Name: Los enfoques experimentales para estudiar mitocondrial localización y función de un ciclo celular quinasa nuclear, Cdk1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 15 s
Description: Aprende a estudiar la localización mitocondrial de la quinasa Cdk1 y sus funciones específicas en la matriz mitocondrial mediante marcaje con secuencias de direccionamiento. Este método permite analizar cómo la localización mitocondrial afecta la progresión del ciclo celular.

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Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los NIH CA133402, CA152313 y la Oficina de Ciencia DE-SC0001271 del Departamento de Energía. Agradecemos al Laboratorio de Recursos Compartidos de Citometría de Flujo Davis de la Universidad de California con fondos del CA0933730 NCI P30 y las subvenciones de los 026825 NCRR C06-RR12088, S10 RR12964 y S10 RR de los NIH y con la asistencia técnica de la Sra. Bridget McLaughlin y el Sr. Jonathan Van Dyke por su ayuda con los experimentos de citometría de flujo.

<ol><li>Weinert, T., Hartwell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+G2+delay+by+the+rad9+gene+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci+Suppl%22%5BJournal%5D)">Control of G2 delay by the rad9 gene of Saccharomyces cerevisiae.</a> J Cell Sci Suppl. 12, 145-148 (1989).</li>
<li>Takizawa, C. G., Morgan, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+mitosis+by+changes+in+the+subcellular+location+of+cyclin-B1-Cdk1+and+Cdc25C%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of mitosis by changes in the subcellular location of cyclin-B1-Cdk1 and Cdc25C.</a> Curr Opin Cell Biol. 12 (6), 658-665 (2000).</li>
<li>Allan, L. A., Clarke, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+caspase-9+by+CDK1%2Fcyclin+B1+protects+mitotic+cells+against+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of caspase-9 by CDK1/cyclin B1 protects mitotic cells against apoptosis.</a> Mol Cell. 26 (2), 301-310 (2007).</li>
<li>Cerveny, K. L., Tamura, Y., Zhang, Z., Jensen, R. E., Sesaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mitochondrial+fusion+and+division%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of mitochondrial fusion and division.</a> Trends Cell Biol. 17 (11), 563-569 (2007).</li>
<li>Brandt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+converting+NADH%3Aquinone+oxidoreductase+%28complex+I%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Energy converting NADH:quinone oxidoreductase (complex I).</a> Annu Rev Biochem. 75, 69-92 (2006).</li>
<li>Hofhaus, G., Weiss, H., Leonard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopic+analysis+of+the+peripheral+and+membrane+parts+of+mitochondrial+NADH+dehydrogenase+%28complex+I%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Electron microscopic analysis of the peripheral and membrane parts of mitochondrial NADH dehydrogenase (complex I).</a> J Mol Biol. 221 (3), 1027-1043 (1991).</li>
<li>Weiss, H., Friedrich, T., Hofhaus, G., Preis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+respiratory-chain+NADH+dehydrogenase+%28complex+I%29+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">The respiratory-chain NADH dehydrogenase (complex I) of mitochondria.</a> Eur J Biochem. 197 (3), 563-576 (1991).</li>
<li>Janssen, R. J., Nijtmans, L. G., van den Heuvel, L. P., Smeitink, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+complex+I%3A+structure%2C+function+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Inherit+Metab+Dis%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial complex I: structure, function and pathology.</a> J Inherit Metab Dis. 29 (4), 499-515 (2006).</li>
<li>Roessler, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+assignment+of+EPR+spectra+to+structurally+defined+iron-sulfur+clusters+in+complex+I+by+double+electron-electron+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Direct assignment of EPR spectra to structurally defined iron-sulfur clusters in complex I by double electron-electron resonance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (5), 1930-1935 (2010).</li>
<li>Owusu-Ansah, E., Yavari, A., Mandal, S., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+mitochondrial+retrograde+signals+control+the+G1-S+cell+cycle+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Distinct mitochondrial retrograde signals control the G1-S cell cycle checkpoint.</a> Nat Genet. 40 (3), 356-361 (2008).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+B1%2FCdk1+coordinates+mitochondrial+respiration+for+cell-cycle+G2%2FM+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Cyclin B1/Cdk1 coordinates mitochondrial respiration for cell-cycle G2/M progression.</a> Dev Cell. 29 (2), 217-232 (2014).</li>
<li>Omura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria-targeting+sequence%2C+a+multi-role+sorting+sequence+recognized+at+all+steps+of+protein+import+into+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mitochondria-targeting sequence, a multi-role sorting sequence recognized at all steps of protein import into mitochondria.</a> J Biochem. 123 (6), 1010-1016 (1998).</li>
<li>Konishi, T., Takeyasu, A., Natsume, T., Furusawa, Y., Hieda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+heavy+ion+tracks+by+labeling+3%27-OH+termini+of+induced+DNA+strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Visualization of heavy ion tracks by labeling 3'-OH termini of induced DNA strand breaks.</a> J Radiat Res. 52 (4), 433-440 (2011).</li>
<li>Leif, R. C., Stein, J. H., Zucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short+history+of+the+initial+application+of+anti-5-BrdU+to+the+detection+and+measurement+of+S+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A short history of the initial application of anti-5-BrdU to the detection and measurement of S phase.</a> Cytometry A. 58 (1), 45-52 (2004).</li>
<li>Li, K., Lee, L. A., Lu, X., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+%27click%27+reaction+for+labeling+and+detection+of+DNA+in+proliferating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic 'click' reaction for labeling and detection of DNA in proliferating cells.</a> Biotechniques. 49 (1), 525-527 (2010).</li>
<li>Kondo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+sensitive+fluorescent+dyes+in+linkage+of+laser+microdissection+and+two-dimensional+gel+electrophoresis+as+a+cancer+proteomic+study+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Application of sensitive fluorescent dyes in linkage of laser microdissection and two-dimensional gel electrophoresis as a cancer proteomic study tool.</a> Proteomics. 3 (9), 1758-1766 (2003).</li>
<li>Gundry, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+10%2C+Preparation+of+proteins+and+peptides+for+mass+spectrometry+analysis+in+a+bottom-up+proteomics+workflow%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chapter 10, Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow.</a> Curr Protoc Mol Biol. , Unit 10.25(2009).</li>
<li>Davies, D. Chapter 11, Cell Sorting by Flow Cytometry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDavies%2C+D+%22Flow+Cytometry%22">Flow Cytometry</a>. Macey, M. G. , Humana Press. 257-276 (2007).</li>
<li>van den Heuvel, S., Harlow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+cyclin-dependent+kinases+in+cell+cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for cyclin-dependent kinases in cell cycle control.</a> Science. 262 (5142), 2050-2054 (1993).</li>
<li>Terry, N. H. A., White, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+after+bromodeoxyuridine+labeling+to+measure+S+and+G2%2BM+phase+durations+plus+doubling+times+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protcols%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry after bromodeoxyuridine labeling to measure S and G2+M phase durations plus doubling times in vitro and in vivo.</a> Nat. Protcols. 1 (2), 859-869 (2006).</li>
<li>Becker, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preprotein+translocase+of+the+outer+mitochondrial+membrane%3A+reconstituted+Tom40+forms+a+characteristic+TOM+pore%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane: reconstituted Tom40 forms a characteristic TOM pore.</a> J Mol Biol. 353 (5), 1011-1020 (2005).</li>
<li>Karniely, S., Pines, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+translation--dual+destination%3A+mechanisms+of+dual+protein+targeting+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Single translation--dual destination: mechanisms of dual protein targeting in eukaryotes.</a> EMBO Rep. 6 (5), 420-425 (2005).</li>
<li>Candas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CyclinB1%2FCdk1+phosphorylates+mitochondrial+antioxidant+MnSOD+in+cell+adaptive+response+to+radiation+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">CyclinB1/Cdk1 phosphorylates mitochondrial antioxidant MnSOD in cell adaptive response to radiation stress.</a> J Mol Cell Biol. 5 (3), 166-175 (2013).</li>
<li>Nantajit, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+B1%2FCdk1+phosphorylation+of+mitochondrial+p53+induces+anti-apoptotic+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cyclin B1/Cdk1 phosphorylation of mitochondrial p53 induces anti-apoptotic response.</a> PLoS One. 5 (8), e12341(2010).</li>
<li>Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+based+on+click+chemistry%2C+which+overcomes+limitations+of+cell+cycle+analysis+by+classical+determination+of+BrdU+incorporation%2C+allowing+multiplex+antibody+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A novel method based on click chemistry, which overcomes limitations of cell cycle analysis by classical determination of BrdU incorporation, allowing multiplex antibody staining.</a> Cytometry A. 73 (7), 626-636 (2008).</li>
<li>Niwa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+nature+of+the+light+emitter+of+the+Aequorea+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemical nature of the light emitter of the Aequorea green fluorescent protein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (24), 13617-13622 (1996).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Marouga, R., David, S., Hawkins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+DIGE+system%3A+2D+fluorescence+difference+gel+analysis+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">The development of the DIGE system: 2D fluorescence difference gel analysis technology.</a> Anal Bioanal Chem. 382 (3), 669-678 (2005).</li>
<li>Timms, J. F., Cramer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Difference+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Difference gel electrophoresis.</a> Proteomics. 8 (23-24), 4886-4897 (2008).</li>
<li>Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCrane%2C+J+%22BD+Biosciences+Appl+Notes%22">BD Biosciences Appl Notes</a>. , (2011).</li>
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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Al igual que las proteínas destinadas a otros orgánulos subcelulares, las proteínas mitocondriales dirigida poseen señales de orientación dentro de su estructura primaria o secundaria que los dirigen hacia el orgánulo con la ayuda de elaborada de translocación de proteínas y plegadoras 21,22. Las mitocondrias de orientación secuencias (MTS) obtenidos a partir de las proteínas residentes exclusivamente mitocondriales tales como COX8 se pueden añadir al extremo N-terminal de cualquier secuencia de genes a prote...

En los mamíferos, la progresión del ciclo celular depende de eventos altamente ordenadas controlados por ciclinas y quinasas dependientes de ciclina (CDK) 1. A través de su citoplasmática, nuclear, y la localización centrosómicas, CyclinB1 / Cdk1 es capaz de sincronizar diferentes eventos en la mitosis tales como rotura de la envuelta nuclear y la separación del centrosoma 2. CyclinB1 / Cdk1 protege a las células contra la apoptosis mitótico 3 y promueve la fisión mitocondrial, un paso crítico para una distribución equitativa de las mitocondrias de las células hijas recién formadas 4. En la proliferación de células de mamíferos, mitocondrial ATP se genera a través de la fosforilación oxidativa (OXPHOS) maquinaria (cadena de transporte de electrones), que se compone de 5 complejos de múltiples subunidades; complejo I - complejo V (IC-CV). Nicotinamida adenina dinucleótido (NADH): ubiquinona oxidorreductasa o complejo I (CI) es la más grande y menos comprendido de los cinco complejos 5. El complejo consists de 45 subunidades, 14 de los cuales forman el núcleo catalítico. Una vez montado, el complejo adopta una estructura en forma de L con un brazo que sobresale en la matriz y el otro brazo incrustado en el 6,7 membrana interna. Las mutaciones en las subunidades de CI son la causa de una variedad de trastornos mitocondriales 8. Se requiere un CI funcionalmente eficiente en la fosforilación oxidativa, no sólo para la respiración mitocondrial general 9, sino también para la progresión del ciclo celular con éxito 10. Desentrañar los mecanismos que subyacen al funcionamiento de este complejo enzimático unido a la membrana en la salud y la enfermedad podría permitir el desarrollo de nuevos procedimientos de diagnóstico y estrategias terapéuticas avanzadas. En un estudio reciente, se ha encontrado que el complejo CyclinB1 / Cdk1 se transloca a la mitocondria en el G2 (mitosis) fase M (Gap 2) / y fosforila subunidades IC para mejorar la producción de energía mitocondrial, potencialmente, para compensar el aumento de las necesidades de energía de las células durante celular ciclo de 11. Aquí nos Showcase procedimientos experimentales y las estrategias que se pueden utilizar para estudiar la translocación mitocondrial de quinasas de otro modo núcleo / citoplasma, sus sustratos mitocondrial, así como consecuencias funcionales de su localización mitocondrial usando CyclinB1 / Cdk1 como un ejemplo. El hallazgo de que el complejo CyclinB1 / Cdk1 se transloca a la mitocondria cuando sea necesario se le solicite los estudios de sobreexpresión y desmontables de este complejo-mitocondria específica. Para conseguir la expresión-mitocondria específico de proteínas, se puede añadir una secuencia de mitocondrias de orientación (MTS) en el N-terminal de la proteína de interés. Las mitocondrias de orientación secuencias permiten la clasificación de las proteínas mitocondriales en las mitocondrias, donde residen normalmente 12. Hemos utilizado una secuencia dirigida a las mitocondrias 87 de base procedentes del precursor de la citocromo oxidasa subunidad humana c 8A (COX8) y se clonó en Green Fluorescent Protein (GFP)-etiquetados CyclinB1 o rojo fluorescenteProteína (RFP)-etiquetados Cdk1 que contiene plásmidos en el marco. Este método nos ha permitido también identificar los CyclinB1 y Cdk1 en la mitocondria, cambiando específicamente la expresión mitocondrial de estas proteínas sin afectar a su piscina nuclear. Mediante el etiquetado con fluorescencia estas proteínas, hemos sido capaces de controlar su localización en tiempo real. Del mismo modo, hemos introducido MTS en un plásmido que contiene RFP-etiquetados dominante Cdk1 negativo, lo que permitió a la detonación específicamente por la expresión mitocondrial y funciones de Cdk1. Es esencial distinguir entre las funciones mitocondriales y nucleares de las quinasas que tienen localizaciones duales como Cdk1. Ingeniería MTS en el N-terminal de estas quinasas duales funcionales ofrece una gran estrategia que es fácil de ser empleado y eficaz. Desde Cdk1 es un ciclo celular quinasa, es fundamental para determinar la progresión del ciclo celular cuando Cdk1 se localiza en las mitocondrias. Para lograr esto, hemos utilizado un nuevo method para supervisar el contenido de ADN en las células. Los métodos tradicionales incluyen el uso de BrdU (bromodesoxiuridina), un análogo de timidina sintético, que incorpora en el ADN recién sintetizado durante la fase S del ciclo celular para sustituir timidina. A continuación, las células que están replicando activamente su ADN se pueden detectar usando anticuerpos anti-BrdU. Una desventaja de este método es que requiere la desnaturalización del ADN para proporcionar acceso para el anticuerpo BrdU por métodos agresivos como tratamiento con ácido o calor, que pueden resultar en inconsistencia entre los resultados de 13,14. Alternativamente, se utilizó un enfoque similar para monitorear las células que se dividen activamente con un análogo de la timidina diferente, edu. EdU detección no requiere desnaturalización del ADN duras como tratamiento detergente suave permite que el reactivo de detección para acceder a la UDE en el ADN recién sintetizado. El método EdU ha demostrado ser más fiable, consistente y con un potencial de análisis de alto rendimiento 15. Finalmente, to determinar los sustratos mitocondriales de Cdk1, se utilizó una herramienta de proteómica llamado 2D-DIGE, que es una versión avanzada de la electroforesis bidimensional en gel clásico. Dos electroforesis dimensional separa las proteínas en función de su punto isoeléctrico en la primera dimensión y el peso molecular en el segundo. Desde modificaciones post-traduccionales tales como fosforilación afectan el punto isoeléctrico y el peso molecular de las proteínas, geles 2D pueden detectar las diferencias entre los estados de fosforilación de las proteínas dentro de las diferentes muestras. El tamaño (área e intensidad) de la proteína de spots de cambios con el nivel de expresión de las proteínas, lo que permite la comparación cuantitativa entre múltiples muestras. Usando este método, hemos sido capaces de diferenciar las proteínas fosforiladas en el tipo salvaje frente a las células que expresan Cdk1 mitocondrias orientada mutantes. Se aislaron las manchas de proteínas específicas que mostraron en el tipo salvaje, pero faltaban en el mutante preparación Cdk1 mitocondrias y las orientadas poridentificado mediante espectrometría de masas. En los geles en 2D tradicionales, colorantes de trifenilmetano se utilizan para visualizar las proteínas en el gel. 2D-DIGE utiliza etiquetas de la proteína fluorescente con un efecto mínimo sobre la movilidad electroforética de proteínas. Diferentes muestras de proteína pueden ser marcadas con diferentes colorantes fluorescentes, mezclados entre sí y separadas por los geles idénticos, lo que permite la co-electroforesis de múltiples muestras en un solo gel 16. Esto minimiza las variaciones de gel a gel, lo cual es un problema crítico en estudios de proteómica a base de gel.

<table><tbody><tr><td>32P ATP&nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU002001MC&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario anti-ratón</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>A-11003</td><td>Alexa-546 anticuerpo</td></tr><tr><td>secundario anti-conejo</td> conjugado <td>Invitrogen&nbsp;</td><td>A11029</td><td>Alexa-488</td></tr><tr><td>ATP</td> conjugado <td>Research Organics</td><td>1166A</td><td>Para ensayo de quinasa in vitro</td></tr><tr><td>Anticuerpo Cdk1</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>9112</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de quinasa Cdk1</td><td>New England Biolabs</td><td>P6020S</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Kit de imágenes</td><td>Life Technologies</td><td>C10337</td><td>Para el análisis del ciclo celular con etiquetado EdU</td></tr><tr><td></td><td>Tecnología de señalización celular</td> de anticuerpos COX IV <td>4844S</td><td>para inmunotinción mitocondrial</td></tr><tr><td>Anticuerpo de ciclina B1</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-752</td><td></td></tr><tr><td>Complejo enzimático CyclinB1/Cdk1</td><td>New England Biolabs</td><td>P6020S</td><td>Evite la congelación/descongelación</td></tr><tr><td>CyDye DIGE Kit de etiquetado con flúor</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>25-8009-83</td><td></td></tr><tr><td>DIGE Gel y kit de tampón DIGE</td><td>GE Ciencias de la Vida para el Cuidado de la Salud</td><td>28-9480-26 AA</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilformamida&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>319937</td><td>DMF</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0611</td><td>DTT</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>EMD Millipore</td><td>71004</td><td>Para mutagénesis</td></tr> dirigida al sitio <tr><td>Enzima Dpn I</td><td>Stratagene</td><td>200519-53</td><td>Para mutagénesis dirigida</td></tr><tr><td>al sitio Fluido de cobertura de tira seca</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-1335-01</td><td>Utilizado como aceite mineral</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>J.T. Baker</td><td>4040-03</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros Organics</td><td>409910250</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Concentrador de vacío</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-748-13</td><td>Utilizado como concentrador de centrífuga al vacío</td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td>Solución de montaje antidecoloración</td></tr><tr><td>Fortessa Citómetro de flujo BD</td><td>Biosciences</td><td>649908</td><td>Para el ciclo celular análisis con marcaje EdU</td></tr><tr><td>Histone H1</td><td>Calbiochem</td><td>382150</td><td>Para ensayo de quinasa in vitro</td></tr><tr><td>QIAquick Kit de extracción de gel</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Para purificar fragmentos de ADN de geles de agarosa</td></tr><tr><td>Geles Immobiline DryStrip GE</td><td>Healthcare Life Sciences</td><td>18-1016-61</td><td>Tiras IEF (enfoque isoeléctrico)</td></tr><tr><td>Glutatión inmovilizado</td><td>Thermo Scientific</td><td>15160</td><td>Perlas de glutatión-agarosa</td></tr><tr><td>Yodoacetamida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I1149</td><td>IAA</td></tr><tr><td>IPGphor 3 Unidad de enfoque isoeléctrico</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>11-0033-64</td><td>Soportes de tiras IPGphor</td></tr><tr><td>Isopropil-b-D-tio-galactopiranósido&nbsp;</td><td>RPI Corp</td><td>156000-5.0</td><td>IPTG</td></tr><tr><td>Leupeptina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9783</td><td>Para tampón de lisis celular</td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668027</td><td>Reactivo de transfección</td></tr><tr><td>Lysine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5501</td><td>Para el etiquetado CyDye</td></tr><tr><td>Lisozyme</td><td>EMD Chemicals</td><td>5960</td><td></td></tr><tr><td>Mitoctracker Rojo/Verde</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>M7512/M7514</td><td>Colorantes fluorescentes mitocondriales</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>EMD Chemicals</td><td>6310</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-N1</td><td>Clonetech</td><td>6085-1</td><td>Vector que expresa GFP</td></tr><tr><td>Pfu</td><td>Stratagegene</td><td>600-255-52</td><td></td></tr><tr><td>pGEX-5X-1&nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9545-53</td><td>Vector que expresa GST</td></tr><tr><td>Fluoruro de fenilmetilsulfonilo</td><td>Shelton Scientific</td><td>IB01090</td><td>PMSF</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Life Technologies</td><td>14040</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Spectra/Por 4 tubo de diálisis</td><td>Spectrum Labs</td><td>132700</td><td>como tubo de membrana porosa para diálisis</td></tr><tr><td>Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel Stain</td><td>Life Technologies</td><td>P-33300</td><td>Para la tinción de fosfoproteínas en geles 2D</td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de proteinasa</td><td>Calbiochem</td><td>539134</td><td>Para tampón de lisis celular</td></tr><tr><td>QuikChange kit de mutagénesis dirigida al sitio</td><td>Stratagene</td><td>200519-5</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>MiniPrep Kit de aislamiento de plásmidos</td></tr><tr><td>RO-3306</td><td>Alexis Biochemicals</td><td>270-463-M001</td><td>Inhibidor de Cdk1</td></tr><tr><td>Rotenona</td><td>MP Biomedicals</td><td>150154</td><td>Inhibidor del complejo I</td></tr><tr><td>Carbonato de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S93359</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>EMD Chemicals</td><td>SX0420-5</td><td>Para tampón de lisis celular</td></tr><tr><td>Ortovanadato de sodio</td><td>MP Biomedicals</td><td>159664</td><td>Para tampón de lisis celular</td></tr><tr><td>Pirofosfato de sodio decahidrato</td><td>Alfa Aesar</td><td>33385</td><td>Para tampón de lisis celular Tampón</td></tr> de <tr><td>sodio &beta;-glicerofosfato</td><td>Alfa Aesar</td><td>L03425</td><td>Para tampón de lisis celular</td></tr><tr><td>SpectraMax M2e&nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td>M2E Lector</td> de <td>microplacas</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Fisher Scientific</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>Triturador de tejidos</td><td>Kimble Chase</td><td>885301-0007</td><td>Para el aislamiento de mitocondrias</td></tr><tr><td>Tubo de trituración de tejidos</td><td>Kimble Chase</td><td>885303-0007</td><td>Para el aislamiento de mitocondrias</td></tr><tr><td>Solución de ácido tricloroacético</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0699</td><td>TCA</td></tr><tr><td>Tris</td><td>MP Biomedicals</td><td>103133</td><td></td></tr><tr><td>Triton-x-100</td><td>Teknova</td><td>T1105</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Calbiochem</td><td>650211</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon Imager</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9558-09 Escáner de</td><td>gel láser para 2D-DIGE</td></tr><tr><td>Ubiquinona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7956</td><td></td></tr></tbody></table>

los enfoques experimentales para estudiar mitocondrial localización y función de un ciclo celular quinasa nuclear, cdk1

Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

Aunque las mitocondrias poseen su propia maquinaria transcripcional, solo el 1% de las proteínas mitocondriales se sintetizan dentro del orgánulo. Las proteínas codificadas nuclear se transportan a las mitocondrias guiadas por sus secuencias de diana mitocondriales (MTS); sin embargo, la mayoría de las proteínas mitocondriales localizadas carecen de un MTS identificable. Sin embargo, el hecho de que el MTS pueda instruir a las proteínas para que entren en las mitocondrias proporciona una herramienta valiosa para estudiar las funciones mitocondriales de las proteínas normalmente nucleares y/o citoplasmáticas. Recientemente hemos identificado el complejo ciclina quinasa del ciclo celular ciclina B1/Cdk1 en las mitocondrias. Para estudiar específicamente las funciones mitocondriales de este complejo, fue esencial la sobreexpresión mitocondrial y la eliminación de este complejo sin interferir con sus funciones nucleares o citoplasmáticas. Al marcar CyclinB1/Cdk1 con MTS, pudimos lograr la sobreexpresión mitocondrial de este complejo para estudiar sus objetivos mitocondriales, así como sus funciones. A través del marcaje de Cdk1 dominante negativo con MTS, se logró la inhibición de la actividad de Cdk1 particularmente en las mitocondrias. Los posibles objetivos mitocondriales del complejo CyclinB1/Cdk1 se identificaron utilizando un enfoque proteómico basado en gel. A diferencia del análisis en gel 2D tradicional, empleamos la tecnología de electroforesis en gel de diferencia bidimensional (2D-DIGE) seguida de tinción de fosfoproteínas para marcar con fluorescencia proteínas fosforiladas diferencialmente en células mitocondriales que expresan Cdk1. La identificación de manchas de fosfoproteínas que estaban alteradas en las mitocondrias de tipo salvaje frente a las mitocondrias dominantes negativas portadoras de Cdk1 reveló la identidad de los objetivos mitocondriales de Cdk1. Por último, para determinar el efecto de la localización mitocondrial de CyclinB1/Cdk1 en la progresión del ciclo celular, se utilizó un ensayo de proliferación celular utilizando un análogo sintético de timidina EdU (5-etinil-2′-desoxiuridina) para monitorizar las células a medida que atraviesan el ciclo celular y replican su ADN. En conjunto, demostramos una variedad de enfoques disponibles para estudiar la localización mitocondrial y la actividad de una quinasa del ciclo celular. Estos son métodos avanzados, pero fáciles de seguir, que serán beneficiosos para muchos investigadores de biología celular.

Sub-localización mitocondrial de CyclinB1 y Cdk1 extracción de carbonato de sodio se utiliza para determinar si una proteína se encuentra dentro de la mitocondria o en la superficie exterior, a saber, la membrana exterior. Una vez que se muestra una proteína de localizar dentro de la mitocondria, mas la determinación de la sub-localización mitocondrial puede realizarse a través mitoplasting combinado con la di...

Aquí, describimos cómo estudiar la localización mitocondrial de una quinasa (ciclo celular) y cómo determinar su ubicación submitocondrial, así como los posibles sustratos/objetivos mitocondriales. La expresión forzada de proteínas en las mitocondrias proporciona una herramienta útil para estudiar las consecuencias funcionales de la localización mitocondrial de una proteína de interés.

Los enfoques experimentales para estudiar mitocondrial localización y función de un ciclo celular quinasa nuclear, Cdk1

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The ...

El objetivo general del siguiente procedimiento es determinar la localización sub-mitocondrial de una quinasa del ciclo celular normalmente nuclear y luego analizar cómo su localización mitocondrial afecta la progresión del ciclo celular. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de investigación mitocondrial, como la forma en que el núcleo se comunica con las mitocondrias durante el ciclo celular. Al etiquetar proteínas con una secuencia dirigida a las mitocondrias, podemos aprovechar la sobreexpresión específica de proteínas en las mitocondrias, lo que nos permite estudiar sus funciones específicas en este orgánulo.Aunque este método puede proporcionar información sobre el direccionamiento mitocondrial de ciertas proteínas, también puede aplicarse a otros orgánulos, como el núcleo, el RE, el complejo de Golgi y un lisosoma. Después de cultivar, homogenizar y centrifugar las células según el protocolo descrito, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo. Luego, centrifugue la muestra a 7.000 g y 4 grados Celsius durante 10 minutos.Luego, use 200 microlitros de tampón IBC frío para resuspender el precipitado y divida el homogenato en dos alícuotas. Centrifugu

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FRET basada en los periodistas están cada vez más utilizado para monitorear las actividades de quinasa y fosfatasa en las células vivas. Aquí se describe un método sobre el uso de FRET basada en la prensa para evaluar el ciclo celular dependiente de los cambios en la fosforilación de destino.

Seguimiento de las actividades de quinasa y fosfatasa través del ciclo celular por Proporcional FRET

Metafase anafase transición se activa a través de la promoción de complejos anafase (APC / C)-dependiente de ubiquitinación y posterior destrucción de la ciclina B. En este caso, hemos establecido un sistema que, a raíz de pulso-caza etiquetado, permite monitorizar la proteólisis de ciclina B en poblaciones de células enteras y facilita la detección de interferencia por el puesto de control mitótico.

El estudio de la proteólisis de ciclina B en el nivel de células individuales en poblaciones de células enteras

El análisis de la relación estructura-función mitocondrial es necesario para una comprensión profunda de los mecanismos reguladores de la funcionalidad mitocondrial. En este trabajo se describen y demuestran métodos específicos para estudiar la estructura y función mitocondrial en ovarios vivos y fijos de Drosophila.

Estudiar mitocondrial Estructura y función en Drosophila Los ovarios

Este protocolo describe una estrategia optogenética para modular la actividad de la proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK) durante la diferenciación celular y el desarrollo embrionario de Xenopus . Este método permite la activación reversible de la vía de señalización MAPK en el cultivo de células de mamíferos y en organismos vivos multicelulares, como los embriones Xenopus , con alta resolución espacial y temporal.

Modulación reversible mediada por luz de la vía de la proteína quinasa activada por mitógeno durante la diferenciación celular y<em&gt; Xenopus</em&gt; Desarrollo embrionario

Presentamos un protocolo para sincronización de timidina doble de células HeLa, seguido por el análisis mediante microscopía confocal de alta resolución. Este método es clave para la obtención de gran número de células que proceden síncrono de fase S de la mitosis, lo que permite estudios sobre roles mitotic de proteínas multifuncionales que también poseen las funciones de interfase.

Combina la sincronización celular mitótica y microscopia Confocal de alta resolución para estudiar el papel de las proteínas multifuncional ciclo celular durante la Mitosis

Quinasa dependiente de ciclina 1 (Cdk1) está activado en la fase G2 del ciclo celular y regula muchas vías celulares. Aquí, presentamos un protocolo para un ensayo de quinasa en vitro con Cdk1, que permite la identificación de sitios de fosforilación de Cdk1 específicos para establecer dianas celulares de esta quinasa importante.

Identificación de quinasa dependiente de ciclina 1 sitios específicos de fosforilación por una quinasa In Vitro ensayo

Aquí presentamos un protocolo para evaluar la dinámica de la formación del husillo y la progresión mitotica. Nuestra aplicación de imágenes de lapso de tiempo permite al usuario identificar células en varias etapas de la mitosis, rastrear e identificar defectos mitoticos, y analizar la dinámica del husillo y el destino de las células mitoticas al exponerse a fármacos antimitoticos.

Imágenes de células vivas para evaluar la dinámica del tiempo metafásico y el destino celular después de las perturbaciones del husillo mitático

El genoma mitocondrial de levadura de Baker codifica ocho polipéptidos. El objetivo del protocolo actual es etiquetarlos todos ellos y posteriormente visualizarlos como bandas separadas.

Etiquetado y visualización de productos de expresión del genoma mitocondrial en la levadura de Panadero Saccharomyces cerevisiae

Los cibridos transmitocondiales son células híbridas obtenidas mediante la fusión de células agotadas de ADN mitocondrial (ADNmt) (células rho0 ) con citólogos (células enucleadas) derivadas de pacientes afectados por trastornos mitocondriales. Permiten la determinación del origen nuclear o mitocondrial de la enfermedad, la evaluación de la actividad bioquímica y la confirmación del papel patogénico de las variantes relacionadas con el ADNmt.

Un enfoque in vitro para estudiar la disfunción mitocondrial: un modelo cibrido

Este protocolo proporciona un enfoque estandarizado para obtener imágenes de la morfología mitocondrial en múltiples tejidos de C. elegans durante el envejecimiento.

Imágenes y cuantificación de la morfología mitocondrial en C. elegans durante el envejecimiento

Este artículo describe el uso de microscopía confocal e ImageJ para evaluar la dinámica de fisión/fusión mitocondrial a través de la fluorescencia de fotoconmutación Dendra2.

Evaluación de la dinámica de fisión/fusión mitocondrial en células tubulares proximales renales

Aprende a estudiar la localización mitocondrial de la quinasa Cdk1 y sus funciones específicas en la matriz mitocondrial mediante marcaje con secuencias de direccionamiento. Este método permite analizar cómo la localización mitocondrial afecta la progresión del ciclo celular.

Los enfoques experimentales para estudiar mitocondrial localización y función de un ciclo celular quinasa nuclear, Cdk1

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