Análisis espacial y temporal de ERK en el Activo C. elegans línea germinal

El objetivo general de este experimento es analizar los niveles activos de ERK in vivo en gónadas de C. elegans. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la señalización ERK y las células germinales, como los efectos de los tratamientos farmacológicos o las perturbaciones genéticas en la vía RAS-ERK y, por lo tanto, en el desarrollo de las células germinales. La principal ventaja de esta técnica es que el patrón y la intensidad de la señal ERK se pueden cuantificar in vivo.

Elija de 100 a 150 lombrices en la etapa de desarrollo deseada y recójalas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contenga 100 microlitros de tampón M9. A continuación, llene el tubo de microcentrífuga con 900 microlitros más de tampón M9 y centrifuérrelo a 1000 veces g durante un minuto a temperatura ambiente. Bajo un microscopio de disección, extraiga suavemente 900 microlitros del tampón M9.

Luego repita el lavado dos veces más para eliminar la mayoría de las bacterias adheridas. A continuación, utilizando una punta de micropipeta de 200 microlitros con un orificio ancho, transfiera los gusanos en 100 microlitros de tampón M9 a una placa de reloj de vidrio de fondo plano. Luego, agregue de uno a tres microlitros de Levamisol 0.1 molar al plato y gírelo suavemente.

Ahora, coloque dos agujas de calibre 25 en dos jeringas para hacer una herramienta de disección para cada mano. Bajo un microscopio de disección, coloque cada aguja debajo y sobre cada gusano y haga un corte fino en cada gusano cerca del segundo bulbo faríngeo, con un movimiento similar al de una tijera. Corte todos los animales al menos una vez, todo dentro de los cinco minutos, para que el Levamisole se mantenga efectivo.

Es muy importante que la disección de los animales en el plato se complete en menos de cinco minutos. En caso de que una gónada extruida no sea visible, simplemente salte sobre ese animal. Aquí se ven gónadas extruidas adecuadas.

Una vez completada la disección, debajo de una campana extractora, agregue dos mililitros de paraformaldehído al 3% directamente a la placa de vidrio del reloj y cúbrala con Parafilm. Luego, espere diez minutos. A continuación, con una pipeta Pasteur de cristal de nueve pulgadas, añada tres mililitros de PBS-T al cristal del reloj y mezcle la solución con la pipeta.

Luego, con una pipeta de vidrio nueva, extraiga los cinco mililitros de líquido que contienen los gusanos y transfiéralos a un tubo cónico de vidrio fresco de cinco mililitros. A continuación, centrifugar el tubo durante 30 segundos en una centrífuga clínica a 1000 g. Ahora, bajo un microscopio de disección, retire y deseche el sobrenadante sin alterar los tejidos disecados.

Luego, usando cinco mililitros de alícuotas de PBS-T, repita el paso de lavado dos veces más y termine con los gusanos en un pequeño volumen de solución. A continuación, con una pipeta de vidrio, añada dos mililitros de metanol 100% y mezcle suavemente los pañuelos tirando de arriba hacia abajo con una pipeta Pasteur nueva. Ahora, incuba el tubo a menos 20 grados centígrados durante al menos una hora.

Después del tratamiento con metanol, realice tres lavados con PBS-T y termine con unos 500 microlitros de PBS-T. Ahora, con una pipeta Pasteur nueva, transfiera los tejidos a un nuevo tubo de vidrio de un mililitro y deje que se asienten por gravedad. Después de cinco a 10 minutos, use una pipeta nueva y la ayuda de un microscopio para eliminar la mayor cantidad posible de lavado del tubo sin alterar los tejidos.

Para iniciar el bloqueo, agregue 100 microlitros de suero de cabra normal al 30%, que es el tampón bloqueante. Luego, cubra el tubo con Parafilm y déjelo reposar a temperatura ambiente durante una hora. Después de una hora, con un microscopio, extraiga la mayor cantidad de líquido posible con una pipeta nueva.

A continuación, haga 100 microlitros de anticuerpo MAPKYT diluidos a uno en 400 en 30% de NGS y agréguelo a los tejidos. A continuación, selle el tubo con Parafilm e incube durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, caliente los tubos a temperatura ambiente y agregue 800 microlitros de PBS-T.

A continuación, extraiga la muestra en una pipeta de vidrio nueva y suéltela suavemente para formar una suspensión uniforme. Una vez que los tejidos se hayan asentado en el fondo, retire con cuidado el sobrenadante y repita el lavado un total de tres veces, siempre utilizando una pipeta nueva y nunca utilizando un vórtice. El anticuerpo secundario se aplica igual que el primario, solo que se tiene en cuenta la posibilidad de mantener los tejidos en la oscuridad a partir de ahora hasta que se puedan obtener imágenes.

Después de la incubación con el anticuerpo secundario, agregue 800 microlitros de la solución diluida de DAPI a los tejidos una vez que se haya eliminado el último lavado. Cubra la boca del tubo con Parafilm e incube a temperatura ambiente durante 20 minutos. Posteriormente, bajo un microscopio de disección, extraiga la mayor cantidad posible de la solución DAPI con una pipeta nueva.

Después de eliminar la última mancha o lavado, agregue una gota de solución de montaje a los tubos. Ahora, prepare una corredera de montaje con una almohadilla de agarosa. Agregue una gota de agarosa derretida al 2% a un portaobjetos de vidrio limpio y coloque rápidamente un segundo portaobjetos limpio perpendicular a la agarosa y encima de ella.

Por último, retire muy suavemente el portaobjetos superior del microscopio. Ahora, transfiera los animales diseccionados a la almohadilla y elimine todo el exceso de líquido de la almohadilla con la ayuda de un microscopio. Por último, aplique un cubreobjetos de 24 por 50 milímetros sin formar burbujas de aire.

Una vez que se haya aplicado el cubreobjetos, no aplique ninguna presión adicional. Esto a menudo resulta en la pérdida de señal. Las imágenes representativas de animales hermafroditas adultos de tipo salvaje revelaron que la forma activa difosforilada de ERK se visualiza típicamente en la región media de Paquiteno, Zona 1, y en los ovocitos más maduros en la Zona 2.

Las perturbaciones en este patrón de activación reflejan cambios en la vía de señalización. Las líneas germinales femeninas no especifican los espermatozoides y, por lo tanto, no muestran activación de ERK en la Zona 2, con solo una activación débil en la Zona 1. Una vez dominada, esta técnica puede llevar, como máximo, dos días, y el primer día es el que más tiempo lleva, con una hora, si se realiza correctamente.

Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos como los peces de ARN para cuantificar cosas, como el nivel de transcripción del ARN, además de la información sobre la abundancia de proteínas. Después de su desarrollo en 1995, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del desarrollo de células germinales analizaran los niveles de abundancia de proteínas in vivo y siguieran la morfología de los cromosomas en C. elegans.