Caracterización antimicrobiana de materiales avanzados para aplicaciones de bioingeniería

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la ingeniería de materiales, como las propiedades antimicrobianas, que son muy deseables para muchas aplicaciones de bioingeniería. Esta técnica se puede utilizar como un protocolo coherente en todos los laboratorios para ayudar a los investigadores menos experimentados que requieren procedimientos detallados paso a paso para obtener resultados precisos. Tuvimos la idea de este método cuando empezamos a buscar protocolos antimicrobianos, y nos dimos cuenta de que no había protocolos detallados sobre este en la literatura.

En este estudio, se probará la actividad antimicrobiana de cuatro materiales avanzados con diferentes naturalezas químicas y un material de control. Prepare cada material cortándolo en discos de 10 mm de diámetro. A continuación, esterilice cada muestra por inmersión en etanol al 70% durante 10 minutos, seguido de radiación ultravioleta durante una hora por lado.

Se utilizarán tres microorganismos diferentes para probar la actividad antimicrobiana de los materiales avanzados. La bacteria grampositiva, Staphylococcus aureus, la bacteria gramnegativa, Escherichia coli, y la levadura, Candida albicans. Con un hisopo de algodón estéril, vuelva a suspender algunas colonias de cada microorganismo en 25 ml de caldo de soja tríptico, o TSB, contenido en un tubo de centrífuga estéril.

Vórtice durante un minuto para lograr una mezcla uniforme. Mida la absorbencia a 540 nm para cada cultivo de microorganismos con un espectrofotómetro. Ajuste la concentración de cada microorganismo a un número adecuado de unidades formadoras de colonias, o UFC por mililitro.

Agite la suspensión microbiana durante cinco segundos para mejorar la dispersión de microorganismos y sumerja brevemente un hisopo de algodón estéril en esta suspensión microbiana. Retire el exceso de líquido del hisopo presionando el hisopo contra la pared del tubo que contiene el cultivo. Raye uniformemente cada suspensión de caldo microbiano con el hisopo de algodón estéril sobre la superficie de un agar de soja tríptico, o placa TSA, en tres planos para cubrir toda la superficie con el microorganismo.

Deje que las placas se sequen durante cinco minutos después de la inoculación. Deje las suspensiones de caldo microbiano en la mesa de trabajo para usarlas más tarde para verificar la concentración y pureza de la suspensión microbiana. Esterilice un par de pinzas sumergiéndolas en un vaso de precipitados con etanol al 96% y luego flameándolas con un quemador de alcohol.

Utilice las pinzas estériles para colocar los discos de muestra que se van a analizar en el centro de las placas TSA. Incubar las placas TSA en posición invertida a 37 grados centígrados durante 24 horas. Para analizar los resultados de la prueba de difusión, mida el diámetro de la zona de inhibición y el diámetro del disco de muestra con un calibrador digital, o tomando una fotografía y utilizando un software de procesamiento de imágenes adecuado.

Este procedimiento es necesario para verificar que las concentraciones microbianas determinadas anteriormente son correctas y garantizar la ausencia de contaminación ambiental microbiana. Utilizando una micropipeta con puntas de autoclave adecuadas y condiciones asépticas, dispense TSB estéril en tubos de microcentrífuga estériles. Incluya una muestra que se utilizará como control negativo.

Realice diluciones en serie de seis decimales con las suspensiones de caldo microbiano utilizadas anteriormente para rayar las placas TSA. Con una espátula Drigalski preesterilizada, extienda 100 l de cada dilución seleccionada en una placa TSA. Extienda 100 l de medio TSB sin microorganismos en una placa TSA como control negativo.

Incubar las placas TSA a 37 grados centígrados durante 24 horas. Al día siguiente, contar el número de colonias para comprobar que la UFC por mililitro es similar a la determinada anteriormente. Revise la placa de control negativo para confirmar que no haya contaminación ambiental microbiana.

Comience este procedimiento cultivando los diferentes microorganismos que se van a analizar en TSB, en un agitador orbital a 37 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, mida la OD540 de cada cultivo durante la noche y luego diluya cada cultivo en 20 mL de TSB en un tubo de centrífuga preesterilizado de 50 mL a una concentración de aproximadamente diez a la sexta UFC por mililitro. Coloque cuatro discos de cada tipo de material y cuatro discos de control en pocillos separados de una placa estéril de 48 pocillos.

Pipetear 150 l de la suspensión microbiana en cada superficie del disco. Incube la placa en la incubadora a 37 grados centígrados durante 24 horas. Después de que la placa de 48 pocillos se haya incubado durante 24 horas, pipetee 850 l de PBS estéril en la superficie de cada uno de los cuatro discos de muestra y cuatro discos de control, y mézclelo con la suspensión microbiana.

Recoja cada mezcla de suspensión microbiana de PBS y cada disco de la placa de 48 pocillos, y transfiéralo a un tubo preesterilizado de 15 mL. Agite las mezclas y discos de suspensión microbiana de PBS durante un minuto. Sonicar a 50 Hz durante cinco minutos, y vórtice de nuevo durante un minuto para asegurarse de que no queden microorganismos viables adheridos a la superficie del material.

Realizar diluciones decimales en serie de los cultivos sonicados y de los tubos de microcentrífuga estériles que contienen TSB. Extienda 100 l de cada dilución en una placa TSA e incube las placas aeróbicamente a 37 grados centígrados durante 24 horas. Después de 24 horas, cuente el número de colonias y exprese este número en UFC por mililitro.

A continuación, se analizan los resultados del método de contacto tal y como se describe en el protocolo de texto. Los resultados de las pruebas de difusión en disco de agar muestran una actividad no antimicrobiana para el primer material, y un aumento de la actividad antibacteriana contra S. aureus y E. coli para los otros tres materiales. Este gráfico muestra el halo normalizado para cada disco de material contra S. aureus y E. coli después de 24 horas de incubación.

Los resultados del método de contacto también indican una actividad no antimicrobiana para el primer material, y un aumento de la actividad antibacteriana contra bacterias gram positivas y gram negativas para los otros tres materiales. C son las bacterias viables recuperadas del disco de control después de 24 horas de incubación. Este gráfico muestra el porcentaje de pérdida de viabilidad de los cuatro materiales frente a S. aureus y E. coli en las superficies de los materiales.

La muestra M1 no mostró actividad antimicrobiana. Aunque no se muestra aquí, ninguno de los cuatro materiales es capaz de inhibir el crecimiento de la levadura, Candida albicans, por otro método. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo determinar la actividad antimicrobiana mediante estos dos métodos complementarios.