Identificación de los pares quinasa-sustrato Usando selección de alto rendimiento

El objetivo general de este procedimiento es identificar las cinasas que fosforilan un sustrato de interés mediante métodos de cribado de alto rendimiento. Esto se logra primero seccionando células con plásmidos que expresan quinasas FU a glutatión como transferasa o GST. El segundo paso es realizar una reducción de la quinasa GST.

A continuación, las muestras se cargan en geles, que luego se ejecutan y se tiñen con tinte azul brillante kumasi. El paso final es secar los geles y exponerlos a una película de radiografía automática. En última instancia, mediante el desarrollo y la interpretación de las películas resultantes, se pueden identificar los pares de sustratos de quinasa, ya que cada carril es representativo de un ensayo de quinasa distinto.

Los métodos existentes para identificar una quinasa para un sustrato fosforilado conocido incluyen el uso de enfoques bioinformáticos para buscar un sitio de consenso en el sustrato, la detección de complejos entre la cinasa y los sustratos utilizando técnicas bioquímicas y un enfoque de prueba y error, la búsqueda de sustratos de consenso sobre la base de su función biológica conocida. Estos enfoques requieren mucho tiempo y no siempre tienen éxito. Nuestro enfoque permite la identificación rápida de pares de sustratos de quinasas sobre la base de los resultados funcionales.

Cuando tuvimos la idea de este método, nos preocupaba que no hubiera suficiente especificidad in vitro. Resulta que la especificidad del sustrato es excelente y, a menudo, encontramos que solo las quinasas de los miembros de la familia pueden fosforilar un sustrato determinado en la pantalla. Esto es particularmente evidente cuando multiplexamos usando múltiples sustratos en cada pantalla, demostrando el procedimiento será Courtney, un técnico de mi laboratorio Comience el procedimiento con la preparación de reactivos, placas y celdas como se describe en el protocolo de texto.

Si las placas que contienen plásmidos de quinasa se han congelado, descongele a temperatura ambiente y centrifugue a 1900 veces G durante tres minutos para recoger la humedad en el fondo de los pocillos. Mezcle 8,6 mililitros de medio sérico reducido con 312,7 microlitros de reactivo de transfección a base de lípidos y deje reposar la mezcla durante cinco minutos en cada pocillo. De la placa de 96 pocillos que contiene los plásmidos quinasa a 10 microlitros del medio sérico reducido.

Utilizando un dispensador de líquido automatizado equipado con un casete de pequeño volumen, añada a continuación 10 microlitros de la mezcla de reactivo de transfección de medio sérico reducido por pocillo, utilizando un dispensador de líquido automatizado equipado con un casete de pequeño volumen y deje reposar la placa durante 20 a 45 minutos. A continuación, resus suspende 2 células T de 93 a 0,75 millones de células por mililitro en 80 mililitros de delcos completos modificados igual al medio o DMEM a 100 microlitros de la suspensión celular por pocillo. Usando un dispensador de líquido automatizado equipado con un casete de volumen estándar, revise los pocillos bajo un microscopio para verificar una distribución celular uniforme antes de devolver la placa a una incubadora a 37 grados Celsius durante 24 horas.

Para comenzar el experimento de tirar hacia abajo de la quinasa GST. Hacer una solución de cuatro milimolares por vanadato mezclando 60 microlitros de vanadato de sodio 0,2 molar con 540 microlitros de agua en un segundo tubo mezclado 2,7 microlitros de peróxido al 30% y 1,4 mililitros de solución salina tamponada con fosfato o PBS. Agregue las dos soluciones juntas y deje reposar la mezcla durante 15 minutos antes de usarla.

Con una pipeta multicanal, dispense dos microlitros de cloruro de calcio 0,25 molar en cada pocillo, seguidos de 2,5 microlitros de la solución de dátil probada. Incubar cada placa a 37 grados centígrados durante 10 minutos y luego colocarla en hielo, manteniendo las placas en hielo. Retire el medio de cada pocillo, usando un vacío inmediatamente a 50 microlitros por pocillo de tampón de lisis helado.

Usando un dispensador de líquido automatizado equipado con el casete estándar, deje reposar el plato durante 30 minutos sobre hielo para los piojos. Después de hacer girar las placas a 1900 veces G durante tres minutos a cuatro grados Celsius, raspe las celdas de cada pocillo con una pipeta multicanal y transfiera todo el contenido a un vbo debidamente etiquetado. Las placas de 96 pocillos hacen girar las placas a 1900 veces G durante 10 minutos a cuatro grados Celsius durante el centrifugado y llenan las placas recubiertas de glutatión con 100 microlitros por pocillo de tampón de lisis helado.

Como enjuague, mantenga los platos en hielo. Después de la centrifugación de las placas inferiores, invierta las placas de glutatión sobre un fregadero para sacudir el tampón de lisis y seque una toalla de papel. Transfiera el tampón de lisis de las placas inferiores en V a las placas de glutatión inclinando la placa y utilizando una pipeta multicanal, teniendo cuidado de no alterar el pellet en la parte inferior.

A continuación, cubra las placas y déjelas en hielo durante un mínimo de dos horas. Para atar cerca del final de la etapa de atado de dos horas, prepare una estación de trabajo de radiactividad que se asegure de que se tomen las precauciones de seguridad necesarias para el trabajo radiactivo. Pon el horno de hibridación a 30 grados centígrados.

Invierta las placas de glutatión sobre un fregadero para sacudir el tampón de lisis y seque una toalla de papel. Enjuague los pocillos tres veces con 100 microlitros de tampón de lisis sin PMSF. No deje que los pozos se sequen.

Manténgalos en el enjuague hasta que estén listos para continuar. A continuación, prepare 55 mililitros de un tampón de quinasa X o un x kb como se describe en el protocolo de texto. Añada 50 microlitros de un x kb a cada pocillo de la placa utilizando un dispensador de líquido automatizado equipado con un casete de volumen estándar.

A continuación, prepare la solución A haciendo una solución que contenga el sustrato de interés y la proteína básica de mielina o MVP, como se detalla en el protocolo de texto, una a la vez. Invierta los platos sobre un fregadero para eliminar el XKB Enjuague la parcela en una toalla de papel e inmediatamente agregue 30 microlitros de solución A. Usando un dispensador de líquido automático equipado con un casete de pequeño volumen. Mantenga los platos en hielo.

A continuación, prepare la solución B en el área de trabajo de radiactividad como se describe en el protocolo de texto a 20 microlitros de solución B por pocillo. Usando una pipeta repetidora, que ayuda a mezclar debido a la fuerza de expulsión, cubra e incube la placa en un horno de hibridación a 30 grados centígrados durante 30 minutos. Después de 30 minutos, vuelva a colocar los platos en hielo.

A continuación, añada 50 microlitros de dos x sulfato de sodio o tampón de lisis SDS a cada pocillo utilizando una pipeta multicanal. Todos los trabajos de esta sección deben realizarse en un área designada para la actividad de radio. Encienda el horno de hibridación y ajústelo a 85 grados centígrados.

Una vez que el horno haya alcanzado la temperatura, transfiera las placas al horno e incube durante 10 minutos para desnaturalizar las muestras. Siguiente carga. 26 pocillos de geles prefabricados con 15 microlitros de cada reacción.

Al usar una pipeta multicanal para llenar varios pocillos a la vez, se debe tener cuidado de que todas las puntas se alineen con los pocillos correspondientes. Antes de agregar las muestras, haga funcionar el gel a 150 voltios. No dejes que la línea azul se salga de la parte inferior del gel, ya que contiene el A TP no incorporado. A continuación, desmonte los geles y retire el TP no incorporado, ya que oscurecerá la exposición al gel de las películas.

Coloque los geles en recipientes etiquetados y cúbralos con tinte de kumasi durante 15 minutos. A continuación, retira la mancha de kumasi. Enjuague brevemente los geles con agua y agregue la solución de retención.

Retenga los geles hasta que las proteínas sean claramente visibles. Una banda para el MVP y una banda para el sustrato deben ser visibles para cada muestra. Para secar los geles, corta una hoja grande de papel de filtro y colócala en la secadora.

Humedece una hoja de celofán en agua destilada hasta que quede lisa y sin arrugas y colócala encima del papel. Coloque los geles encima de la hoja de celofán tomando nota del orden de los geles. Humedece una segunda hoja de celofán y colócala encima de los geles.

Extienda todas las burbujas para obtener una superficie agradable y uniforme. Cierre la solapa, encienda la aspiradora y conduzca los geles durante tres horas a 80 grados centígrados. Una vez que los geles estén secos, expóngalos a una película de autorradiografía de doble emulsión usando una pantalla para intensificar la señal.

Envuelva el casete con una envoltura de saran o una bolsa de plástico y séllelo con cinta adhesiva para evitar las heladas antes de almacenar el casete a menos 80 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, saca el casete del congelador y déjalo descongelar a temperatura ambiente. Revele la película en una habitación oscura usando un procesador de película de acuerdo con las instrucciones del fabricante que se muestran.

A continuación, se muestran los resultados representativos de un cribado: se examinaron 180 quinasas utilizando un sustrato peptídico marcado con GST A correspondiente a los aminoácidos 268 a 283 del coactivador transcripcional regulado por kreb dos o C RTC dos, así como el sustrato clásico del ensayo de quinasasa, la proteína básica de mielina o MBP solo dos. Las quinasas marcan dos y la quinasa altamente relacionada, marca tres fosforilados. El CRTC de dos péptidos MBP se incluye como control interno en todos los ensayos, ya que contiene muchos residuos de fosforilo identificables y corre a 18 kilodaltons hacia el fondo del gel.

Esto permite una interpretación de la especificidad. Algunas quinasas fosforilan de forma robusta un sustrato y MVP. Cabe destacar que los pocillos que contienen GST solo siempre purifican alguna actividad de quinasa endógena.

Por lo tanto, siempre hay fosforilación de fondo en el ensayo. Si bien esto no descarta que la fosforilación del sustrato sea real, sí sugiere que en el entorno in vitro, la quinasa puede ser menos selectiva. Es particularmente informativo incluir múltiples sustratos de diferentes pesos moleculares para sacar conclusiones sobre la especificidad del sustrato de quinasa.

Dado que el cribado es in vitro y se producen niveles adicionales de complejidad in vivo, se debe validar una quinasa candidata en las células. Por ejemplo, una quinasa candidata puede tener la capacidad de fosforilar un sustrato in vitro si no se expresa en el mismo tipo de célula o en las mismas subcélulas de un compartimento que el sustrato. Por lo general, esto se hace mediante el silenciamiento mediado por ARNi del candidato.

También es posible realizar un cribado secundario utilizando un mutante del sustrato no relacionado con el fosforilo para confirmar la especificidad.