Name: Identificación de los pares quinasa-sustrato Usando selección de alto rendimiento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Aprende a identificar pares quinasa-sustrato mediante selección de alto rendimiento utilizando GST pulldown y autoradiografía. Este protocolo permite el análisis rápido de la actividad de quinasas en señalización celular.

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Este trabajo fue apoyado por la beca NSERC 386634. Nos gustaría dar las gracias a los miembros del Laboratorio Screaton útil para los debates.

1. Preparación de los reactivos, platos, y Células <ol><li> Hacer 500 ml de tampón de lisis: 25 mM Tris pH 7,5, NaCl 150 mM, NaF 50 mM, 0,5 mM EDTA pH 8,0, 0,5% Triton X-100, 5 mM beta-glicerofosfato, 5% de glicerol. Almacenar a 4 ° C. Inmediatamente antes de usar, añadir ditiotreitol 1 mM (DTT), 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), vanadato de sodio y 1 mM. Después de este paso, PMSF no se requiere en cualquier tampón de enjuague. </li><li> Hacer 20 ml de 10x tampón de quinasa: mM Tris 200 pH 7,5, 50 mM de beta-glicerofosfato (FW 216), vanadato de sodio 2 mM. Alícuota en 1 ml tubos y almacenar a -20 ° C. Inmediatamente antes de usar, añadir DTT 5 mM. </li><li> Hacer 20 ml de tampón M-ATP 10x: 300 M de adenosina trifosfato (ATP), 66 mM MgCl2, 33 mM MnCl $ 2. alícuota de 1 ml tubos y almacenar a -20 ° C. </li><li> Hacer 100 ml de sulfato de sodio dodecil 2x (SDS) tampón de lisis: 1,5 g de base Tris, 20 ml de glicerol, 30 ml de H 2 O. Disolver y ajustar el pH a 6,8 con HCl. Añadir 40ml 10% SDS, ajustar el volumen a 100 ml. Añadir 25 mg de azul de bromofenol. </li><li> Spot 4 l de 25 ng / l de plásmido de expresión de mamífero que codifican un GST-quinasa por pocillo en 14 conjuntos de placas de 96 pocillos y placas de etiquetas en consecuencia. Seal y congelación placas a -20 ° C hasta su uso. </li><li> 1-2 días antes de la transfección, las células de cultivo HEK293T en medio de Eagle modificado de Dulbecco completo (DMEM) + 10% de suero fetal bovino (FBS) y antibióticos en una incubadora a 37 ° suplementado con CO 2 (5% final). Pasaje con tripsina y no permiten que la acción se convierta en&gt; 80% de confluencia durante la expansión. Se requiere un mínimo de 6 x 10 7 células para la pantalla (aproximadamente 3 x 15 cm de platos de células HEK293T en 80% de confluencia). </li></ol> 2. La transfección Nota: Consulte la Figura 1 para un diagrama de flujo de protocolo entero. <ol><li> Si las placas que contienen plásmidos quinasa han sido congelados, descongelar a temperatura ambiente unnd centrifugar a 1900 xg durante 3 min para recoger cualquier humedad en el fondo de los pozos. </li><li> Mezclar 8,6 ml de medio de suero reducido (por ejemplo, OPTI-MEM) con 312,7 l de reactivo de transfección a base de lípidos. Deje reposar durante 5 minutos. </li><li> Añadir 10 l de medio de suero reducido a cada pocillo usando un dispensador de líquido automatizado equipado con un pequeño volumen de casete. </li><li> Añadir 10 l por pocillo de la mezcla de reactivo de medio con suero / transfección reducida desde el paso 2.2 utilizando un dispensador de líquido automatizado equipado con un pequeño volumen de casete. Deje reposar durante 20 a 45 min. </li><li> Resuspender las células 293T en 7,5 x 10 5 células / ml en 80 ml ​​de DMEM completo. Añadir 100 l de suspensión celular (es decir, 7,5 x 10 4 células) por pocillo usando un dispensador de líquido automatizado equipado con un casete de volumen estándar. </li><li> Compruebe pozos bajo el microscopio para la distribución uniforme de células y volver a la incubadora durante 24 horas. </li></ol> 3. desplegable GST-quinasa <ol><li> Haga fResh: 4 mM solución de pervanadato mediante la mezcla de 60 l de 0,2 M de vanadato de sodio con 540 l de H 2 O. En una segunda mezcla de tubo de 2,7 l de peróxido de 30% y 1,4 ml de PBS. Añadir las dos soluciones juntos y deje reposar durante 15 minutos antes de su uso. </li><li> Con una pipeta multicanal (no utilizar un dispensador de líquido automatizado, ya que crea mucha turbulencia en el pozo) prescindir de 2 l de 0,25 M CaCl2 en cada pocillo, seguido de 2,5 l de la pervanadato preparada en el paso 3.1. Incubar cada placa a 37 ° C durante 10 min y luego se coloca en hielo. </li><li> Prepare 35 ml de tampón de lisis mediante la adición de la TDT, PMSF, y vanadato de sodio, como se indica en la Sección 1 (Preparación de los reactivos). </li><li> Mantener las placas en hielo, retire medio de cada pocillo usando un aspirador de vacío. Inmediatamente añadir 50 l / pocillo de tampón de lisis de hielo frío usando un dispensador de líquido automatizado equipado con un casete estándar. Deje reposar 30 minutos en hielo para lisar (opcional: puede parar aquí si es necesario mediante plat selladocorreo y almacenamiento a -80 ° C. Para continuar, placas de deshielo en el hielo). </li><li> Placas giran a 1.900 g durante 3 min a 4 ° C. </li><li> Raspar las células de cada pocillo usando una pipeta multicanal y transferir todos los contenidos etiquetados apropiadamente a placas de 96 pocillos de fondo en V. Placas giran a 1900 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Durante el centrifugado, llenar placas revestidos con glutatión (uno para cada placa de 96 pocillos) con 100 l / pocillo de tampón de lisis de hielo frío (sin PMSF) como un enjuague. Mantenga las placas de hielo. </li><li> Retire las placas de fondo en V de la centrífuga. Uno a la vez, invertir las placas de glutatión sobre un fregadero para sacudir el tampón de lisis y mancha en una toalla de papel. Transferencia de tampón de lisis de las placas de fondo en V a las placas de glutatión por la inclinación de la placa y con una pipeta multicanal, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento en la parte inferior. Tapar y dejar las placas en hielo durante un mínimo de 2 horas para unirse. </li><li> Cerca del final de la etapa de unión 2 hr, preparar una estación de trabajo radiactividad, asegurando tque las medidas de seguridad necesarias están en su lugar para el trabajo radiactivo. Horno de hibridación Se establece en 30 ° C. </li><li> Preparar 200 ml de tampón de lisis mediante la adición de DTT y sodio vanadato como se indica en la Sección 1. PMSF no se requiere en esta etapa. </li><li> Invertir las placas de glutatión sobre un fregadero para sacudir el tampón de lisis y secar sobre una toalla de papel. Enjuague pozos 3 veces con 100 l de tampón de lisis (sin PMSF). No deje que los pozos se sientan en seco - mantenerlos en enjuague hasta que esté listo para continuar. </li><li> Prepare 55 ml de tampón de quinasa 1x (KB) diluyendo el 10x y añadiendo la TDT, como se indica en la Sección 1. Placas de enjuague una vez con 50 l de 1x KB utilizando un dispensador de líquido automático equipado con un cassette de volumen estándar. Deja 1x KB en los pozos hasta que la solución A es listo: <ol><li> Preparar la solución A mediante la adición de 500 a 530 g del sustrato de interés, 500 g de proteína básica de la mielina (MBP), 2,65 ml de 10x KB, 13.25 l de 1 M DTT, y H 2 O hasta 15,9 ml. </li></ol></li&gt; <li> Uno a la vez, invertir las placas sobre un fregadero para eliminar enjuague 1x KB, seque sobre una toalla de papel, y de inmediato añadir 30 l de solución A mediante un distribuidor de líquido automático equipado con un pequeño casete volumen. Mantenga las placas de hielo. </li><li> Preparar la solución B en el área de trabajo radiactividad añadiendo 2,5 ml de 10x M-ATP, 32 P ATP 500 Ci gamma, y H 2 O a 10 ml. <ol><li> Añadir 20 l de solución B por pocillo usando una pipeta repetidora que ayuda en la mezcla debido a la fuerza de eyección. Cubrir e incubar en horno de hibridación 30 ° C durante 30 min. </li></ol></li><li> Después de 30 minutos, la transferencia de las placas de nuevo a hielo. Añadir 50 l de tampón de lisis 2x SDS a cada pocillo usando una pipeta multicanal. Puede proceder en este punto con el siguiente paso, o sellar las placas con papel de aluminio y guardar a -20 ° C hasta el momento conveniente. </li></ol> 4. Correr, tinción y Geles de secado Nota: Todo el trabajo debe realizarse en un área Designated la radiactividad. <ol><li> Encienda el horno de hibridación y se puso a 85 ° C. Descongelar las placas a temperatura ambiente. Una vez que el horno ha alcanzado la temperatura, placas de transferencia al horno y se incuba durante 10 minutos para desnaturalizar las muestras. </li><li> Cargar 26 pocillos geles prefabricados con 15 l de cada reacción utilizando una pipeta multicanal para llenar varios pozos a la vez. Se debe tener cuidado de que todos los consejos se alinean con las correspondientes así antes de añadir las muestras. Ejecute gel a 150 V. No deje que el tinte de seguimiento (línea azul) se escurra de la parte inferior del gel, ya que contiene la ATP no incorporado. </li><li> Desmontar los geles y cortar el ATP no incorporado (línea azul), utilizando un bisturí o borde recto ya que sobreexponer las películas. Coloca los geles en contenedores etiquetados y cubrir con tinción de Coomassie durante 15 min. </li><li> Retire la tinción de Coomassie, brevemente enjuagar los geles con agua y añadir destain solución. Destain los geles hasta que las proteínas son claramente visibles. Una banda de MBP y una banda para el sustrato debeser visible para cada muestra. </li><li> Para secar los geles: <ol><li> Cortar una hoja grande de papel de filtro y colocarlo en la secadora. </li><li> Moje una hoja de celofán en agua destilada hasta que esté suave y libre de arrugas, y colocarlo en la parte superior del papel. </li><li> Coloque los geles en la parte superior de la hoja de celofán, haciendo una nota de la orden de los geles. Moje una segunda hoja de celofán y colocar en la parte superior de los geles. </li><li> Estirar todas las burbujas (un rodillo sellado placa funciona bien para esto) para una superficie agradable uniforme. Cierre la tapa, encienda el vacío, y secar los geles durante 3 horas a 80 ° C. </li></ol></li><li> Una vez geles están secos, los exponen a una película XAR utilizando una pantalla de intensificar la señal. Envuelva la cinta con papel film o una bolsa de plástico y selle con cinta para mantener fuera a las heladas. Guarde el casete a -80 ° C durante la noche. </li></ol> 5. Desarrollar XAR Films <ol><li> Al día siguiente, eliminar el casete del congelador y dejar descongelar a temperatura ambiente. Desarrollar la película enun cuarto oscuro usando un procesador de película de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Nota: Examine las películas para pruebas de pares quinasa-sustrato. Una segunda exposición más larga también puede ser útil para detectar eventos de fosforilación más débiles. </li></ol>

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<li>Varjosalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+active+and+kinase-deficient+kinome+collection+for+identification+of+kinases+regulating+hedgehog+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Application of active and kinase-deficient kinome collection for identification of kinases regulating hedgehog signaling.</a> Cell. 133, 537-548 (2008).</li>
<li>Jansson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+controls+CREB+activity+in+islet+cells+via+regulated+phosphorylation+of+TORC2%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Glucose controls CREB activity in islet cells via regulated phosphorylation of TORC2.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10161-10166 (2008).</li>
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<li>Abu-Thuraia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axl+phosphorylates+elmo+scaffold+proteins+to+promote+rac+activation+and+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Axl phosphorylates elmo scaffold proteins to promote rac activation and cell invasion.</a> Mol Cell Biol. 35, 76-87 (2015).</li>
<li>Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+kinase+complement+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The protein kinase complement of the human genome.</a> Science. 298, 1912-1934 (2002).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Desde las publicaciones originales que describen el enfoque 14,15, la biblioteca original de 180 GST-quinasas se ha ampliado a 420 miembros, o ~ 80% de la kinome proteína humana. Con la biblioteca ampliada, el protocolo como se describe toma 4-5 días y después de 1-4 días para desarrollar películas (según se considere necesario), lo que podría ser acortada mediante el uso de phosphorimaging y mejora de la señal digital. Hay varios pasos clave en las que se debe tener cuidado (Ver Figura 1 par...

Proteína modificaciones post-traduccionales (PTMs) son esenciales para la comunicación intracelular. Tal vez el mejor estudiado de todos PTM es la fosforilación, catalizada por proteínas quinasas, que regulan una gran variedad de funciones de proteínas, incluyendo su actividad bioquímica, localización subcelular, conformación, y la estabilidad. La identificación de sitios de fosforilación en las proteínas diana se puede lograr mediante mapeo de fosfopéptidos trípticos o mediante técnicas proteómicas ahora estándar usando muestras enriquecidas para los péptidos fosforilados 1,2. Aunque se espera que tres cuartas partes del proteoma expresado ser fosforilados 3 y un identificaron 200.000 sitios de fosforilación 5, con estimaciones de hasta 1 millón 6, muchos de éstos no tienen asignada la biología, la vía de señalización, o la proteína quinasa. Mientras que la identificación de sitios fosforilados es relativamente sencillo, una comparativamente mayor reto esidentificar la quinasa cognado (s) que se dirige a estos sitios, un proceso que nos referimos como mapeo de quinasa: sustrato pares. Varios enfoques para la identificación de quinasa: sustrato pares se han descrito, ya sea comenzando con una quinasa de interés y en busca de sus sustratos o comenzar con un sustrato de interés y tratando de encontrar una quinasa de modificación experimentalmente 7-11 o computacionalmente 12. Para identificar quinasas para un sustrato fosforilado conocido, la bioinformática se pueden utilizar para identificar las proteínas que contienen una secuencia corta conservada de aminoácidos que flanquean el residuo fosforilado (el sitio consenso), así como la identificación de quinasas que forman un complejo con el sustrato precipitable. Sin embargo, estos métodos requieren mucho tiempo ya menudo no cumplen con éxito. Hemos desarrollado un enfoque funcional sistemático para identificar rápidamente quinasas que pueden phosphorylate un sustrato dado 13. El ensayo de la pantalla produce una excelente específicadad, con una selección muy claro para los posibles quinasas afines. Dada la centralidad de la fosforilación de la señalización biológica, la pantalla es útil para el descubrimiento de rutas de señalización prácticamente todos los teléfonos 14-16. La pantalla implica la realización de un ensayo de quinasa a gran escala con una biblioteca de proteínas quinasas humanas. Las quinasas han sido etiquetadas con glutatión bacteriana S-proteína transferasa (GST) y se purificó a partir de extractos de células de mamíferos, lo que significa que las enzimas recombinantes - a diferencia de los preparados a partir de bacterias - se generan en presencia de las proteínas quinasas aguas arriba a menudo requeridos para la enzimas recombinantes que tienen actividad in vitro. De hecho, mientras que la actividad quinasa de serina, treonina y tirosina requiere para la activación de la quinasa aguas abajo están presentes en la levadura 10, el genoma de la levadura codifica 122 proteínas quinasas, lo que indica que el kinome de mamífero, con más de 500 genes 17, ha llegado a ser significativamente más compleja con el fin de regulate La procesos únicos para los organismos de orden superior. Por otra parte, el efecto de diferentes estímulos relevantes a la biología celular y la enfermedad humana (por ejemplo, moléculas pequeñas, factores de crecimiento, hormonas, etc.) se puede utilizar para modular la actividad de quinasa 14,15 en un contexto apropiado.

<table><tbody><tr><td>Tampón de lisis</td><td>Hecho en casa</td><td></td><td>Ver Protocolo paso 1.1</td></tr><tr><td>Tampón de quinasa 10x</td><td>Hecho en casa</td><td></td><td>Ver Protocolo paso 1.2</td></tr><tr><td>10x M-ATP</td><td>Hecho en casa</td><td></td><td>Ver Protocolo paso 1.3</td></tr><tr><td>Plásmidos de quinasa humana</td><td>Orfeome, Invitrogen, Origene</td><td></td><td>Marcados con GST en casa</td></tr><tr><td>Placas de 96 pocillos</td><td>Fisher Scientific</td><td>CS003595</td><td></td></tr><tr><td>293T células</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002201</td><td>suplemento con 100&nbsp; U/ml de penicilina, 100&nbsp; &#956; g/ml de estreptomicina, 10% suero fetal de ternera.</td></tr><tr><td>Incubadora <>2</td><td>Sanyo</td><td>MCO-17AIC</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular de 15 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>877224</td><td></td></tr><tr><td>Medio sérico reducido</td><td>Invitrogen</td><td>22600-050</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de transfección a base de lípidos</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Dispensador de líquido automatizado</td><td>Thermo Scientific</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>Accesorio de casete pequeño</td><td>Thermo Scientific</td><td>24073295</td><td></td></tr><tr><td>Accesorio de cassette estándar</td><td>Thermo Scientific</td><td>14072670</td><td></td></tr><tr><td>pervanadato de 4 mM</td><td>Hecho en casa</td><td></td><td>Ver paso de protocolo 3.1</td></tr><tr><td>0,25 M CaCl2</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta multicanal (20-200 &#956; l)</td><td>Labnet</td><td>p4812-200</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta multicanal (1-10 &#956; l)</td><td>Thermo Scientific</td><td>4661040</td><td></td></tr><tr><td>placas de 6 pocillos con fondo en V</td><td>Evergreen Scientific</td><td>290-8116-01V</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 96 pocillos recubiertas de glutatión</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-15240</td><td></td></tr><tr><td>Horno de hibridación</td><td>Biostad</td><td>350355</td><td></td></tr><tr><td>Sustrato marcado con GST</td><td>Hecho en casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteína básica de mielina (MBP)</td><td>Sigma</td><td>M1891</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta repetidora (1 ml)</td><td>Eppendorf</td><td>22266209</td><td></td></tr><tr><td>32P gamma-ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU502Z500UC</td><td></td></tr><tr><td>2x tampón de lisis SDS (100&nbsp; </td><td>Hecho en casa</td><td></td><td>Ver Protocolo paso 1.4 Geles</td></tr><tr><td>TGX prefabricados de 26 pocillos</td><td>BioRad</td><td>567-1045</td> El <td>porcentaje de gel requerido depende del peso molecular del sustrato de interés</td></tr><tr><td>Tinción de Coomassie</td><td>Hecho en casa</td><td></td><td>0.1% Coomassie R250, 10% ácido acético, 40% metanol</td></tr><tr><td>Coomassie destain</td><td>Hecho en casa</td><td></td><td>10% ácido acético, 20% metanol</td></tr><tr><td>Envases de gel etiquetados</td><td>Hecho en casa</td><td></td><td>Tapas de plástico usadas de cajas de puntas vacías, lo suficientemente grandes como para contener un gel</td></tr><tr><td>Papel de filtro Whatman</td><td>Fisher Scientific</td><td>57144</td><td></td></tr><tr><td>Hojas de celofán (2)</td><td>BioRad</td><td>165-0963</td><td></td></tr><tr><td>Secador de gel</td><td>Labconco</td><td>4330150</td><td></td></tr><tr><td>Película de autorradiografía de doble emulsión</td><td>VWR</td><td>IB1651454</td><td></td></tr><tr><td>Casete de película</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBAC-1417</td><td></td></tr><tr><td>Pantalla intensificadora</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBIS-1417</td><td></td></tr><tr><td>Rodillo de goma de sellado de placas</td><td>Sigma</td><td>R1275</td><td></td></tr></tbody></table>

identificación de los pares quinasa-sustrato usando selección de alto rendimiento

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Hemos desarrollado una plataforma de cribado para identificar proteínas quinasas humanos dedicados para sustratos fosforilados que pueden utilizarse para dilucidar nuevas vías de transducción de señales. Nuestro enfoque ofrece el uso de una biblioteca de proteínas quinasas humana marcada con GST purificada y un sustrato de proteína recombinante de interés. Hemos utilizado esta tecnología para identificar MAP / microtúbulos afinidad de regulación de quinasa 2 (MARK2) como la quinasa para un sitio regulada por glucosa en CREB-regulado transcripcional Coactivador 2 (CRTC2), una proteína necesaria para la proliferación de células beta, así como la la familia de tirosina quinasas de Axl como reguladores de la metástasis de las células por la fosforilación de la proteína adaptador de ELMO. Se describe esta tecnología y discutimos cómo puede ayudar a establecer un mapa completo de cómo las células responden a estímulos ambientales.

Los resultados representativos de una pantalla se muestran en la Figura 2. 180 quinasas fueron seleccionados utilizando un sustrato peptídico marcada con GST correspondiente a los aa 268-283 de CRTC2 así como la proteína básica de la mielina sustrato clásico ensayo de quinasa (MBP). Sólo dos quinasas, MARK2 y MARK3 la quinasa altamente relacionados con el péptido CRTC2 fosforilados. MBP se incluye como un control interno en todos los ensayos, ya que contiene muchos residuos fosforilables y funciona a 18...

La fosforilación de proteínas es una característica central de cómo las células interpretan y responden a la información en su entorno extracelular. Aquí, presentamos un protocolo de cribado de alto rendimiento que utiliza quinasas purificadas a partir de células de mamíferos para identificar rápidamente las quinasas que fosforilan un sustrato o sustratos de interés.

Identificación de los pares quinasa-sustrato Usando selección de alto rendimiento


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

El objetivo general de este procedimiento es identificar quinasas que fosforilan un sustrato de interés utilizando métodos de cribado de alto rendimiento. Esto se logra primero transfectando células con plásmidos que expresan quinasas FU a glutatión S-transferasa o GST. El segundo paso consiste en realizar un ensayo de inmovilización de quinasas mediante GST.A continuación, las muestras se cargan en geles, los cuales se someten a electroforesis y se tiñen con el colorante azul brillante de kumasi. El paso final consiste en secar los geles y exponerlos a una película de auto radiografía. Finalmente, mediante el revelado e interpretación de las películas resultantes, es posible identificar pares de sustratos de quinasas, ya que cada carril representa un ensayo de quinasa distinto.Los métodos existentes para identificar una quinasa para un sustrato fosforilado conocido incluyen el uso de enfoques bioinformáticos para buscar un sitio de consenso en el sustrato, la detección de complejos entre quinasas y sustratos mediante técnicas bioquímicas y un enfoque de ensayo y error, así como la búsqueda de sustratos de consenso basándose en su función biológica conocida. Estos enfoques son lentos y no siempre tienen éxito. Nuestro enfoque permite la identificación rápida de pares quinasa-sustrato basada en resultados funcionales.Cuando tuvimos por primera vez la idea de este método, nos preocupaba que hubiera una especificidad insuficiente in vitro. Resulta que la especificidad del sustrato es excelente y a menudo encontramos que solo las quinasas de un mismo grupo familiar son capaces de fosforilar un sustrato determinado en la prueba. Esto es particularmente evidente cuando realizamos pruebas multiplexadas utilizando múltiples sustratos en cada ensayo, demostrando que el procedimiento lo realizará Courtney, una técnica de mi laboratorio. Comience el procedimiento con la preparación de los reactivos, placas y células según se describe en el protocolo escrito.Si las placas que contienen los plásmidos de quinasas han estado congeladas, descongélelas a temperatura ambiente y centrifúguelas a 1900 veces G durante tres minutos para recoger cualquier humedad en el fondo de los pozos. Mezcle 8,6 mililitros de medio con suero reducido con 312,7 microlitros de reactivo de transfección basado en lípidos, y deje que la mezcla repose durante cinco minutos en cada pozo. De la placa de 96 pozos que contiene los plásmidos de quinasas, agregue 10 microlitros del medio con suero reducido.Utilizando un dispensador automático de líquidos equipado con un casete de pequeño volumen, agregue luego 10 microlitros de la mezcla de reactivo de transfección en medio de suero reducido por pozo, empleando un dispensador automático de líquidos provisto de un casete de pequeño volumen, y deje reposar la placa durante 20 a 45 minutos. A continuación, resuspenda las células 293T a una concentración de 0,75 millones de células por mililitro en 80 mililitros de medio DMEM completo modificado o medio DMEM, añadiendo 100 microlitros de la suspensión celular por pozo. Utilizando un dispensador automático de líquidos equipado con un casete de volumen estándar, revise los pozos bajo el microscopio para verificar una distribución uniforme de las células antes de devolver la placa a una incubadora a 37 grados Celsius durante 24 horas.Para comenzar el experimento de precipitación de quinasa GST, prepare una solución de vanadato de cuatro milimolar mezclando 60 microlitros de vanadato de sodio 0,2 molar con 540 microlitros de agua. En un segundo tubo, mezcle 2,7 microlitros de peróxido al 30 % y 1,4 mililitros de solución salina tamponada con fosfato o PBS. Combine ambas soluciones y deje la mezcla reposar durante 15 minutos antes de usarla.Utilizando una pipeta multicanal, dispensar dos microlitros de cloruro de calcio 0,25 molar en cada pocillo, seguido de 2,5 microlitros de la solución de ADN comprobada. Incubar cada placa a 37 grados Celsius durante 10 minutos y luego colocar sobre hielo, manteniendo las placas en hielo. Retirar el medio de cada pocillo, utilizando al vacío inmediatamente 50 microlitros por pocillo de tampón de lisis frío. Utilizando un dispensador automático de líquidos equipado con el casete estándar, deje la placa durante 30 minutos en hielo para licuar. Después de centrifugar las placas a 1900 ×g durante tres minutos a cuatro grados Celsius, raspe las células de cada pocillo utilizando una pipeta multicanal y transfiera todo el contenido a tubos vbo debidamente etiquetados. Para placas de 96 pocillos, centrifugue las placas a 1900 ×g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius; durante la centrifugación, agregue a las placas recubiertas con glutatión 100 µL por pocillo de tampón de lisis frío.Como medida de enjuague, mantenga las placas sobre hielo. Tras la centrifugación de las placas con fondo V, invierta las placas de glutatión sobre un fregadero para eliminar el tampón de lisis agitándolas suavemente y séquelas con una toalla de papel. Transfiera el tampón de lisis desde las placas con fondo V a las placas de glutatión inclinando la placa y utilizando una pipeta multicanal, teniendo cuidado de no perturbar el precipitado en el fondo.Luego, cubra las placas y déjelas en hielo durante un mínimo de dos horas. Cerca del final del paso de incubación de dos horas, prepare una estación de trabajo con radioactividad asegurando que las precauciones de seguridad necesarias estén en su lugar para trabajar con material radiactivo. Ajuste el horno de hibridación a 30 grados Celsius.Dar la vuelta a las placas de glutatión sobre un fregadero para eliminar el tampón de lisis y secar sobre una toalla de papel. Enjuagar los pocillos tres veces con 100 microlitros de tampón de lisis sin PMSF. No permitir que los pocillos se sequen.Manténgalos en el lavado hasta que esté listo para continuar. A continuación, prepare 55 mililitros de tampón de quinasa 1X o 1x kb según se describe en el protocolo del texto. Añada 50 microlitros de 1x kb a cada pocillo de la placa utilizando un dispensador automático de líquidos equipado con un casete de volumen estándar.Luego prepare la solución A elaborando una solución que contenga el sustrato de interés y la proteína básica de mielina o MVP, según se describe en el protocolo escrito, uno a la vez. Invierta las placas sobre un fregadero para eliminar el lavado de XKB y séquelas sobre una toalla de papel, y agregue inmediatamente 30 microlitros de la solución A utilizando un dispensador automático de líquidos equipado con un cassette de pequeño volumen. Mantenga las placas en hielo.A continuación, prepare la solución B en el área de trabajo con radioactividad según lo descrito en el protocolo escrito, utilizando 20 microlitros de solución B por pocillo. Mediante una pipeta repetidora, que facilita la mezcla debido a la fuerza de expulsión, agregue la solución, tápela y coloque la placa en un horno de hibridación a 30 grados Celsius durante 30 minutos. Pasados los 30 minutos, transfiera las placas nuevamente al hielo.Luego, agregue 50 microlitros de tampón de lisis de sulfato de sodio dodecil sulfato dos veces (SDS) a cada pocillo utilizando una pipeta multicanal. Todo el trabajo en esta sección debe realizarse en un área designada para actividades radiactivas. Encienda el horno de hibridación y ajústelo a 85 grados Celsius.Una vez que el horno haya alcanzado la temperatura, transfiera las placas al horno e incube durante 10 minutos para desnaturalizar las muestras. A continuación, cargue geles precolados de 26 pozos con 15 microlitros de cada reacción.Al utilizar una pipeta multicanal para llenar varios pocillos a la vez, se debe tener cuidado de que todas las puntas se alineen con los pocillos correspondientes. Antes de agregar las muestras, haga correr el gel a 150 voltios. No permita que la línea azul salga por el fondo del gel, ya que contiene el ATP no incorporado. Luego desarme los geles y elimine el ATP no incorporado, ya que oscurecerá la exposición del gel en las películas.Coloque los geles en recipientes etiquetados y cúbralos con tinción de kumasi durante 15 minutos. A continuación, retire la tinción de kumasi. Enjuague brevemente los geles con agua y agregue la solución reveladora.Retenga los geles hasta que las proteínas sean claramente visibles. Debe observarse una banda para MVP y una banda para el sustrato en cada muestra. Para secar los geles, corte una hoja grande de papel filtro y colóquela sobre el secador.Humedezca una hoja de celofán con agua destilada hasta que quede lisa y sin arrugas, y colóquela encima del papel. Coloque los geles encima de la hoja de celofán, anotando el orden de los geles. Humedezca una segunda hoja de celofán y colóquela encima de los geles.Extienda eliminando todas las burbujas para obtener una superficie uniforme. Cierre la solapa, encienda el vacío y caliente los geles durante tres horas a 80 grados Celsius. Una vez que los geles estén secos, expóngalos a una película de autorradiografía de doble emulsión utilizando una pantalla para intensificar la señal.Envuelva el casete con envoltura de plástico o una bolsa de plástico y séllelo con cinta para evitar la formación de escarcha antes de almacenar el casete a menos 80 grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, retire el casete del congelador y déjelo descongelar a temperatura ambiente. Revele la película en un cuarto oscuro utilizando un procesador de películas según las instrucciones del fabricante indicadas.A continuación se presentan resultados representativos de un análisis en el que se examinaron 180 quinasas utilizando un sustrato peptídico con etiqueta GST correspondiente a los aminoácidos 268 a 283 del coactivador transcripcional regulado por Krebs dos o CRTC dos, así como el sustrato clásico para ensayos de quinasa, la proteína básica de la mielina o MBP. Las quinasas mark dos y la quinasa estrechamente relacionada mark tres se fosforilaron. El péptido CRTC dos y MBP se incluyeron como controles internos en todos los ensayos, ya que contienen muchos residuos susceptibles de fosforilación y migran a 18 kilodalton, cerca de la parte inferior del gel.Esto permite una interpretación de la especificidad. Algunas quinasas fosforilarán de manera robusta un sustrato y el MVP. Es importante señalar que los pocillos que contienen solo GST siempre purifican cierta actividad quinasa endógena.Por lo tanto, siempre existe una fosforilación de fondo en el ensayo. Si bien esto no descarta que la fosforilación del sustrato sea real, sí sugiere que, en condiciones in vitro, la quinasa puede ser menos selectiva. Es particularmente informativo incluir múltiples sustratos de diferentes pesos moleculares para obtener conclusiones sobre la especificidad de sustrato de la quinasa.Dado que la pantalla es in vitro y existen niveles adicionales de complejidad in vivo, un cinasa candidato debe validarse en células. Por ejemplo, un cinasa candidato puede tener la capacidad de fosforilar un sustrato in vitro, pero no estar expresado en el mismo tipo celular o en las mismas subcélulas de un compartimento que el sustrato. Esto se realiza típicamente mediante el silenciamiento mediado por ARNi del candidato.También es posible realizar una pantalla secundaria utilizando un mutante no fosforilable del sustrato para confirmar la especificidad.

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