífuga teniendo cuidado de no alterar el pellet de CD NA. La bolita debe ser rosada debido a la pintura de pellets y aproximadamente del tamaño de un grano de sal.

Y en el lado del tubo debajo de la bisagra, coloque el pellet CD NA sobre hielo y proceda inmediatamente a limpiar el pellet. Para comenzar el procedimiento de limpieza del pellet CD NA, utilice una micropipeta P 1000 para eliminar con cuidado todo el sobrenadante del tubo. Tenga cuidado de no alterar el pellet.

Es su muestra a 500 microlitros de etanol frío al 80% por tubo. Tape suavemente el tubo e inviértalo lentamente varias veces. Observe su pellet muy de cerca para asegurarse de que no se desprenda del costado del tubo.

Si el pellet se desprende, puede devolverlo al fondo del tubo colocando el tubo de nuevo en la rejilla y dejando que el pellet se asiente en el fondo o centrifugando el tubo a toda velocidad durante 15 segundos. A continuación, utilice una micropipeta P 1000 para extraer con cuidado el etanol sin alterar el pellet. Incline el tubo para permitir la extracción de la mayor cantidad de líquido posible.

Agregue un nuevo Eloqua de etanol frío, 80%, tape el tubo e inviértalo lentamente varias veces. Después de eliminar todo el etanol posible mediante el uso de una micropipeta P 1000. Centrifuga el tubo a toda velocidad durante cinco segundos.

A continuación, utilice una micropipeta P 10 para eliminar los últimos microlitros de etanol sin alterar el pellet. Coloque el tubo abierto en una caja de secado durante 10 a 20 minutos para evaporar el etanol restante. El pellet se pierde fácilmente una vez que está seco, así que tenga cuidado de manipular el tubo con cuidado y cerrar la tapa.

Cuando termine el secado, visualice el pellet seco para confirmar que está presente en el tubo. Finalmente, vuelva a suspender el pellet seco en 22 microlitros de agua libre de ARN y coloque el tubo sobre hielo. A continuación, este CDNA se utiliza para preparar CRNA marcado con biotina mediante transcripción in vitro utilizando el kit Enzo BioArray.

Una vez que se ha limpiado y cuantificado el ARNC marcado con biotina, se fragmenta para la preparación del objetivo. Una vez que se ha generado el CDNA, utilizamos la metodología estándar de transcripción in vitro para generar CRNA biotinilado. El CRNA necesita pasar por la fragmentación antes de que pueda aplicarse al chip de microrayos.

Para comenzar este procedimiento, transfiera una cantidad equivalente a cinco microgramos de ARNC a un tubo de PCR de 0,5 mililitros marcado. Agregue suficiente ARN de agua libre para llevar el volumen total a 16 microlitros, y luego agregue cuatro microlitros de cinco tampones de fragmentación al tubo. El volumen total del tubo debe ser de 20 microlitros.

Agite el tubo y centrifugue durante 10 segundos. Luego incube el tubo a 94 grados centígrados durante 30 minutos. En un termociclador, coloque el tubo en hielo después de la incubación.

A continuación, se evalúa el ARNC fragmentado y no fragmentado de cada muestra mediante electroforesis utilizando un gel AROS prefabricado al 1,2%. Cuando se completa la ejecución, el gel se visualiza en un transluminador y se adquiere una imagen. El producto final de la síntesis se hibrida con los chips genéticos de levadura átrica y aquí se muestran los resultados representativos del análisis de microarrays.

Esta primera figura es un ejemplo de una imagen escaneada de un chip genético de levadura atrics generada por el software operativo del chip genético atrics. Se trata de un diagrama de dispersión en 2D de todas las transcripciones genéticas, unos 6.700 genes que comparan los datos de control y los de levadura tratada. Cada punto representa un solo gen.

Los genes coloreados en púrpura indican genes que se expresan diferencialmente, mientras que los genes coloreados en rojo no lo están. En este ejemplo, la mayoría de los genes expresados diferencialmente son los implicados en el control del ciclo celular, como indican sus descripciones. Este diagrama de flujo de la base de datos para la visualización de anotaciones y el descubrimiento integrado ilustra los genes expresados diferencialmente en una vía biológica afectada.

Los genes indicados con una estrella roja indican los genes regulados a la baja en la vía miótica. Finalmente, se muestran los resultados representativos de un diagrama volcánico generado utilizando el software de tamiz genético de especies geográficas. Las muestras control y tratadas se compararon con un valor de corte P de 0,05 y un punto de corte de cambio de expresión de 1,5 veces.

Elegimos usar levadura porque la levadura es fácil de cultivar rápidamente, pero también nos dimos cuenta de que la parte más crítica de trabajar con levadura es en realidad crear un recubrimiento de esfero decente. Una de las cosas que no queremos hacer en los microarrays es hacer una digestión incompleta y, en realidad, solo células de esferón que estén en una fase G uno o G dos M. Y luego estás haciendo un experimento de microarrays en levaduras que están en una determinada fase de replicación.

Otro punto complicado que tratamos de recalcar en este ejercicio es que la peletización de CD NA se habla todos los días, pero no es necesariamente fácil. Y lo que hemos hecho en nuestro módulo es que hemos utilizado tubos especializados y reactivos de visualización. Por lo tanto, podemos reducir el ADN y se puede visualizar la apelación, lo que facilita las cosas tanto para los estudiantes como para los profesores.

Por lo tanto, se puede utilizar en todas las fases del trabajo de ADN y ARN después de su desarrollo. Este módulo realmente ha allanado el camino para que los profesores de los institutos de Bachillerato exploren, posiblemente observando otros organismos modelo u otros regímenes de tratamiento que puedan ser compatibles con los planes de estudio existentes o posiblemente con sus propios intereses de investigación. Y para dar un ejemplo de algunas de las modificaciones que se hicieron, había un sitio que había analizado los efectos del tratamiento con herbicidas en la levadura u otro que analizaba el tratamiento con LAMP IDE en levadura, mientras que otro sitio analizaba los cambios en el desarrollo de una línea celular de mamíferos en los que estaban particularmente interesados.

Y, por último, otro sitio había analizado el impacto de las fuentes de luz diferenciales en la arabidopsis o las plantas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo configurar un experimento de microrrayos con estudiantes de ciencias de pregrado, incluido el aislamiento del ARN total de la levadura, la generación de CDNA y la fragmentación de la biotina marcada con CRNA. Las experiencias prácticas con tecnologías de tan alto nivel ayudan a reforzar y fortalecer la educación científica de pregrado.