Los enfoques experimentales para estudiar mitocondrial localización y función de un ciclo celular quinasa nuclear, Cdk1

El objetivo general del siguiente procedimiento es determinar la localización sub-mitocondrial de una quinasa del ciclo celular normalmente nuclear y luego analizar cómo su localización mitocondrial afecta la progresión del ciclo celular. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de investigación mitocondrial, como la forma en que el núcleo se comunica con las mitocondrias durante el ciclo celular. Al etiquetar proteínas con una secuencia dirigida a las mitocondrias, podemos aprovechar la sobreexpresión específica de proteínas en las mitocondrias, lo que nos permite estudiar sus funciones específicas en este orgánulo.

Aunque este método puede proporcionar información sobre el direccionamiento mitocondrial de ciertas proteínas, también puede aplicarse a otros orgánulos, como el núcleo, el RE, el complejo de Golgi y un lisosoma. Después de cultivar, homogenizar y centrifugar las células según el protocolo descrito, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo. Luego, centrifugue la muestra a 7.000 g y 4 grados Celsius durante 10 minutos.

Luego, use 200 microlitros de tampón IBC frío para resuspender el precipitado y divida el homogenato en dos alícuotas. Centrifugue las muestras nuevamente a 7.000 g y 4 grados Celsius durante 10 minutos. Y repita el lavado.

Después de descartar el sobrenadante, agregue 30 microlitros de tampón de lisis celular a uno de los precipitados y almacene el lisado a 80 grados Celsius para inmunotransferencia. Para realizar la extracción con carbonato de sodio con el segundo precipitado y separar las proteínas solubles y las unidas a la membrana, agregue 250 microlitros de carbonato de sodio 0,1 molar pH 11,0 e incube en hielo durante 30 minutos. Centrifugue a 100.000 ×g durante 20 minutos.

Luego, recoja el sobrenadante y agregue un volumen igual de ácido tricloroacético al 20%, recién preparado, para precipitar las proteínas. Mantenga en hielo durante 30 minutos. Mientras tanto, agregue 30 microlitros de tampón de lisis celular al precipitado y someta a sonicación según el protocolo descrito antes de almacenar a 80 grados Celsius para inmunotransferencia.

Después de la incubación de 30 minutos con TCA, centrifugar la reacción a 15.000 g durante 10 minutos. Desechar el sobrenadante y luego usar 80 microlitros de tampón de lisis celular para resuspender el precipitado. Después de aislar las fracciones mitocondriales de las células según se describe en el protocolo del texto, separar las fracciones mitocondriales en 10 porciones iguales.

Centrifugar las muestras a 7.000 g y 4 grados Celsius durante 10 minutos. Utilizar 30 microlitros de una serie de concentraciones de tampones hipotónicos de sacarosa con o sin tripsina para disolver cada precipitado. Incubar en hielo durante 30 minutos.

Añada 3 microlitros de PMSF 10 milimolar a los viales que contienen tripsina para detener la digestión con tripsina. Incube en hielo durante 10 minutos. Centrifugue las muestras a 14.000 g y 4 grados Celsius durante 10 minutos.

Y transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo. Para lisar el sedimento, agregue 30 microlitros de tampón de lisis celular. Sometan las muestras a sonicación según se describe en el protocolo del texto y almacénelas a 80 grados Celsius.

Para construir vectores de ciclina B1-Cdk1 marcados con GFP/RFP y dirigidos a las mitocondrias, clone la secuencia de direccionamiento mitocondrial del precursor de la subunidad 8A de la citocromo-c oxidasa humana, y encadénela con el extremo n-terminal de GFP o RFP en los sitios NheI y BamHI de pEGFP-N1 o pERFP-N1, utilizando técnicas estándar de clonación molecular. Utilizando los cebadores descritos en el protocolo del texto, amplifique los genes Cdk1 y ciclina B1 siguiendo técnicas convencionales. Luego, digiera los productos de PCR con BamHI.

Realice las reacciones en un gel de agarosa al 1 %, antes de usar una hoja de afeitar para cortar los fragmentos de ADN del tamaño correcto. Luego, use un kit de extracción de gel para purificar el ADN. A continuación, digiera un microgramo de los plásmidos MTS-pEGFP-N1 y MTS-pERFP-N1 con 1 microlitro de BamH1 a 37 grados Celsius durante 2 horas.

Luego, agregue 1 microlitro de fosfatasa alcalina de intestino de ternero e incube a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Después de separar los productos de digestión en un gel de agarosa al 1% y purificar el ADN como se acaba de describir, prepare una reacción de ligación utilizando los reactivos enumerados en el protocolo del texto. A continuación, incube la reacción a 4 grados Celsius durante la noche.

Transforme células competentes de E. coli dH5-alpha con 10 microlitros de la mezcla de ligación. Incube las bacterias en placas de agar LB con 10 miligramos por mililitro de kanamicina a 37 grados Celsius durante la noche.

Al día siguiente, utilice una punta de pipeta estéril para seleccionar una colonia de una placa e inserte la punta en un tubo que contenga 5 mililitros de LB con kanamicina. Incube la cultura durante la noche y a la mañana siguiente, use un kit de mini prep según el protocolo indicado para aislar el plásmido.

Para transfectar células MCF-10A en crecimiento exponencial, use plásmidos Cdk1 o cyclinB-1 para preparar el reactivo de transfección de plásmido en una proporción de 1:2 en 100 microlitros de medio libre de suero y antibióticos. Transfecte las células e incúbelas a 37 grados Celsius durante 48 horas. Tiña y visualice las mitocondrias según el protocolo descrito en el texto.

Para realizar la clasificación celular, transfecte 2 veces 10 a la 5ª células con los vectores deseados en una placa de 6 pocillos utilizando una relación 1:2 de ADN frente al reactivo de transfección preparado en 2,5 mililitros de medio sin suero ni antibióticos. Tras incubar la transfección durante 48 horas, utilice citometría de flujo para clasificar viablemente las células que expresan establemente las proteínas Cdk-1 marcadas con GFP y ciclinaB1 marcadas con RFP según el protocolo descrito. Para medir la duración del ciclo celular mediante el ensayo de citometría de flujo con marcado de EdU, siembre las células clasificadas en placas de 6 pocillos a una densidad de 2,5 veces 10 a la 5ª células por pocillo.

Después de una incubación nocturna, agregue EdU al medio de cultivo hasta una concentración final de 25 micromolar e incube durante una hora adicional. Luego, a intervalos de dos horas, use 1 % de BSA en 500 microlitros de PBS para lavar un pocillo de células. Y recolecte en un tubo de 1,5 mililitros.

Centrifugar las células a 350 g durante 5 minutos. Luego desechar el sobrenadante. Desprender el sedimento añadiendo 100 microlitros de solución fijadora.

Mezcle bien e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos. A continuación, use 1 mililitro de BSA al 1 % en PBS para lavar las células tres veces. Luego use 0,5 mililitros de etanol al 70 % para fijar las células a 4 grados Celsius durante la noche.

Al realizar la marcación con EdU en células transfectadas con proteínas marcadas con GFP y RFP, es fundamental suprimir las señales fluorescentes de GFP y RFP. Para lograrlo, agregamos un paso adicional de fijación celular nocturna utilizando etanol al 70 %. Al día siguiente, tras lavar y permeabilizar las células según el protocolo descrito, añada 0,5 mililitros de la mezcla de reacción en cada tubo y mezcle bien.

Tras la incubación en la oscuridad y otro lavado, utilice 50 microgramos por mililitro de yoduro de propidio o PI en PBS con 1 % de BSA para teñir el ADN. Analice las células mediante citometría de flujo para seguir la población positiva para EdU. Presente un gráfico de puntos dispersos de células marcadas con EdU teñidas para el contenido de ADN y EdU.

Utilice el canal APC para Alexa 647 EdU con un filtro de banda pasante de 670 30, con toda la luz presente, menor de 685 nanómetros que incida sobre ese filtro, y el canal de ficoeritrina para PI con un filtro de banda pasante de 581 15 delante, con toda la luz presente menor de 600 nanómetros que incida sobre ese filtro. Con una estrategia de selección estándar para la adquisición, grafique el área de FSC frente al área de SSC para la morfología, seguido de PI frente a Alexa 647 EdU para la tinción celular. Registre los datos de todos los tubos uno por uno, adquiriendo 10.000 eventos por muestra.

En esta figura, las proteínas Hsp60 del espacio matricial mitocondrial y Timm13 del espacio intermembranar se utilizaron como marcadores de localización submitocondrial. Al igual que Hsp60, pero a diferencia de Timm13, la ciclina B1 y la Cdk1 estuvieron protegidas de la digestión con tripsina, lo que indica que se localizan en la matriz mitocondrial. Como se muestra aquí, mediante inmunotransferencia de las fracciones mitocondriales aisladas, utilizando las construcciones de ciclina B1 y Cdk-1 marcadas con MTS y GFP, se logró la sobreexpresión de ciclina B1 y/o Cdk-1 en las mitocondrias.

Mediante un ensayo de pulsación y seguimiento con EdU, se demostró que las células marcadas en fase S progresaron a través de la fase G2M y aparecieron en la fase G1 tan rápido como 4 horas en células que expresaban la ciclina B1 mitocondrial de tipo salvaje con Cdk-1. En comparación con 6 horas en células transfectadas con un control vectorial o con ciclina B1 mutante Cdk-1, lo que indica que la mejora de la ciclina B1 mitocondrial Cdk-1 acelera la progresión del ciclo celular. Tras este procedimiento, se pueden medir otros métodos como la generación mitocondrial de ATP, el consumo de oxígeno, el potencial de membrana y las especies reactivas de oxígeno para responder preguntas adicionales, como cómo la localización mitocondrial de la quinasa del ciclo celular Cdk-1 altera la respiración y la producción de energía mitocondriales.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo estudiar la localización mitocondrial y las funciones específicas de una quinasa nuclear en las mitocondrias.