Name: Análisis computacional de lo elegans de Caenorhabditis del Germline para estudiar la distribución de núcleos, proteínas y citoesqueleto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Aprende a automatizar el análisis de la línea germinal de Caenorhabditis elegans para estudiar la distribución de núcleos, proteínas y citoesqueleto. Este método reduce el tiempo de análisis y minimiza errores humanos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Agradecemos a Monash Microimaging por su apoyo técnico. Algunas cepas fueron proporcionadas por el centro de genética de Caenorhabditis , que es financiado por los NIH oficina de programas de infraestructura de investigación (P40 OD010440). Este trabajo fue financiado por Monash University biomedicina descubrimiento beca, subvención del proyecto NHMRC (GNT1105374), NHMRC Senior Research Fellowship (GNT1137645) y beca de innovación veski: 23 VIF a Roger Pocock.

1. preparación y la cría de gusano
Nota: Consulte la Tabla de materiales para cualquier información del producto.
<ol><li>OP50 Escherichia coli cultura: cultura OP50 bacteria en caldo de lisogenia (LB) (triptona 1%, 0.5% levadura, 0,5% NaCl, pH 7.0) durante la noche a 37 ° C sin antibióticos.</li>
	<li>Semilla de 400 μL de bacterias OP50 a las placas de los medios de comunicación (NGM) crecimiento nematodos (1,5 g de NaCl, 8,5 g de agar, 1.25 g de peptona, 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de colesterol 5 mg/mL en etanol, 1 mL de 1 M MgSO4 y 25 mL de buffer de4 M 1 KPO) y secar la bacteria durante 48 h.</li>
	<li>Recoger lombrices en las placas sembradas de NGM e incubar a 15 ° C o 20 ° C.<ol>
<li>Para el análisis de la línea germinal hermafrodita adulto, escoge bien alimentados gusanos de L4 al césped bacteriano e incubar durante una noche a 20 ° C.</li>
		<li>Para anotar el número de espermatozoides en hermafroditas, incubar L4 gusanos a 20 ° C por 12 h los gusanos hasta la muda L4, adulto. Para sincronizar los gusanos a la etapa de L4, recogiendo gusanos adultos con una gran cantidad de huevos en la solución de lejía (blanqueador en proporción 1:1 y 1 M NaOH) para preparar huevos. Permita que los huevos eclosionan y escoger L4 animales para el experimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar portaobjetos de teflón colocar 25 μl de solución de poli-l-lisina en la diapositiva y que se separa la solución, utilizando una pipeta. Después de quitar la poli-l-lisina exceso con toalla de papel, deje que los portaobjetos secar al aire e incubar los portaobjetos a 65 ° C durante 15-20 min.</li>
</ol>2. del Germline disección y tinción6,13
<ol><li>Punto 10 μl de tetramisole 0.01% (anestésico) sobre un cubreobjetos de 22 x 22 mm y escoger un día de edad gusanos adultos en él.</li>
	<li>Disecar el gusano en la cola que llega a ser sedado mediante una jeringa (5 mL) y una aguja (24 "x 1") y asegúrese de que la línea germinal no. Nota: La disección debe realizarse antes de que el gusano se convierte en totalmente paralizado por lo que la presión negativa en el gusano y el movimiento de la lombriz ayuda a la expulsión de la línea germinal. De recuento de esperma, deben tomarse precauciones no se dañe la espermateca de la aguja durante la disección. Evite tocar la línea germinal con la aguja excepto el punto de disección después de la espermateca. Si hay rotura en el compartimiento de la línea germinal o cualquier descarga de la línea germinal se observa, la línea germinal no puede usarse para el análisis.</li>
	<li>Coloque el cubreobjetos invertido en un portaobjetos recubierto de poli-l-lisina, manteniendo el germline disecado en la diapositiva.</li>
	<li>Quitar exceso de líquido bajo el cubreobjetos colocando una torre de papel en una esquina del cubreobjetos, entonces lugar la diapositiva en nitrógeno líquido para 1min rápidamente retire lo cubreobjetos utilizando una aguja con la germlines de la diapositiva.</li>
	<li>Transfiera los portaobjetos a metanol-20 ° C durante 30-60 s en una cámara, a continuación, incubar durante 30 min en solución de fijación recién preparada (1 x de tampón fosfato salino (PBS) que contiene 0,08 M HEPES pH 6.9, 1,6 mM de MgSO4, glicol de etileno 0,8 mM-bis(beta-aminoethyl éter)-N, N, N', N'-tetraacético ácido (EGTA) y el 3.7% paraformaldehído) a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar los portaobjetos colocando en una cámara que contiene 1 x PBS, pH 7,4 con 0,1% Tween-20 durante 10 minutos Repita este paso una vez.</li>
	<li>Bloque de germlines con 30 μl de solución de bloqueo (30% de suero de cabra preparado por agregar 900 μl de suero de cabra en 1700 μl de agua destilada H2O y 300 μL de PBS x 10) en una cámara húmeda preparada mediante la colocación de toalla de papel húmeda en una caja de plástico a temperatura ambiente durante 30 minutos.</li>
	<li>Añadir 50 μl de solución de anticuerpo REC-8 preparado en 30% de suero de cabra en una relación 1:300 para cada muestra. Incubar durante una noche a 4° C.</li>
	<li>Lavar los portaobjetos colocando en una cámara que contiene 1 x PBS con un 0.1% Tween-20 durante 10 minutos repetir el paso una vez y quitar exceso de líquido mediante la colocación de una toalla de papel en la esquina de la diapositiva.</li>
	<li>Preparar solución de anticuerpo secundario diluyendo verde fluoróforo (488 nm longitud de onda emisión) anticuerpo secundario conjugado (1: 1000), phalloidin (mancha de actina, 1:4000) y DAPI (tinción de ADN, 1:4000) en el 30% de suero normal de cabra.</li>
	<li>Añadir 50 μl de solución de anticuerpo secundario a la diapositiva.</li>
	<li>Incubar durante 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar los portaobjetos dos veces colocando en una cámara que contiene 1 x PBS con un 0.1% Tween 20 durante 10 minutos Limpie el exceso de líquido.</li>
	<li>Añadir 30 μl de reactivo en la diapositiva de fijación y poner una de 12 mm2 x 1,5 μm cubreobjetos encima y secar los portaobjetos a 4 ° C durante la noche.</li>
</ol>3. confocal microscopio
<ol><li>Encienda el microscopio confocal láser, scanner resonancia y software del microscopio confocal. Coloque los portaobjetos con tinción germlines en el soporte de diapositivas sobre el objetivo X 63.</li>
	<li>Localice una línea germinal, foco en la parte superior de la línea germinal y márquela utilizando el software del microscopio confocal. Del mismo modo se centran en la parte inferior de la línea germinal y marcar para establecer el espesor total del germline.</li>
	<li>Imagen de la línea germinal todo definiendo el espesor de cada rebanada hasta 0.5 μm. marca la completa adquisición del germline y comienzo. Analizar cada rebanada 8 veces y promedio de los valores para mejorar la calidad de la imagen. El escáner de resonancia permite escaneo rápido para evitar la decoloración durante proyección de imagen. Si el microscopio no tiene un escáner de resonancia, reducir el número de exploraciones a cuatro para evitar el blanqueo.</li>
</ol>4. post de análisis de núcleos de número y la distribución
Nota: Consulte la figura 1 complementaria para imágenes de los botones usados y herramientas de software.
<ol><li>Importar la imagen a Imaris 8.4.1 o versiones posteriores del software.</li>
	<li>Definir región mitotic, zona de transición, región meiótica, región de ovocitos y espermateca de la línea germinal por identificar la morfología nuclear en cada región.</li>
	<li>Utilice el botón function superficial (figura suplementaria 1A) del software para seleccionar la región de interés.</li>
	<li>Cancelar el Asistente para la creación automática de superficie y dibujar manualmente la región de interés en el primer y último segmento de la imagen de la pila tridimensional.</li>
	<li>Haga clic en crear superficie. Nota: El software desarrollará automáticamente las pilas entre la primera y la última pila.</li>
	<li>Todos los canales excepto DAPI la máscara haciendo clic en botón de canal de máscara (Suplementario Figura 1B-C).</li>
	<li>Definir los parámetros de tamaño nuclear usando el botón spot (complementario de la figura 1A). Para la región de mitotic, definen un diámetro de 2 μm XY dejando diámetro Z indefinido. Para la zona de transición, definen un diámetro de 2 μm XY y Z diámetro como 1,5 μm. (suplementario Figura 1). Nota: Resuelva los diámetros según la ampliación y las especificaciones del microscopio. El protocolo actual, el objetivo utilizado fue 63 X y extra 1,70 aumentos durante proyección de imagen. Si el objetivo cambia, por ejemplo 40 X, los diámetros deben modificarse en consecuencia. Solución de problemas debe realizarse con germlines de tipo salvaje para establecer los parámetros correctos. La región mitotic de un brazo del germline de tipo salvaje tiene aproximadamente 250 núcleos. El diámetro debe ser modificado para alcanzar este valor. Use al menos 15 germlines para determinar el valor óptimo para el diámetro. Un enfoque similar puede usarse para calibrar la región meiótica (600-700 núcleos) y zona de transición (núcleos de 150-170).</li>
	<li>Límite de detección de puntos definiendo el umbral mínimo (suplementario Figura 1E). Uso DAPI teñido tipo salvaje germlines para establecer el umbral mínimo aumentando el umbral mínimo de representación tridimensional hasta que aparezca el primer lugar fuera de la línea germinal.</li>
	<li>Guardar la imagen y obtener el número de núcleos de la tabla generada automáticamente por el software. Exportar las imágenes como archivos TIF.</li>
</ol>5. publicar imagen análisis de recuento de espermatozoides y el número de cromosomas
<ol><li>Realizar representación tridimensional mediante la selección de la espermateca como la región de interés. Para detectar cada esperma, definir el diámetro del punto entre 0.75 - 1.0 μm para X y Y-eje, mientras que diámetro Z sigue siendo indefinido. Utilice el botón de función de los puntos como se muestra en la figura 1 complementaria.</li>
	<li>Restar el fondo marcando fondo resta caja y utilizando los valores de corrección de fondo calculados por el software (suplementario Figura 1). Nota: Software Imaris recoge puntos de alta intensidad en primer lugar, por lo tanto el efecto de fondo es mínimo siempre y cuando no hay diferencias significativas entre la región de interés y el fondo. Un segundo método es definir manualmente la corrección de fondo, en su caso, los valores se pueden dar para el fondo. Corrección de fondo manual será apropiado si la intensidad de muestras independientes necesita comparación.</li>
	<li>Ajustar el umbral de representación tridimensional para detectar todos de DAPI manchado de esperma en la espermateca (suplementario Figura 1E).</li>
	<li>Para contar los cromosomas, definir el diámetro del punto < 0.75 μm para X y Y-eje antes de desarrollar modelos tridimensionales.</li>
	<li>La imagen de guardar y exportar como archivo TIF.</li>
</ol>6. Análisis de imagen para el citoesqueleto reconstrucción de la línea germinal de correos
<ol><li>Identificar la región de interés en la línea germinal y enmascarar todos los canales excepto phalloidin haciendo clic en el botón máscara de canales .</li>
	<li>Definir un detalle superficial de 0.25 μm utilizando el botón de función superficie (suplementario Figura 1). Nota: Esto significa que se mostrará cada 0.25 μm en modelos tridimensionales. Detalle superficial puede ser constante para cualquier región de la línea germinal donde se creará un modelo tridimensional de la superficie para cada 0.25 μm. Sin embargo, para la región de ovocitos, detalle superficial se puede aumentar a 0.35 - 0.5 μm debido la presencia de fibras de actina definidas en esta región.</li>
	<li>Restar el fondo marcando fondo resta caja y utilizando los valores de corrección de fondo calculados por el software (suplementario Figura 1).</li>
	<li>Ajustar el umbral de representación tridimensional dependiendo de la estructura que requieren análisis (suplementario Figura 1E).</li>
	<li>Guardar la imagen tridimensional desarrollada y exportar como un archivo TIF.</li>
</ol>

<ol><li>Hubbard, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+germ+line%3A+a+model+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans germ line: a model for stem cell biology.</a> Dev Dyn. 236 (12), 3343-3357 (2007).</li>
<li>Joshi, P. M., Riddle, M. R., Djabrayan, N. J., Rothman, J. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20419785">Caenorhabditis elegans as a model for stem cell biology.</a> Dev Dyn. 239 (5), 1539-1554 (2010).</li>
<li>Kershner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+stem+cells+and+their+regulation+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Germline stem cells and their regulation in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Adv Exp Med Biol. 786, 29-46 (2013).</li>
<li>Byrd, D. T., Knobel, K., Affeldt, K., Crittenden, S. L., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DTC+niche+plexus+surrounds+the+germline+stem+cell+pool+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A DTC niche plexus surrounds the germline stem cell pool in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 9 (2), 88372(2014).</li>
<li>Kimble, J., Crittenden, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controls+of+germline+stem+cells%2C+entry+into+meiosis%2C+and+the+sperm%2Foocyte+decision+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the sperm/oocyte decision in Caenorhabditis elegans.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 405-433 (2007).</li>
<li>Hansen, D., Hubbard, E. J., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-pathway+control+of+the+proliferation+versus+meiotic+development+decision+in+the+Caenorhabditis+elegans+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline.</a> Dev Biol. 268 (2), 342-357 (2004).</li>
<li>Crittenden, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+RNA-binding+protein+controls+germline+stem+cells+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A conserved RNA-binding protein controls germline stem cells in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 417 (6889), 660-663 (2002).</li>
<li>Eckmann, C. R., Crittenden, S. L., Suh, N., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLD-3+and+control+of+the+mitosis%2Fmeiosis+decision+in+the+germline+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">GLD-3 and control of the mitosis/meiosis decision in the germline of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 168 (1), 147-160 (2004).</li>
<li>Schumacher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+repression+of+C.+elegans+p53+by+GLD-1+regulates+DNA+damage-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Translational repression of C. elegans p53 by GLD-1 regulates DNA damage-induced apoptosis.</a> Cell. 120 (3), 357-368 (2005).</li>
<li>McMullen, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macro-level+modeling+of+the+response+of+C.+elegans+reproduction+to+chronic+heat+stress%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Macro-level modeling of the response of C. elegans reproduction to chronic heat stress.</a> PLoS Comput Biol. 8 (1), 1002338(2012).</li>
<li>Hubbard, E. J., Korta, D. Z., Dalfo, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22872476">Physiological control of germline development.</a> Adv Exp Med Biol. 757, 101-131 (2013).</li>
<li>Wolke, U., Jezuit, E. A., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-dependent+cytoplasmic+streaming+in+C.+elegans+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Actin-dependent cytoplasmic streaming in C. elegans oogenesis.</a> Development. 134 (12), 2227-2236 (2007).</li>
<li>Jones, A. R., Francis, R., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLD-1%2C+a+cytoplasmic+protein+essential+for+oocyte+differentiation%2C+shows+stage-+and+sex-specific+expression+during+Caenorhabditis+elegans+germline+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">GLD-1, a cytoplasmic protein essential for oocyte differentiation, shows stage- and sex-specific expression during Caenorhabditis elegans germline development.</a> Dev Biol. 180 (1), 165-183 (1996).</li>
<li>Hasegawa, E., Karashima, T., Sumiyoshi, E., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+CPB-3+interacts+with+DAZ-1+and+functions+in+multiple+steps+of+germline+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">C. elegans CPB-3 interacts with DAZ-1 and functions in multiple steps of germline development.</a> Dev Biol. 295 (2), 689-699 (2006).</li>
<li>Austin, J., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((glp-1+is+required+in+the+germ+line+for+regulation+of+the+decision+between+mitosis+and+meiosis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">glp-1 is required in the germ line for regulation of the decision between mitosis and meiosis in C. elegans.</a> Cell. 51 (4), 589-599 (1987).</li>
<li>Berry, L. W., Westlund, B., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ-line+tumor+formation+caused+by+activation+of+glp-1%2C+a+Caenorhabditis+elegans+member+of+the+Notch+family+of+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Germ-line tumor formation caused by activation of glp-1, a Caenorhabditis elegans member of the Notch family of receptors.</a> Development. 124 (4), 925-936 (1997).</li>
<li>Fox, P. M., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Germline+Stem+Cell+Differentiation+Following+Loss+of+GLP-1+Notch+Activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201 (1), 167-184 (2015).</li>
<li>Pasierbek, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Caenorhabditis+elegans+cohesion+protein+with+functions+in+meiotic+chromosome+pairing+and+disjunction%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">A Caenorhabditis elegans cohesion protein with functions in meiotic chromosome pairing and disjunction.</a> Genes and Development. 15 (11), 1349-1360 (2001).</li>
<li>Klass, M., Wolf, N., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+male+reproductive+system+and+sexual+transformation+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of the male reproductive system and sexual transformation in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 52 (1), 1-18 (1976).</li>
<li>Korta, D. Z., Tuck, S., Hubbard, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S6K+links+cell+fate%2C+cell+cycle+and+nutrient+response+in+C.+elegans+germline+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">S6K links cell fate, cell cycle and nutrient response in C. elegans germline stem/progenitor cells.</a> Development. 139 (5), 859-870 (2012).</li>
<li>Laband, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+segregation+occurs+by+microtubule+pushing+in+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Chromosome segregation occurs by microtubule pushing in oocytes.</a> Nat Commun. 8 (1), 1499(2017).</li>
</ol>

Los autores no declaran conflicto de intereses.

El objetivo de este protocolo es mejorar la precisión y reducir el tiempo requerido para el análisis de la línea germinal. Después de la preparación estándar de germlines disecada, un modelo tridimensional de los núcleos de la línea germinal se prepara por procesamiento computacional. Permitiendo la observación de la distribución de los núcleos del germline en el espacio, representación tridimensional calcula el número de núcleos en regiones específicas de la línea germinal. El aspecto crítico de nuestro método es la def...

La conservación de la señalización de las vías con los mamíferos hace C. elegans un excelente modelo para estudiar varios procesos biológicos1,2. En nuestro laboratorio utilizamos el germline de C. elegans para estudiar el desarrollo de la célula de vástago, apoptosis y expresión génica. Mientras que la línea germinal es una estructura tridimensional, muchos estudios son dos dimensiones debido a la naturaleza desperdiciadora de tiempo y mano de obra intensiva de análisis tridimensional. Es muy probable que el análisis de dos dimensiones pueden tergiversar en vivo eventos en la línea germinal. El hermafrodita adulto de C. elegans tiene dos brazos del germline, que alberga una célula somática punta distal (DTC) que mantiene las células de germen distales en un estado indiferenciado3,4. Estas células germinales empiezan a diferenciar como se alejan de la DTC, escapar de su influencia y se convierten en ovocitos y los espermatozoides que alcanzan el extremo proximal de la línea germinal. Durante este proceso, núcleos de la célula de germen sufren mitosis, antes de hacer la transición a la meiosis5,6. La producción de espermatozoides se completa con la etapa de larvas 4 (L4) del desarrollo, después de lo cual se producen óvulos durante la edad adulta. Los espermatozoides se almacenan en la espermateca donde fertilizan óvulos para generar embriones.
Hay múltiples factores genéticos y ambientales que pueden influir en el desarrollo del germline en C. elegans , dando por resultado cambios en el número de núcleos, número de eventos apoptóticos, dinámica del cromosoma y expresión de la proteína o localización7 ,8,9,10,11. El análisis de estos eventos requiere la identificación de cada etapa de diferenciación basada en la distribución y morfología nuclear. Para analizar con precisión estos parámetros manualmente con un tamaño de muestra grande es trabajosa y requiere mucho tiempo. Para eludir estos inconvenientes y la consistencia del análisis, hemos desarrollado un método automatizado para examen tridimensional del C. elegans del germline para conteo de núcleos, distribución de los núcleos, expresión de la proteína y citoesqueleto estructura. Mediante la combinación de microscopía confocal con representación tridimensional, nos genera parámetros de tamaño y forma para la identificación de cada etapa de la diferenciación de la célula de germen. Además, este método permite conteo de núcleos de la célula de germen y el esperma más puntuación del número de cromosomas en cada ovocito.
Una estructura crucial en la línea germinal es el citoesqueleto, que proporciona estabilidad al compartimiento del germline, SIDA citoplasmática y protección a germline núcleos12. Utilizando procesamiento computacional, se realizó la reconstrucción tridimensional del citoesqueleto del germline e identificaron citoesqueleto características dentro de la línea germinal. Aquí, describimos un protocolo paso a paso para ilustrar cómo computacional análisis combinado con proyección de imagen confocal permite análisis completo de la línea germinal de C. elegans .
Proponemos un método rápido para el análisis tridimensional de C. elegans del germline (figura 1). Utilizando el análisis tridimensional, es posible estudiar la cuenta de la distribución tridimensional de los núcleos de la línea germinal (figura 2 y figura 3), automatizado de células (figura 2), reconstrucción del citoesqueleto del germline ( Figura 3), la distribución de las proteínas (figura 4) y anotar el número de espermatozoides de la espermateca y cromosomas en los óvulos (figura 5). El método no permite fácil y precisa la cuantificación de la línea germinal sólo identifica fenotipos fisiológicamente relevantes.

<table><tbody><tr><td>C. elegans cepas: tipo salvaje (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?( q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III&nbsp; </td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP50 Escherichia coli bacterias</td> Placas <td>caseras</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de medios de crecimiento de nematodos (NGM) Conejo</td> policlonal <td>casero</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-REC-8&nbsp;</td><td>SDIX</td><td>29470002</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 anticuerpo conjugado criado en cabra</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A-21236</td><td></td></tr><tr><td>Colorante citoesquelético faloidina&nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A-12380</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific&nbsp;</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lisina&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5899</td><td></td></tr><tr><td>Tetramisol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5899</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>1M Tampón HEPES, pH 7.4&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G0887</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS pH 7.4&nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1389</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>37% Solución de paraformaldehído</td><td>Merck Millipore</td><td>1040031000</td><td></td></tr><tr><td>Suero de cabra normal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo fijador Fluoroshield&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6182</td><td></td></tr><tr><td>Etanol&nbsp;</td><td>Millipore&nbsp;</td><td></td><td></td>1009832511</tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>20&deg; C & 25&deg; CIncubador&nbsp;</td>Microscopio óptico de <td>cualquier marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td> confocal de <td>cualquier marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Cualquier marca (Leica, Zeiss)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ordenador equipado con Imaris suit 8.4.1 o versión posterior, licencia completa para utilizar el software y el software Matlab.</td>Solución salina tamponada <td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phospho, pH 7.4</td><td>Portaobjetos de</td> microscopio de teflón caseros<td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Tekdon &nbsp;</td><td>&nbsp; 941-322-8288</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis computacional de lo elegans de caenorhabditis del germline para estudiar la distribución de núcleos, proteínas y citoesqueleto

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

La línea germinal de Caenorhabditis elegans (C. elegans) se utiliza para estudiar varios procesos biológicamente importantes, incluyendo dinámicas de desarrollo, apoptosis y el cromosoma de la célula de vástago. Mientras que la línea germinal es un excelente modelo, el análisis es a menudo dos dimensional debido al tiempo y mano de obra necesaria para el análisis tridimensional. Lecturas principales en estos estudios son la posición y número de núcleos y la distribución de la proteína dentro de la línea germinal. Aquí, presentamos un método para realizar el análisis automatizado de la línea germinal con microscopia confocal y los enfoques computacionales para determinar el número y posición de los núcleos en cada región de la línea germinal. Nuestro método analiza también la distribución de la proteína del germline que permite el examen tridimensional de expresión de proteínas en diferentes fondos genéticos. Además, nuestro estudio muestra las variaciones en la arquitectura citoesquelética en regiones distintas de la línea germinal que puede acomodar a los requisitos específicos de desarrollo espaciales. Por último, nuestro método permite conteo automatizado de los espermatozoides de la espermateca de cada línea germinal. Tomados en conjunto, nuestro método permite el análisis fenotípico rápido y reproducible de la línea germinal de C. elegans .

Figura 1 indica el tiempo requerido para el análisis tridimensional del germline. Hermafroditas de L4 se incubaron a 20 ° C fueron disecados para aislar germlines y teñidas con DAPI, phalloidin y anticuerpos contra las proteínas de la línea germinal. Germlines son imágenes usando microscopia confocal. Microscopía confocal y tinción requiere aproximadamente 24 h. análisis computacional para el germline completado requiere 10-15 minutos para contar el número y ...

Presentamos un método automatizado para la reconstrucción tridimensional de lo elegans de Caenorhabditis del germline. Nuestro método determina el número y la posición de cada núcleo dentro de la línea germinal y análisis del germline proteínas distribución y estructura citoesquelética.

Análisis computacional de lo elegans de Caenorhabditis del Germline para estudiar la distribución de núcleos, proteínas y citoesqueleto

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

El objetivo general de este método es automatizar el análisis de una línea germinal de Caenorhabditis elegans para estudiar su distribución de núcleos, proteínas y citoesqueletos. Este método puede ayudar a responder las preguntas clave en el campo de C. Elegans sobre el número de núcleos y espermatozoides, la distribución nuclear y la estructura del citoesqueleto de la línea germinal. Las principales ventajas de esta técnica son que reduce el tiempo de análisis, aumenta el tamaño de la muestra y elimina el error humano asociado con el análisis manual.Para obtener imágenes de las muestras, coloque portaobjetos con líneas germinales teñidas en el soporte de portaobjetos por encima del objetivo 63X de un microscopio confocal y localice una línea germinal. Concéntrese en la parte superior de la línea germinal y márquela con el software de microscopio confocal. Cuando se haya establecido el espesor total de la línea germinal, defina el grosor de cada corte hasta 0,5 micrómetros y marque la línea germinal completa.A continuación, inicie la adquisición, escaneando cada corte ocho veces y promediando los valores para mejorar la calidad de la imagen. Cuando se hayan obtenido todas las imág

computational-analysis-caenorhabditis-elegans-germline-to-study

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Imágenes C. elegans Los embriones utilizando un microscopio de epifluorescencia y software de código abierto

La facilidad de mantenimiento y propagación del...

Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos de sincronización y de observación

Aquí se muestra cómo rastrear y cuantificar los procesos de desarrollo en C. elegans. Los métodos presentados se basan en herramientas de código abierto que se pueden implementar fácilmente. Se demuestra cómo reconstruir modelos 3D de forma de células, cómo rastrear manualmente las estructuras subcelulares y cómo analizar el flujo contráctil cortical.

El seguimiento y cuantificación de los procesos de desarrollo en<em&gt; C. elegans</em&gt; Uso de las herramientas de código abierto

Se presenta un método basado en la formación de imágenes de inmunofluorescencia para la localización espacial y temporal de ERK activa en la C. diseccionado gónadas elegans. El protocolo aquí descrito se puede adaptar para la visualización de cualquier señalización o la proteína estructural en la C. elegans gónada, proporciona un reactivo de anticuerpo adecuado está disponible.

Análisis espacial y temporal de ERK en el Activo<em&gt; C. elegans</em&gt; línea germinal

La transparente C. elegans intestino puede servir como una"en vivo cámara de tejido" para el estudio de apicobasal membrana y lumen biogénesis a nivel unicelular y subcelular durante tubulogenesis multicelulares. Este protocolo describe cómo combinar etiquetas estándar, genética/pérdida de función RNAi y enfoques microscópicos para diseccionar estos procesos a nivel molecular.

El intestino C. elegans como modelo una morfogénesis Lumen intercelular y En Vivo biogénesis de la membrana polarizada a nivel unicelular: etiquetado de anticuerpos, ARNi pérdida-de-función análisis y proyección de imagen de

Este estudio describe las mediciones cuantitativas del tamaño y localización sináptica, la morfología muscular y la forma mitocondrial en C. elegans utilizando herramientas de procesamiento de imágenes disponibles libremente. Este enfoque permite que estudios futuros en C. elegans comparen cuantitativamente la extensión de los cambios estructurales de tejidos y orgásis como resultado de mutaciones genéticas.

Enfoques cuantitativos para el estudio de las estructuras celulares y la morfología de los organélilos en Los cenoheman

Este trabajo describe un protocolo de semi-alto rendimiento que permite imágenes simultáneas de lapso de tiempo 3D de embriogénesis en embriones de 80-100 C. elegans en una sola carrera nocturna. Además, se incluyen herramientas de visualización y procesamiento de imágenes para agilizar el análisis de datos. La combinación de estos métodos con cepas de reportero personalizadas permite un seguimiento detallado de la embriogénesis.

Un método de imágenes de semi-alto rendimiento y un kit de herramientas de visualización de datos para analizar el desarrollo embrionario de C. elegans

Este protocolo demuestra el uso del ensayo de ligadura de proximidad para sondear las interacciones proteína-proteína in situ en la línea germinal de C. elegans.

Detección en situ del conjunto del complejo de ribonucleoproteína en la línea germinal de C. elegans utilizando el ensayo de ligadura de proximidad

Este es un método comúnmente utilizado para la disección de gónadas de C. elegans seguida de grieta por congelación, que produce muestras de línea germinal para inmunofluorescencia a través de tinción de anticuerpos, o para tinción DAPI simple para visualizar el ADN. Este protocolo ha sido exitoso para los estudiantes universitarios en un laboratorio de investigación y en una experiencia de investigación de pregrado basada en cursos.

C. elegans Disección de gónadas y grieta por congelación para inmunofluorescencia y tinción DAPI

Aquí proporcionamos instrucciones sobre cómo utilizar eficazmente SegElegans, un sistema de aprendizaje profundo que desarrollamos para la segmentación automatizada de gusanos individuales en imágenes de microscopía de campo amplio, para su uso posterior en software de análisis de imágenes como ImageJ. Proporcionamos formas de utilizar el sistema tanto en línea como fuera de línea.

Análisis automatizado de imágenes de fluorescencia de C. elegans usando SegElegans

Aprende a automatizar el análisis de la línea germinal de Caenorhabditis elegans para estudiar la distribución de núcleos, proteínas y citoesqueleto. Este método reduce el tiempo de análisis y minimiza errores humanos.

Análisis computacional de lo elegans de Caenorhabditis del Germline para estudiar la distribución de núcleos, proteínas y citoesqueleto (Video) | JoVE Journal

Análisis computacional de lo elegans de Caenorhabditis del Germline para estudiar la distribución de núcleos, proteínas y citoesqueleto

Explorar más videos