Identificación de los pares quinasa-sustrato Usando selección de alto rendimiento

El objetivo general de este procedimiento es identificar quinasas que fosforilan un sustrato de interés utilizando métodos de cribado de alto rendimiento. Esto se logra primero transfectando células con plásmidos que expresan quinasas FU a glutatión S-transferasa o GST. El segundo paso consiste en realizar un ensayo de inmovilización de quinasas mediante GST.

A continuación, las muestras se cargan en geles, los cuales se someten a electroforesis y se tiñen con el colorante azul brillante de kumasi. El paso final consiste en secar los geles y exponerlos a una película de auto radiografía. Finalmente, mediante el revelado e interpretación de las películas resultantes, es posible identificar pares de sustratos de quinasas, ya que cada carril representa un ensayo de quinasa distinto.

Los métodos existentes para identificar una quinasa para un sustrato fosforilado conocido incluyen el uso de enfoques bioinformáticos para buscar un sitio de consenso en el sustrato, la detección de complejos entre quinasas y sustratos mediante técnicas bioquímicas y un enfoque de ensayo y error, así como la búsqueda de sustratos de consenso basándose en su función biológica conocida. Estos enfoques son lentos y no siempre tienen éxito. Nuestro enfoque permite la identificación rápida de pares quinasa-sustrato basada en resultados funcionales.

Cuando tuvimos por primera vez la idea de este método, nos preocupaba que hubiera una especificidad insuficiente in vitro. Resulta que la especificidad del sustrato es excelente y a menudo encontramos que solo las quinasas de un mismo grupo familiar son capaces de fosforilar un sustrato determinado en la prueba. Esto es particularmente evidente cuando realizamos pruebas multiplexadas utilizando múltiples sustratos en cada ensayo, demostrando que el procedimiento lo realizará Courtney, una técnica de mi laboratorio. Comience el procedimiento con la preparación de los reactivos, placas y células según se describe en el protocolo escrito.

Si las placas que contienen los plásmidos de quinasas han estado congeladas, descongélelas a temperatura ambiente y centrifúguelas a 1900 veces G durante tres minutos para recoger cualquier humedad en el fondo de los pozos. Mezcle 8,6 mililitros de medio con suero reducido con 312,7 microlitros de reactivo de transfección basado en lípidos, y deje que la mezcla repose durante cinco minutos en cada pozo. De la placa de 96 pozos que contiene los plásmidos de quinasas, agregue 10 microlitros del medio con suero reducido.

Utilizando un dispensador automático de líquidos equipado con un casete de pequeño volumen, agregue luego 10 microlitros de la mezcla de reactivo de transfección en medio de suero reducido por pozo, empleando un dispensador automático de líquidos provisto de un casete de pequeño volumen, y deje reposar la placa durante 20 a 45 minutos. A continuación, resuspenda las células 293T a una concentración de 0,75 millones de células por mililitro en 80 mililitros de medio DMEM completo modificado o medio DMEM, añadiendo 100 microlitros de la suspensión celular por pozo. Utilizando un dispensador automático de líquidos equipado con un casete de volumen estándar, revise los pozos bajo el microscopio para verificar una distribución uniforme de las células antes de devolver la placa a una incubadora a 37 grados Celsius durante 24 horas.

Para comenzar el experimento de precipitación de quinasa GST, prepare una solución de vanadato de cuatro milimolar mezclando 60 microlitros de vanadato de sodio 0,2 molar con 540 microlitros de agua. En un segundo tubo, mezcle 2,7 microlitros de peróxido al 30 % y 1,4 mililitros de solución salina tamponada con fosfato o PBS. Combine ambas soluciones y deje la mezcla reposar durante 15 minutos antes de usarla.

Utilizando una pipeta multicanal, dispensar dos microlitros de cloruro de calcio 0,25 molar en cada pocillo, seguido de 2,5 microlitros de la solución de ADN comprobada. Incubar cada placa a 37 grados Celsius durante 10 minutos y luego colocar sobre hielo, manteniendo las placas en hielo. Retirar el medio de cada pocillo, utilizando al vacío inmediatamente 50 microlitros por pocillo de tampón de lisis frío.

Utilizando un dispensador automático de líquidos equipado con el casete estándar, deje la placa durante 30 minutos en hielo para licuar. Después de centrifugar las placas a 1900 ×g durante tres minutos a cuatro grados Celsius, raspe las células de cada pocillo utilizando una pipeta multicanal y transfiera todo el contenido a tubos vbo debidamente etiquetados. Para placas de 96 pocillos, centrifugue las placas a 1900 ×g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius; durante la centrifugación, agregue a las placas recubiertas con glutatión 100 µL por pocillo de tampón de lisis frío.

Como medida de enjuague, mantenga las placas sobre hielo. Tras la centrifugación de las placas con fondo V, invierta las placas de glutatión sobre un fregadero para eliminar el tampón de lisis agitándolas suavemente y séquelas con una toalla de papel. Transfiera el tampón de lisis desde las placas con fondo V a las placas de glutatión inclinando la placa y utilizando una pipeta multicanal, teniendo cuidado de no perturbar el precipitado en el fondo.

Luego, cubra las placas y déjelas en hielo durante un mínimo de dos horas. Cerca del final del paso de incubación de dos horas, prepare una estación de trabajo con radioactividad asegurando que las precauciones de seguridad necesarias estén en su lugar para trabajar con material radiactivo. Ajuste el horno de hibridación a 30 grados Celsius.

Dar la vuelta a las placas de glutatión sobre un fregadero para eliminar el tampón de lisis y secar sobre una toalla de papel. Enjuagar los pocillos tres veces con 100 microlitros de tampón de lisis sin PMSF. No permitir que los pocillos se sequen.

Manténgalos en el lavado hasta que esté listo para continuar. A continuación, prepare 55 mililitros de tampón de quinasa 1X o 1x kb según se describe en el protocolo del texto. Añada 50 microlitros de 1x kb a cada pocillo de la placa utilizando un dispensador automático de líquidos equipado con un casete de volumen estándar.

Luego prepare la solución A elaborando una solución que contenga el sustrato de interés y la proteína básica de mielina o MVP, según se describe en el protocolo escrito, uno a la vez. Invierta las placas sobre un fregadero para eliminar el lavado de XKB y séquelas sobre una toalla de papel, y agregue inmediatamente 30 microlitros de la solución A utilizando un dispensador automático de líquidos equipado con un cassette de pequeño volumen. Mantenga las placas en hielo.

A continuación, prepare la solución B en el área de trabajo con radioactividad según lo descrito en el protocolo escrito, utilizando 20 microlitros de solución B por pocillo. Mediante una pipeta repetidora, que facilita la mezcla debido a la fuerza de expulsión, agregue la solución, tápela y coloque la placa en un horno de hibridación a 30 grados Celsius durante 30 minutos. Pasados los 30 minutos, transfiera las placas nuevamente al hielo.

Luego, agregue 50 microlitros de tampón de lisis de sulfato de sodio dodecil sulfato dos veces (SDS) a cada pocillo utilizando una pipeta multicanal. Todo el trabajo en esta sección debe realizarse en un área designada para actividades radiactivas. Encienda el horno de hibridación y ajústelo a 85 grados Celsius.

Una vez que el horno haya alcanzado la temperatura, transfiera las placas al horno e incube durante 10 minutos para desnaturalizar las muestras. A continuación, cargue geles precolados de 26 pozos con 15 microlitros de cada reacción.

Al utilizar una pipeta multicanal para llenar varios pocillos a la vez, se debe tener cuidado de que todas las puntas se alineen con los pocillos correspondientes. Antes de agregar las muestras, haga correr el gel a 150 voltios. No permita que la línea azul salga por el fondo del gel, ya que contiene el ATP no incorporado. Luego desarme los geles y elimine el ATP no incorporado, ya que oscurecerá la exposición del gel en las películas.

Coloque los geles en recipientes etiquetados y cúbralos con tinción de kumasi durante 15 minutos. A continuación, retire la tinción de kumasi. Enjuague brevemente los geles con agua y agregue la solución reveladora.

Retenga los geles hasta que las proteínas sean claramente visibles. Debe observarse una banda para MVP y una banda para el sustrato en cada muestra. Para secar los geles, corte una hoja grande de papel filtro y colóquela sobre el secador.

Humedezca una hoja de celofán con agua destilada hasta que quede lisa y sin arrugas, y colóquela encima del papel. Coloque los geles encima de la hoja de celofán, anotando el orden de los geles. Humedezca una segunda hoja de celofán y colóquela encima de los geles.

Extienda eliminando todas las burbujas para obtener una superficie uniforme. Cierre la solapa, encienda el vacío y caliente los geles durante tres horas a 80 grados Celsius. Una vez que los geles estén secos, expóngalos a una película de autorradiografía de doble emulsión utilizando una pantalla para intensificar la señal.

Envuelva el casete con envoltura de plástico o una bolsa de plástico y séllelo con cinta para evitar la formación de escarcha antes de almacenar el casete a menos 80 grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, retire el casete del congelador y déjelo descongelar a temperatura ambiente. Revele la película en un cuarto oscuro utilizando un procesador de películas según las instrucciones del fabricante indicadas.

A continuación se presentan resultados representativos de un análisis en el que se examinaron 180 quinasas utilizando un sustrato peptídico con etiqueta GST correspondiente a los aminoácidos 268 a 283 del coactivador transcripcional regulado por Krebs dos o CRTC dos, así como el sustrato clásico para ensayos de quinasa, la proteína básica de la mielina o MBP. Las quinasas mark dos y la quinasa estrechamente relacionada mark tres se fosforilaron. El péptido CRTC dos y MBP se incluyeron como controles internos en todos los ensayos, ya que contienen muchos residuos susceptibles de fosforilación y migran a 18 kilodalton, cerca de la parte inferior del gel.

Esto permite una interpretación de la especificidad. Algunas quinasas fosforilarán de manera robusta un sustrato y el MVP. Es importante señalar que los pocillos que contienen solo GST siempre purifican cierta actividad quinasa endógena.

Por lo tanto, siempre existe una fosforilación de fondo en el ensayo. Si bien esto no descarta que la fosforilación del sustrato sea real, sí sugiere que, en condiciones in vitro, la quinasa puede ser menos selectiva. Es particularmente informativo incluir múltiples sustratos de diferentes pesos moleculares para obtener conclusiones sobre la especificidad de sustrato de la quinasa.

Dado que la pantalla es in vitro y existen niveles adicionales de complejidad in vivo, un cinasa candidato debe validarse en células. Por ejemplo, un cinasa candidato puede tener la capacidad de fosforilar un sustrato in vitro, pero no estar expresado en el mismo tipo celular o en las mismas subcélulas de un compartimento que el sustrato. Esto se realiza típicamente mediante el silenciamiento mediado por ARNi del candidato.

También es posible realizar una pantalla secundaria utilizando un mutante no fosforilable del sustrato para confirmar la especificidad.