Los enfoques experimentales para estudiar mitocondrial localización y función de un ciclo celular quinasa nuclear, Cdk1

El objetivo general del siguiente procedimiento es determinar la localización submitocondrial de una quinasa del ciclo celular normalmente nuclear y luego analizar cómo su localización mitocondrial afecta la progresión del ciclo celular. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación mitocondrial, como la forma en que el núcleo se comunica con las mitocondrias durante el ciclo celular. Al marcar proteínas con una secuencia principal de mitocondrias, podemos aprovechar específicamente las sobreexpresiones en las proteínas de las mitocondrias, por lo que podemos estudiar sus funciones específicas de las mitocondrias.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la orientación de las mitocondrias a ciertas proteínas, también se puede aplicar a los otros orgánulos, como el núcleo, ER, Golgi y un lisosoma. Después de cultivar, homogeneizar y peletizar las células de acuerdo con el protocolo de texto, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo. Y centrifugar la muestra a 7.000 g y 4 grados centígrados durante 10 minutos.

A continuación, utilice 200 microlitros de tampón IBC helado para resuspender el pellet y divida el homogeneizado en dos alícuotas. Centrifugar las muestras de nuevo a 7.000 g y 4 grados centígrados durante 10 minutos. Y repita el lavado.

Después de desechar el sobrenadante, agregue 30 microlitros de tampón de lisis celular a uno de los gránulos y almacene el lisado a 80 grados Celsius para el inmunotransferencia. Para realizar la extracción de carbonato de sodio con el segundo pellet para separar las proteínas solubles y unidas a la membrana, agregue 250 microlitros de carbonato de sodio 0.1 molar pH 11.0 e incube en hielo durante 30 minutos. Centrifugar a 100.000 g durante 20 minutos.

A continuación, recoja el sobrenadante y añada un volumen igual de ácido tricloroacético al 20% recién hecho para precipitar las proteínas. Mantener en hielo durante 30 minutos. Mientras tanto, agregue 30 microlitros de tampón de lisis celular al pellet y sonique de acuerdo con el protocolo de texto antes de almacenar a 80 grados Celsius para inmunotransferencia.

Después de la incubación de TCA de 30 minutos, centrifugar la reacción a 15.000 g durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante, luego use 80 microlitros de tampón de lisis celular para resuspender el pellet. Después de aislar las fracciones mitocondriales de las células como se describe en el protocolo de texto, separe las fracciones mitocondriales en 10 porciones iguales.

Granular las muestras a 7.000 g y 4 grados centígrados durante 10 minutos. Utilice 30 microlitros de un rango de concentraciones de tampones de sacarosa hipotónica con o sin tripsina, para disolver cada gránulo. E incubar en hielo durante 30 minutos.

Agregue 3 microlitros de PMSF de 10 milimolares a los viales que contienen tripsina para detener la digestión de la tripsina. E incubar en hielo durante 10 minutos. Centrifugar las muestras a 14.000 g y 4 grados centígrados durante 10 minutos.

Y transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo. Para lisar el pellet, agregue 30 microlitros de tampón de lisis celular. Sonicar las muestras como se describe en el protocolo de texto y almacenarlas a 80 grados centígrados.

Para construir vectores de ciclina B-1 Cdk-1 marcados con GFP/RFP para mitocondrias, clonar la secuencia de diana mitocondrial a partir del precursor de la subunidad 8A de la citocromo-c oxidasa humana y enmarcar con el n-terminal de GFP o RFP en los sitios Nhe1 y bAmH1, de pEGFP-N1 o pERFP-N1, utilizando técnicas de clonación molecular estándar. Utilizando los cebadores descritos en el protocolo de texto, amplifique los genes Cdk1 y ciclina B1 siguiendo técnicas estándar. A continuación, utilice BamH1 para digerir los productos de PCR.

Ejecute las reacciones en un gel de agarosa al 1%, antes de usar una cuchilla de afeitar para cortar los fragmentos de ADN del tamaño correcto. A continuación, utiliza un kit de extracción en gel para purificar el ADN. A continuación, digiera un microgramo de plásmidos MTS-pEGFP-N1 y MTS-pERFP-N1 con 1 microlitro de BamH1 a 37 grados centígrados durante 2 horas.

A continuación, añadir 1 microlitro de fosfatasa alcalina intestinal de ternera e incubar a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Después de ejecutar los productos de digestión en un gel de agarosa al 1% y purificar el ADN como se acaba de describir, configure una reacción de ligadura utilizando los reactivos enumerados en el protocolo de texto. Luego incube la reacción a 4 grados centígrados durante la noche.

Transforme las células competentes de e. coli dH5-alfa con 10 microlitros de la mezcla de ligadura. Y cultive las bacterias en placas de agar LB más 10 miligramos por mililitro de kanamicina a 37 grados centígrados durante la noche.

Al día siguiente, utilice una punta de pipeta estéril para recoger una colonia de un plato. E inserte la punta en un tubo que contenga 5 mililitros de kanamicina LB. Incube el cultivo durante la noche y a la mañana siguiente, use un mini kit de preparación de acuerdo con el protocolo de texto para aislar el plásmido.

Para producir células MCF-10A en crecimiento exponencial, utilice plásmidos Cdk1 o ciclinaB-1 para preparar el reactivo de transfección de plásmidos en una proporción de 1:2 en 100 microlitros de suero y medio libre de antibióticos. Transfectar las células e incubar a 37 grados centígrados durante 48 horas. Tiñe y visualiza las mitocondrias de acuerdo con el protocolo de texto.

Para llevar a cabo la clasificación de células, transfecte 2 veces 10 a la quinta celda con los vectores deseados en una placa de 6 pocillos utilizando una proporción 1:2 de ADN a reactivo de tranfección preparado en 2,5 mililitros de suero y medio libre de antibióticos. Después de incubar la transfección durante 48 horas, utilice la citometría de flujo para clasificar en vivo las células que expresan de forma estable las proteínas Cdk-1 marcadas con GFP y clyclinB1 marcadas con RFP de acuerdo con el protocolo de texto. Para medir la longitud del ciclo celular utilizando el ensayo de citometría de flujo de marcaje EdU, las semillas clasificaron las células en placas de 6 pocillos a una densidad de 2,5 veces 10 a la quinta celda por pocillo.

Después de una incubación nocturna, agregue EdU al medio de cultivo a una concentración final de 25 micromolares e incube durante una hora adicional. Luego, a intervalos de dos horas, use 1% de BSA en 500 microlitros de PBS para lavar un pocillo de células. Y recoger en un tubo de 1,5 mililitros.

Centrifugar las células a 350 g durante 5 minutos. A continuación, deseche el sobrenadante. Desaloje el pellet agregando 100 microlitros de solución de fijación.

Mezclar bien e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos. A continuación, use 1 mililitro de 1%BSA en PBS para lavar las celdas tres veces. A continuación, utilice 0,5 mililitros de etanol al 70% para fijar las células a 4 grados centígrados durante la noche.

Al realizar el marcaje de EdU con células transfectadas con proteínas marcadas con GFP y RFP, es fundamental apagar las señales fluorescentes de GFP y RFP. Para lograr esto, agregamos un paso adicional de fijación celular durante la noche con etanol al 70%. Al día siguiente, después de lavar y permeabilizar las células según el protocolo de texto, agregue 0,5 mililitros de cóctel de reacción en cada tubo y mezcle bien.

Después de la incubación en la oscuridad y otro lavado, use 50 microgramos por mililitro de yoduro de propidio o PI en 1%BSA PBS para teñir el ADN. Analice las células mediante citometría de flujo para seguir a la población EdU positiva. Presentar un diagrama de puntos disperso de células marcadas con EdU teñidas para el contenido de ADN y EdU.

Use el canal APC para Alexa 647 EdU utilizando un filtro 670 de paso de banda de 30 con toda la luz presente, menos de 685 nanómetros que golpean ese filtro y el canal de ficoeritrina para PI con un filtro de paso de banda 581 de 15 frente a él, con toda la luz presente de menos de 600 nanómetros que golpean ese filtro. Con una estrategia de compuerta estándar para la adquisición, trace el área de FSC por área de SSC para la morfología, seguida de PI por Alexa 647 EdU para la tinción celular. Registre los datos de todos los tubos uno por uno, adquiriendo 10.000 eventos por muestra.

En esta figura, se utilizaron la proteína de la matriz mitocondrial Hsp60 y la proteína del espacio intermembrana Timm13 como marcadores de localización submitocondrial. Al igual que con Hsp60, pero a diferencia de Timm13, las ciclinas B1 y Cdk1 estaban protegidas de la digestión de la tripsina, lo que indica que se localizan en la matriz mitocondrial. Como se muestra aquí, mediante Western blot de las fracciones mitocondriales aisladas, utilizando las construcciones de ciclina B1 y Cdk-1 marcadas con MTS y GFP, se logró la sobreexpresión de ciclina B1 y/o Cdk-1 en las mitocondrias.

Utilizando un ensayo de seguimiento de pulso EdU, se demostró que las células de la fase S marcadas progresaban a través de la fase G2M y aparecían en la fase G1 tan rápido como 4 horas en células que expresaban la ciclina mitocondrial de tipo salvaje B1 Cdk-1. En comparación con 6 horas, en células transfectadas con un control vectorial o ciclina mutante B1 Cdk-1, lo que indica que el aumento de la ciclina mitocondrial B1 Cdk-1 acelera la progresión del ciclo celular. Siguiendo este procedimiento, se pueden medir otros métodos como la generación de ATP mitocondrial, el consumo de oxígeno, el potencial de membrana y las especies reactivas de oxígeno para responder a preguntas adicionales como cómo la localización mitocondrial de la quinasa del ciclo celular Cdk-1 altera la respiración mitocondrial y la producción de energía.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo estudiar la localización mitocondrial y las funciones específicas de las mitocondrias de una quinasa nuclear.