Análisis computacional de lo elegans de Caenorhabditis del Germline para estudiar la distribución de núcleos, proteínas y citoesqueleto

El objetivo general de este método es automatizar el análisis de una línea germinal de Caenorhabditis elegans para estudiar su distribución de núcleos, proteínas y citoesqueletos. Este método puede ayudar a responder las preguntas clave en el campo de C. Elegans sobre el número de núcleos y espermatozoides, la distribución nuclear y la estructura del citoesqueleto de la línea germinal. Las principales ventajas de esta técnica son que reduce el tiempo de análisis, aumenta el tamaño de la muestra y elimina el error humano asociado con el análisis manual.

Para obtener imágenes de las muestras, coloque portaobjetos con líneas germinales teñidas en el soporte de portaobjetos por encima del objetivo 63X de un microscopio confocal y localice una línea germinal. Concéntrese en la parte superior de la línea germinal y márquela con el software de microscopio confocal. Cuando se haya establecido el espesor total de la línea germinal, defina el grosor de cada corte hasta 0,5 micrómetros y marque la línea germinal completa.

A continuación, inicie la adquisición, escaneando cada corte ocho veces y promediando los valores para mejorar la calidad de la imagen. Cuando se hayan obtenido todas las imágenes, impórtelas a un programa de software de análisis de imágenes apropiado y utilice la herramienta de función de superficie para seleccionar la región mitótica. Aparecerá una imagen del extremo distal de la línea germinal.

Cancele el asistente de creación automática de superficies y dibuje manualmente una región de interés alrededor de la región mitótica en el primer y el último segmento de la imagen de la pila tridimensional. Haga clic en Crear superficie, seguido de Enmascarar canal, para enmascarar todos los canales excepto el canal DAPI. Con la herramienta de función puntual, defina los parámetros de tamaño de la región mitótica con un diámetro XY de dos micrómetros y con el diámetro Z indefinido.

Haga clic en restar fondo para restar el fondo. Para definir el umbral mínimo, aumente el umbral mínimo de representación 3D en una línea germinal de tipo salvaje teñida con DAPI hasta que aparezca el primer punto fuera de la línea germinal y genere un modelo 3D para cada región. Después de guardar las imágenes, haga clic en la tabla para ver el número de núcleos, tal como lo genera automáticamente el software, y exporte las imágenes como archivos TIFF.

Para la zona de transición, cree la superficie como se ha explicado anteriormente. A continuación, haga clic en Enmascarar canal para enmascarar todos los canales excepto el canal DAPI. Con la función puntual, defina un diámetro XY de dos micrómetros y un diámetro Z de 1,5 micrómetros, y haga clic en restar fondo para restar el fondo.

Para definir el umbral mínimo, aumente el umbral mínimo de representación 3D en una línea germinal de tipo salvaje teñida con DAPI hasta que aparezca el primer punto fuera de la línea germinal y genere un modelo 3D para cada región. Después de guardar las imágenes, haga clic en la tabla para ver el número de núcleos, tal como lo genera automáticamente el software, y exporte las imágenes como archivos TIFF. Para puntuar el número de espermatozoides, seleccione la espermateca como región de interés, como se muestra para las regiones de los núcleos, y utilice la herramienta de función puntual para definir el diámetro XY entre 0,75 y un micrómetro con un diámetro Z indefinido para detectar cada espermatozoide.

Seleccione la casilla Restar fondo y utilice los valores de corrección de fondo calculados por el software para restar el fondo. A continuación, ajuste el umbral de renderizado 3D para detectar todos los espermatozoides teñidos con DAPI en la espermateca. Para el recuento de cromosomas en los ovocitos, seleccione los ovocitos y defina el diámetro XY como inferior a 0,75 micrómetros, y defina el umbral antes de desarrollar los modelos 3D.

A continuación, guarde las imágenes para exportarlas como archivos TIFF. Para la reconstrucción de la línea germinal del citoesqueleto, identifique la región mitótica de interés en la línea germinal y cree una máscara de superficie como se demostró anteriormente. Haga clic en Enmascarar canales para enmascarar todos los canales excepto el canal de faloidina y utilice la herramienta de función de superficie para definir un detalle de superficie de 0,25 micrómetros.

Después de restar el fondo, ajuste el umbral de renderizado 3D para guardar la imagen 3D revelada para exportarla como un archivo TIFF. La distribución de los núcleos depende de la etapa de diferenciación. Por ejemplo, en la región mitótica, la actina interna aparece como una masa sólida sobre la que se organizan los núcleos.

En una línea germinal de tipo salvaje, la región mitótica contiene aproximadamente 250 núcleos y está muy repleta de núcleos en comparación con el resto de la línea germinal. Sin embargo, a medida que los núcleos se alejan del extremo distal, parecen estar más cerca de la circunferencia de la línea germinal, con el cambio en la distribución comenzando en la zona de transición y terminando cuando los núcleos entran en la tercera etapa de la profase en la meiosis. En la zona de transición, la actina interna de la línea germinal asume una estructura más cilíndrica, convirtiéndose en un cilindro hueco a medida que alcanza el paquiteno.

La segunda capa de actina cubre la capa interna, dando forma a la línea germinal. Este cilindro dentro de una estructura cilíndrica de actina desaparece hacia la región del ovocito, momento en el que la actina aparece como fibras gruesas que cubren los ovocitos. En la espermateca, la actina también se forma en gruesos haces de fibra, aunque estas fibras parecen estar más juntas que en la región de los ovocitos.

La representación tridimensional del extremo proximal de la línea germinal, como se ha demostrado, revela un promedio de 151 espermatozoides en cada espermateca. Una vez dominado, este análisis se puede completar en 10 minutos por línea germinal. Al intentar este procedimiento, es importante recordar definir los parámetros de análisis de acuerdo con la ampliación del objetivo utilizado para visualizar la línea germinal en su experimento.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar un análisis automático de una línea germinal y estudiar la estructura del citoesqueleto y anotar el número de núcleos dentro de la línea germinal.