Detección altamente sensible y cuantitativa de las proteínas y sus isoformas por método capilar isoeléctrica

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación biomédica, como el descubrimiento de biomarcadores, el descubrimiento de fármacos, el diagnóstico y el cribado de medicamentos o anticuerpos. La principal ventaja de esta técnica es que es de alto rendimiento y puede detectar isoformas proteicas de una manera altamente reproducible. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico de muchas enfermedades porque puede medir las proteínas afectadas o sus isoformas.

Aunque este método puede proporcionar información sobre las vías de señalización celular, también se puede aplicar a otros sistemas donde es necesario analizar proteínas específicas. La demostración visual de este método es crítica, ya que los pasos del ensayo son difíciles de aprender debido a los trucos, como la eliminación de burbujas, la carga de la placa, etc. En primer lugar, preparar una mezcla de diluyente de muestra añadiendo un microlitro de mezcla inhibidora de DMSO y dos microlitros de inhibidores de la proteasa a 47 microlitros de diluyente de muestra, de modo que la concentración final de DMSO e inhibidores de la proteasa sea de un lysate de proteína previamente aislado X.Dilute utilizando la mezcla diluyente de muestra para obtener las concentraciones deseadas.

A continuación, añada 3.325 microlitros de escalera estándar, seis microlitros de inhibidor de la proteasa y tres microlitros de inhibidor de DMSO a 137.675 microlitros de premezcla de antolita. Vórtice la muestra al menos 15 segundos y manténgase en hielo. Mezclar las dos soluciones preparadas en una proporción de uno a tres para que las concentraciones finales de inhibidores de la proteasa DMSO y la escalera estándar de punto isoeléctrico sean una X y las proteínas en el capilar alcancen las concentraciones finales deseadas.

Después de que las proteínas se añaden a la mezcla de muestra, todos los pasos se realizarán en hielo o a cuatro grados Celsius. Coloque una placa de 384 pozos sobre hielo. Cargue diez microlitros de la mezcla de muestras en el pozo adecuado de la placa, de acuerdo con el diseño de la plantilla de ensayo diseñada con el software automatizado del sistema de hinchazón Occidental.

Después de esto, diluir los anticuerpos primarios y secundarios con diluyente de anticuerpos. A continuación, pipetear diez microlitros de anticuerpos primarios y 15 microlitros de anticuerpos secundarios en cada pozo. A continuación, mezcle luminol y peróxido XDR en una proporción de uno a uno.

Pipeta 15 microlitros de la mezcla de peróxido de luminol en cada pozo. Una vez que las muestras y las ruedas se han añadido a la placa, centrifugar durante diez minutos a 2500 veces G y cuatro grados Celsius para girar el líquido y eliminar las burbujas. Si aún existen burbujas, retírelas manualmente con una punta de pipeta delgada.

Abra el software automatizado del sistema de hinchazón occidental y haga clic en new'from the file menu. Vaya al panel de diseño y asigne ubicaciones para reagants y samples en la placa de 384 pozos. Haga una tarea reagant haciendo clic en un pozo en cualquier parte del bloque.

Seleccione un bloque de filas de 12 pozos cada uno. A continuación, vaya a la barra de herramientas del panel de diseño e inserte un bloque de filas de muestra, primario, secundario o luminol. Vaya al panel de protocolo y seleccione una ubicación reagant en la placa.

A continuación, haga clic en la celda de la columna de ejemplo y seleccione el reagant en el menú desplegable. De la misma manera, seleccione las ubicaciones reagant para el primario, secundario y luminol para cada ciclo. Haga clic en las celdas de una en una en la columna de anticuerpos primarios o secundarios y cambie los tiempos de incubación si es necesario.

A continuación, agregue ciclos haciendo clic en el botón Agregar en la sección de protocolo. En el panel de plantillas, escriba información relativa a la muestra, como la identidad de los anticuerpos primarios y secundarios, sus números de catálogo y diluciones. Guarde el nuevo archivo de ensayo.

Antes de hacer clic en el botón de inicio, compruebe rápidamente el diseño para asegurarse de que todo es correcto. Ahora, haga clic en start'to begin the run. El software le pedirá al usuario que retire los residuos, que rellene el agua y la caja capilar, que agregue anolita y catolita a la bandeja de recursos, que agregue el búfer de lavado y que cargue la placa en la bandeja de muestras enfriada.

Se mostrará una barra de estado del instrumento en la pantalla del ordenador un par de minutos después de que se haya iniciado la ejecución. Haga clic en la pantalla de resumen de ejecución para ver los paneles de estado y separación. Para observar la separación de electroforesis en un capilar, reproduzca la película de separación para ese capilar haciendo clic en el ciclo deseado y luego haciendo clic en el botón de reproducción en el panel de control.

Abra el archivo de ejecución y seleccione la pestaña de la pantalla de análisis. Haga clic en editar' y luego análisis'para cambiar el rango de puntos isoeléctricos. Aplique el estándar de punto isoeléctrico adecuado.

Agregue un ajuste máximo y agregue un nombre de pico. Por último, seleccione los datos que desea utilizar en la pestaña Picos y exporte los datos para su análisis posterior. Aquí se muestra el electroferograma de quinasas extracelulares reguladas por señal extracelular fosforiladas a partir de licatos estimulados por factor de crecimiento endotelial vascular.

Hay muy alta inducción de proteínas fosforiladas observadas con factor de crecimiento endotelial vascular. El inserto muestra el control de carga endógeno, HSP 70, que indica una carga similar de muestras para muestras no tratadas y tratadas. En un inmunoblot convencional, sólo se detectaron dos bandas, a pesar de que las proteínas quinasas reguladas por señal extracelular fosforilada se resolvieron en cuatro picos mediante un análisis de enfoque isoeléctrico capilar.

Aquí se muestra el electroferograma de quinasas extracelulares reguladas por señal de licato estimulados por factor de crecimiento endotelial. El recuadro muestra el mismo control de carga utilizado en paralelo. Un inmunoblot convencional muestra sólo dos bandas correspondientes a la quinasa regulada por señal extracelular una y la quinasa extracelular regulada por señal dos.

Mientras que con el enfoque isoeléctrico capilar, las proteínas quinasas reguladas por señal extracelular se resolvieron en seis picos, correspondientes a los cuatro picos fosforilados diferentes y dos picos no fosforilados. Una vez masterada, esta técnica se puede hacer en pocas horas, dependiendo del número de ciclos, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar utilizar concentraciones de anticuerpos más altas en comparación con los inmunoblots convencionales.

La demostración visual de este método es crítica, ya que los pasos del ensayo son difíciles de aprender debido a trucos, como eliminar burbujas, cargar la placa, etc. Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo diseñar un ensayo, preparar muestras, ejecutar el ensayo, y analizar los datos para observar diferentes isoformas de su proteína.