Name: Caracterización antimicrobiana de materiales avanzados para aplicaciones de bioingeniería (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Aprende a caracterizar la actividad antimicrobiana de materiales avanzados mediante difusión en agar y el método de contacto ISO 22196. Este protocolo sistemático permite evaluar propiedades contra Staphylococcus aureus y Escherichia coli.

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Los autores desean reconocer la Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir para la ayuda financiera para este trabajo a través de la 001UCV-231-2017 y 2018-231-001UCV becas.

1. preparación de la muestra
<ol><li>Cortar las muestras de material en discos de diámetro de 10 mm con un diámetro de 10 mm perforación cilíndrica. Nota: Materiales frágiles pueden ser ablandados en solventes adecuados estériles durante 1 hora y luego cortar en discos. Por ejemplo, materiales hidrofílicos como alginato de zinc fueron probados siguiendo este protocolo y fueron humedecidos en agua esterilizada antes de cortar para evitar la rotura de la muestra. Sin embargo, otros materiales hidrófobos, como poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) no es necesario ningún tipo de hinchazón anterior para cortar correctamente.</li>
	<li>Los discos de material muestra a 60 ° C en una estufa de vacío en seco (&lt; 10-2 Torr) durante 24 h. Nota: Algunos materiales pueden necesitar una temperatura alta de secado. Sin embargo, es importante no llegar a una temperatura que podría degradar térmicamente el material.</li>
	<li>Medir los espesores de película de material con un calibrador digital. Nota: Este protocolo recomienda la utilización de películas materiales con espesores constantes y similares cuando se comparó la actividad antimicrobiana de diferentes materiales.</li>
	<li>Esterilizar a cada muestra por inmersión en etanol 70% durante 10 minutos y posterior radiación ultravioleta (UV) durante 1 hora por cada lado. Nota: La radiación UV puede realizarse colocando a cada muestra en una placa Petri estéril dentro de una campana de flujo laminar con una lámpara W 12.0 de radiación UV-C. PRECAUCIÓN: Los investigadores deben no exponerse a la radiación UV, porque es mutagénico.</li>
	<li>Realice los pasos 1.1, 1.2, 1.3 y 1.4. con los discos de material de control. Nota: Polietileno tereftalato (PET) o materiales alternativos no antimicrobiano podrían utilizarse como discos de control en el método de difusión y contacto. Además, al caracterizar nanocompuestos o materiales tratados, el material base puede usarse como material de control.</li>
</ol>2. recomendadas microorganismos
Nota: Se recomienda el uso de 3 diferentes microorganismos para estudiar la capacidad antimicrobiana del material probado contra una amplia gama de microorganismos.
<ol><li>Uso de cultivos puros de 3 microorganismos: las bacterias Gram-positivas Staphylococcus aureus, bacteria gram negativa Escherichia coliy la levadura Candida albicans. Nota: Otras especies de microorganismos se pueden también probar con este protocolo mediante la modificación de las condiciones de incubación, si es necesario. PRECAUCIÓN: Deben seguirse las medidas de bioseguridad necesarias según el tipo de microorganismos empleados en el presente Protocolo.</li>
	<li>Trabajar con el material previamente estéril o en autoclave y use un mechero de Bunsen durante todo el proceso de la manipulación microbiana o un gabinete de seguridad biológica (si es necesario) para asegurar condiciones de asepsia. Nota: Condiciones de autoclave recomendado son 121 ° C durante 15 minutos para medios de cultivo y 121 ° C durante 20 min para el material de trabajo y residuos biológicos.</li>
</ol>3. agar prueba de difusión de disco (método de difusión)
Nota: Cuando una líquido difusión de compuestos antimicrobianos podría ser el principal mecanismo antimicrobiano de los materiales avanzados, el método de difusión puede proporcionar información muy útil sobre la capacidad antimicrobiana de estos materiales. El disco de material ubicado en el centro de la placa de agar puede formar una zona transparente anillo (halo) donde se produce una inhibición del crecimiento de los microorganismos después de 24 h de cultivo (ver figura 1).
<ol><li>
Procedimiento de la prueba de difusión
	<ol>
<li>Preparar y autoclave peptona soya agar (TSA) siguiendo las instrucciones del fabricante.</li>
		<li>Vierta la TSA en placas de Petri estériles en condiciones asépticas utilizando un mechero Bunsen o una campana de flujo laminar. Nota: Las placas TSA deben ser 4 – 6 mm de espesor.</li>
		<li>Cultura de los diferentes microorganismos prueba aeróbica de 18 – 24 h en las cajas Petri con TSA en una incubadora a 37 ° C.</li>
		<li>Preparar y caldo de soja tríptica de autoclave (TSB) siguiendo las instrucciones del fabricante.</li>
		<li>Vierta el TSB en un tubo de centrífuga previamente esterilizadas de 50 mL con una pipeta serológica previamente esterilizada bajo condiciones asépticas utilizando un mechero Bunsen o una campana de flujo laminar.</li>
		<li>Vuelva a suspender unas cuantas colonias de paso 3.1.3 en 25 mL de TSB contenida en un tubo de centrífuga estéril utilizando un hisopo de algodón estéril y agitar por 1 minuto lograr una mezcla uniforme.</li>
		<li>Ajustar la absorbancia (a 540 nm) de la cultura con un espectrofotómetro para el número adecuado de colonias formando unidades (UFC) por mL: aproximadamente 1.5 x 108 UFC/mL para las bacterias y de 1 x 106 a 5 x 106 UFC/mL de levaduras. Nota: Los volúmenes cultura y cubeta para medir la absorbancia deben seleccionarse según el tipo de espectrofotómetro utilizado.</li>
		<li>Vórtice el caldo microbiano durante 5 segundos para mejorar la dispersión del microorganismo y brevemente sumerja un hisopo de algodón estéril en la suspensión microbiana. Retirar el exceso de líquido de la torunda presionando contra la pared del tubo que contiene la cultura.</li>
		<li>Uniformemente la raya la suspensión de caldo microbiano con la torunda de algodón estéril sobre la superficie de las placas TSA en 3 planos para cubrir su superficie con el microorganismo y déjelo secar durante 5 minutos después de la inoculación. Nota: Para quitar cualquier humedad, las placas TSA deben colocarse abiertas en una posición invertida a 37 ° C durante 10-15 min antes de la inoculación.</li>
		<li>Esterilizar un par de pinzas por la inmersión de ellos en un vaso de precipitado con etanol 96% y luego les llamas con un quemador de alcohol o mechero Bunsen.</li>
		<li>Coloque los discos de muestra para prueba y control de disco en el centro de las placas TSA con el par de pinzas estériles.</li>
		<li>Incubar aeróbicamente las placas TSA en una posición invertida a 37 ° C durante 24 h. Nota: Para evitar cualquier riesgo de contaminación, se recomienda incubar las placas TSA en una posición invertida. Sin embargo, si el disco de la muestra se desprende de las placas TSA, no realice este paso en una posición invertida. En este caso, se recomienda secar las placas en la campana de flujo laminar. Este ensayo antimicrobiano debe realizarse por lo menos en quadriplicate en días diferentes para asegurar la reproducibilidad.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Comprobación de la pureza y concentración de la suspensión microbiana Nota: Los siguientes pasos son necesarios para comprobar que la concentración microbiana determinada con el espectrofotómetro en paso 3.1.7 es correcto y asegurarse de que no había ninguna contaminación microbiana ambiental. Una contaminación ambiental microbiana puede ser fácilmente detectada por la aparición de varios tipos de colonias microbianas después de 24 h de cultivo. Además, no hay contaminación microbiana del medio TSB durante su manipulación en las diluciones seriadas decimales debe garantizarse con una placa de control TSB negativa.<ol>
<li>Dispensar el TSB estéril (preparado en el paso 3.1.4) en tubos de microcentrífuga estéril utilizando una micropipeta con puntas esterilizadas adecuados en condiciones asépticas. Uno de ellos será utilizado como un control negativo de la TSB.</li>
		<li>Realizar diluciones seriadas decimales con la suspensión del caldo microbiano utilizada en paso 3.1.9 en los tubos de microcentrífuga estéril con TSB.</li>
		<li>Extensión 100 μl de cada dilución en placas de TSA con una espátula de Drigalski preesterilizada o un instrumento alternativo. Extensión también 100 μL de medio TSB sin microorganismo (preparado en el paso 3.2.1) sobre una placa TSA como una placa de control TSB negativa.</li>
		<li>Incubar aeróbicamente las placas TSA aeróbicamente a 37 º C durante 24 h.</li>
		<li>Contar el número de colonias para verificar que las UFC/mL son similares a los que se determinó en el paso 3.1.7.</li>
		<li>Compruebe que no hay contaminación ambiental microbiana en las placas TSA con un único tipo de colonias.</li>
		<li>Compruebe que no hay ninguna contaminación microbiana de la placa de control negativo de TSB no mostrando colonias</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. medición de la actividad antimicrobiana de superficies (método de contacto)
 Nota: Cuando la superficie de contacto puede ser el principal mecanismo antimicrobiano de algunos materiales avanzados, el método de contacto puede proporcionar información muy útil sobre la capacidad antimicrobiana de estos materiales. En este método, los microorganismos se colocan directamente sobre la superficie del material y su inhibición de crecimiento puede ser determinada después de una cierta cantidad de tiempo.
<ol><li>
Procedimiento inicial
	<ol>
<li>Preparar y autoclave TSB siguiendo las instrucciones del fabricante.</li>
		<li>Vierta el TSB en un tubo de centrífuga previamente esterilizadas de 50 mL con una pipeta serológica previamente esterilizada bajo condiciones asépticas utilizando un mechero Bunsen o una campana de flujo laminar.</li>
		<li>Cultura los microorganismos diferentes a probarse aeróbicamente durante la noche en el tubo con TSB en un agitador orbital (140 rpm) a 37 ° C.</li>
		<li>Diluir la cultura durante la noche en 20 mL de TSB en un tubo de centrífuga previamente esterilizadas de 50 mL a una concentración de aproximadamente 106 UFC/mL (determinado con un espectrofotómetro a 540 nm). Nota: Los volúmenes cultura y cubeta para medir la absorbancia deben seleccionarse según el tipo de espectrofotómetro utilizado.</li>
		<li>Realizar diluciones decimales seriadas de esta cultura en tubos estériles de microcentrífuga con TSB. Extensión 100 μl del cultivo en placas de TSA e incubar aeróbicamente a 37 º C durante 24 h.</li>
		<li>Contar el número de colonias para asegurar una concentración celular inicial de aproximadamente 1 x 106 UFC/mL</li>
		<li>Colocar 4 discos de control para el recuento microbiano después de 24 h y 4 discos de muestra de cada tipo de los materiales probados para el recuento microbiano después de 24 h en separa pocillos de una placa de 48 pozos estéril.</li>
		<li>Pipetear 150 μL de la suspensión microbiana en cada superficie de disco.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Microbiana con el control y prueba de materiales (después de 24 h)
	<ol>
<li>Después de paso 4.1.6, incubar aeróbicamente los 4 discos de muestra en la placa de la pozo 48 a 37 ° C durante 24 h. Nota: Este tiempo de incubación de 24 h puede ser modificado para estudiar la inhibición del crecimiento en épocas de mayor o menos.</li>
		<li>Después de 24 h de incubación, pipetear 850 μl de PBS estéril sobre la superficie de los 4 discos de muestra y se mezcla con 150 μL de la suspensión microbiana.</li>
		<li>Para obtener la mezcla de suspensión microbiana/PBS y cada disco de la placa de 48 pozos y transferirlos a un tubo de 10 mL previamente esterilizados.</li>
		<li>Vórtice la mezcla de suspensión microbiana/PBS y cada disco por 1 min, someter a ultrasonidos lo a 50 Hz por 5 min y agitar nuevamente durante 1 minuto asegurar que no hay microorganismos viables adherido a la superficie del material.</li>
		<li>Realizar diluciones seriadas decimales de cada cultura sonicación en tubos de microcentrífuga estéril conteniendo TSB y difundir 100 μl del cultivo en placas de TSA e incubar aeróbicamente a 37 º C durante 24 h.</li>
		<li>Contar el número de colonias, que son el número de microorganismos viables en cada superficie de disco de muestra y control. Expresar este número de células viables (UFC/ml).</li>
		<li>Tomar una fotografía de la cultura microbiana final para la muestra y control.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Análisis de resultados antimicrobianos
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57710/57710fig1.jpg"> Figura 1: medidas para el ancho normalizado de los antimicrobianos "halo". Este panel muestra el diámetro de la zona de inhibición (diz) y el diámetro del disco (d). <a href="/files/ftp_upload/57710/57710fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<ol><li>
Análisis de resultados método de difusión
	<ol>
<li>Medir el diámetro de la zona de inhibición (diz) y el diámetro del disco (d) (ver figura 1) con un calibrador digital. Nota: La inhibición de la zona o antimicrobiano "halo" se forma como consecuencia de la inhibición de crecimiento microbiano producida por el disco material antimicrobiano (ver figura 1). Es posible observar que existe una zona transparente anillo cerca de la muestra en comparación con el resto de la placa donde los microorganismos han crecido adecuadamente (zona opaca).</li>
		<li>Determinar el ancho normalizado de los antimicrobianos "halo" (nwhalo) de cada disco, aplicando la ecuación (1). (1)<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57710/57710eq1.jpg">
</li>
		<li>Determinar la media y desviación estándar del ancho normalizado de los valores de nwhalo antimicrobiana "halo" con el 4 determinado de cada muestra.</li>
		<li>Tomar una fotografía de la cultura microbiana final con el disco de material. Nota: El diámetro de la zona de inhibición (diz) y el diámetro del disco (d) se pueden también medir de la fotografía tomada en el paso 5.1.4 mediante el uso de un software de procesamiento de imágenes adecuado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Análisis de resultados del método de contacto
	<ol>
<li>Determinar el número de microorganismos viables recuperadas según la ecuación (2). (2)<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57710/57710eq2.jpg"> Nota: Aquí, N es el número de microorganismos viables recuperadas por cm2 por probeta; C es el número de placa; D es el factor de dilución; A es la superficie de la probeta en cm2 con el diámetro del disco de muestra.</li>
		<li>Determinar la pérdida de viabilidad (LV) para reflejar la inhibición del crecimiento celular mediante la aplicación de la ecuación (3). (3)<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57710/57710eq3v3.jpg"> Nota: Aquí, C es el número de microorganismos viables (N) promedio de UFC/mL•cm2, recuperado de los ejemplares de control después de 24 h; S es el número de microorganismos viables (N) en UFC/mL•cm2, recuperado de las probetas después de 24 h.</li>
		<li>Determinar la media y desviación estándar de la pérdida de viabilidad con los 4 valores LV(%) determinados de cada muestra.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La actividad antimicrobiana de los nuevos materiales avanzados puede ser analizada por este protocolo de fácil-a-sigue consistiendo en 2 procedimientos complementarios basados en los métodos existentes 2: la difusión de discos de agar prueba38 y la actividad antimicrobiana se mide en superficies según la ISO 22196:2007 norma39.
En este campo de investigación, muchos de los ensayos antimicrobianos divulgados en la literatura dependen en gran ensayo. Por lo tanto, es muy importante haber detallado y coherente protocolos en lugar a través de laboratorios. Este artículo es un paso en esa dirección. Además, podría ser muy útil para muchos de los investigadores menos experimentados en este campo y requieren procedimientos detallados, paso a paso a seguir para obtener resultados precisos.
Este protocolo puede utilizarse con muchos tipos de materiales recortados en formas de disco de 10 mm de diámetro. Materiales frágiles pueden estar inflamados en un solvente adecuado para 1 h hacer más fácil el proceso de corte. Así, materiales hidrofílicos tales como los alginatos pueden ser hidratados en agua destilada esterilizada. Pueden emplearse otros disolventes como etanol, cetonas, diclorometano, a hincharse materiales hidrofóbicos para 1 h antes de cortarlos. Sin embargo, algunos materiales como el poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) no es necesario estar inflamados y puede cortar directamente. Después de eso, es muy importante secar los discos de material de muestra en un horno de vacío y esterilizar cada muestra con etanol y la radiación UV durante 1 hora para evitar cualquier riesgo de contaminación.
Este protocolo recomienda TSA y TSB como medios de cultivo y el uso de cultivos puros de 3 microorganismos para llegar a una amplia gama de microorganismos: bacterias Gram positivas Staphylococcus aureus, bacteria gram negativa Escherichia coli, y la levadura Candida albicans. Sin embargo, medios de cultivo alternativos y otros microorganismos necesitan condiciones de incubación diferentes podrían usarse con este protocolo. A veces, solamente 1 microorganismo es probado para tener una idea inicial de la actividad antimicrobiana de un nuevo material.
Los materiales que muestra fuerte actividad antimicrobiana contra los 3 recomendados diferentes tipos de microorganismos también deben ser evaluados contra patógenos resistentes a los antibióticos como la meticilina-resistente Staphylococcus epidermidis (MRSE), que se han utilizado con éxito con este protocolo. Otros importantes microorganismos resistentes a los medicamentos que están causando mucha preocupación están el gram-positivas resistentes a la meticilina Staphylococcus aureus (MRSA) y vancomicina-resistente Enterococci (VRE) y las Gram-negativas Pseudomonas aeruginosa40,41.
Inhibición de la biopelícula y la actividad antimicrobiana de materiales frente a otros tipos de microorganismos tales como virus y parásitos no pueden analizarse con este protocolo. Sin embargo, este protocolo proporciona un punto de partida muy útil para un estudio de antimicrobiano de un nuevo material avanzado.
En la prueba de difusión de discos de agar antimicrobianos, un paso crucial se produce cuando el disco de muestra debe colocarse en el centro de la placa porque algunos materiales doblan tan pronto como consiguen en contacto con los medios de agar. En este caso, se recomienda utilizar un par estéril de pinzas para desplegar cuidadosamente la muestra. Por otra parte, en el método de contacto, es fundamental para el control de lavado y discos de muestra muy bien con PBS mediante pipeteo les cuatro veces seguida por una vigorosa Vortex y sonicación para asegurarse de que no hay microorganismos viables permanecen adheridos al material superficie.
Este protocolo de video puede ser utilizado en muchas aplicaciones de bioingeniería, tales como ingeniería de bioprocesos, ingeniería de tejidos, el suministro de medicamentos controlados, materiales de empaque, tratamiento de aguas residuales y agricultura, que uso en biomateriales con un muy capacidad antimicrobiana deseable.
Los resultados obtenidos con este protocolo son cualitativos (las imágenes) y cuantitativo (el ancho normalizado de lo antibacteriano "halo" y la pérdida de viabilidad) con un buen análisis de la reproducibilidad (media ± desviación estándar). Al comparar diferentes materiales, estos valores medios obtenidos con el análisis de resultados método de difusión y contacto deben ser analizados por ANOVA unidireccional, seguido por el análisis post hoc de la de Turquía, para estudiar si son, estadísticamente, significativamente diferentes (p < 0.01).

Fracaso del implante es a menudo una consecuencia de las infecciones microbianas que se producen a pesar de la profilaxis antimicrobiana y las condiciones de trabajo aséptico. Este problema está causando costos médicos muy altos y es penoso entre pacientes1. Importante de bacterias como Staphylococcus aureus , actualmente se consideran muy peligrosos patógenos en infecciones nosocomiales asociadas a catéteres y otros implantes médicos y son los principales contaminantes de instrumentos médicos2. Por lo tanto, el desarrollo de nuevas estrategias antimicrobianas es urgente para uso cotidiano y médico.
Agentes antimicrobianos incluyen antibióticos3, compuestos de amonio cuaternario4, óxidos de iones metal5y péptidos antimicrobianos (AMPs)6. Antibióticos poco a poco son cada vez menos eficientes debido a la resistencia bacteriana7, que va en aumento debido al uso excesivo de antibióticos8. Compuestos de amonio cuaternario sólo son muy eficientes para un uso a corto plazo debido a la resistencia microbiana9. Óxidos de iones metal durante mucho tiempo se han utilizado como agentes antimicrobianos muy eficaces y se utilizan en muchos productos comerciales comunes, incluyendo vendas, filtros de agua, pinturas, etc.10,11,12. Sin embargo, se ha demostrado que estos tipos de compuestos pueden ser tóxicos para algunos tipos de células de mamíferos13.
Amperios muestran excelente antimicrobiano e inmunomoduladores propiedades14,15, y las bacterias parecen que resulta muy difícil desarrollar una resistencia contra ellos16. Sin embargo, el proceso para producir puros amperios es caro; por lo tanto, una producción a gran escala no es viable. Por lo tanto, estrategias para contrarrestar los problemas en la producción de amplificadores han sido desarrollan (por ejemplo, peptoid antibacteriano molecular pequeño imita17, peptoides18, péptidos α19 y péptidos β20). Polypeptoids y metacrilato de-terminado de polipéptidos han sido sintetizados para antimicrobianos y antifouling recubrimientos21.
El desarrollo de nuevos antimicrobianos como materiales avanzados en puro o forma híbrida, capaz de prevenir y tratar las infecciones multirresistentes, es cada vez más necesario. Una amplia gama de nuevos materiales avanzados para muchos campos de la bioingeniería como ingeniería de bioprocesos y tejidos se han desarrollado con propiedades químicas y físicas mejoradas en las últimas décadas a través de varios métodos: polimerización plasma injerto en un sustrato hidrofóbico22,23,24, sastrería de reticulación densidad25,26, polimerización en solución27,28,29 , 30, porogen disolución31,32y la incorporación de nanomateriales como grafeno óxido (ir)33,34,35,36 y carbono de nanofibras (CNFs)37.
El estudio de la capacidad antimicrobiana de estos nuevos materiales podría aumentar exponencialmente su potencial aplicabilidad de bioingeniería y, por lo tanto, es esencial. Presentamos un protocolo fácil de seguir para cuantificar la actividad antimicrobiana de estos nuevos materiales avanzados. Aquí, después de la preparación de la muestra, se siguen dos métodos complementarios: el primero se basa en el agar disco difusión prueba38 (método de difusión) y la segunda se basa en la ISO 22196:2007 norma39 para medir la actividad antimicrobiana en superficies (método de contacto).

<table><tbody><tr><td>Punzón cilíndrico&nbsp;</td><td></td><td></td> Placas de Petri de <td>10 mm de diámetro</td></tr><tr><td></td><td>soria genlab</td><td>P101</td> de <td>90 mm de diámetro, estéril</td></tr><tr><td>Agar de soja tríptico (TSA)</td><td>Liofilchem</td><td>610052</td><td>Medio deshidratado 500 g (polvo)</td></tr><tr><td>Caldo de soja tríptico (TSB)</td><td>Liofilchem</td><td>610053</td><td>Medio deshidratado 500 g (polvo)</td></tr><tr><td>Hisopo de algodón estéril</td><td>EUTOTUBO</td><td>300200</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga tubos</td><td>VIDRA FOC, SA</td><td>429900</td><td>50 mL, estéril</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>83813360</td><td>Etanol absoluto</td></tr><tr><td>Placa estéril de 48 pocillos</td><td>COSTAR</td><td>3548</td><td>Fondo plano con tapa, tratado con cultivo de tejidos, no pirogénico, poliestireno</td></tr><tr><td>Un par de pinzas</td><td>BRAUN</td><td>24612036</td><td>Toothless</td></tr><tr><td>Solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS).</td><td>VWR</td><td>E404-100TAPBS</td><td></td></tr><tr><td>Horno de vacío con bomba de vacío conectada</td><td>JP Selecta, SA</td><td>5900620</td><td></td></tr><tr><td>Campana de flujo laminar</td><td>TELSTAR Technologies, SL</td><td>TELSTAR AH-100</td><td>Lámpara de 12,0 W de radiación UV-C</td></tr><tr><td>Clase II Cabina de seguridad biológica</td><td>LABOGENE</td><td>MARS 1200</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>ASTEC CO, LTD</td><td>SCA-165DR</td><td></td></tr><tr><td>Mezclador de vórtice</td><td>Espectrofotómetro Biosan</td><td>V-1 Plus</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Macherey-Nagel, Alemania</td><td>Nanocolor UV/VIS II</td><td></td></tr><tr><td>Quemador Bunsen</td><td>JP Selecta, SA</td><td>7001539</td><td></td></tr><tr><td>Quemador de alcohol</td><td>VIDRA FOC, SA</td><td>1658/20</td><td>En caso de que sea necesario realizar la esterilización dentro de la cabina de seguridad biológica de clase II</td></tr><tr><td>Agitador orbital</td><td>Sartorius Stedim</td><td>8864845</td><td></td></tr><tr><td>Sonicador</td><td>SELECTA</td><td>3000617</td><td>50/60 Hz</td></tr><tr><td>Pinza digital</td><td>ACHA</td><td>17-260</td><td>0-150 mm</td></tr><tr><td>Pipeta serológica</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11</td><td>25 mL, estéril</td></tr><tr><td>Pipeta serológica</td><td>VWR</td><td>612-4950</td><td>5 mL, estéril</td></tr><tr><td>Pipeta serológica</td><td>VWR</td><td>612-5541</td><td>10 mL, estéril</td></tr><tr><td>Micropipeta</td><td>GILSON FA10005P</td><td></td><td>Pipetman L P200L, plástico 20-200 &micro; </td></tr><tr><td>L Micropipeta</td><td>GILSON F123602</td><td></td><td>Pipetman P1000, 200-1000 &micro; </td></tr><tr><td>L Micropipeta&nbsp;</td><td>GILSON</td><td>FA10016</td><td>Pipetman L P12X300L, 20-300 &micro; L Puntas</td></tr> de <tr><td>micropipeta</td><td>LABBOX</td><td>TIBP-200-960</td><td>2-200 &micro; L Puntas</td></tr><tr>de<td>micropipeta</td><td>LABBOX</td><td>TIBP-1K0-480</td><td>100-1000 &micro; L</td></tr><tr><td>Tubo preesterilizado&nbsp;</td><td>INSULAB</td><td>301402</td><td>10 mL&nbsp;</td></tr><tr><td>Cámara fotográfica</td><td>Canon EOS 5D</td><td></td><td>También se puede utilizar cualquier cámara con alta resolución</td></tr><tr><td>Bacterias grampositivas Staphylococcus aureus</td><td></td><td>&nbsp; cepa V329</td><td>Cucarella et al. J Bacteriol 183 (9),&nbsp; 2888&ndash; 2896 (2001)</td></tr><tr><td>Bacterias gramnegativas Escherichia coli</td><td>Colecci&oacute; n Espa&ntilde; ola de Cultivos Tipo CECT CECT</td><td>101</td><td></td></tr><tr><td>Levadura Candida albicans</td><td>Colecci&oacute; n Espa&ntilde; ola de Cultivos Tipo CECT CECT</td><td>1394</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga&nbsp;</td><td>DASLAB</td><td>175508</td><td>1,5 mL</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>JP Selecta, SA</td><td>4002136</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro-cubetas</td><td>UVAT Bio CB</td><td>F-0902-02</td><td>4,5 mL</td></tr><tr><td>Espátula Drigalski</td><td>LABBOX</td><td>SPRP-L05-1K0</td><td>Estéril, desechable&nbsp;</td></tr><tr><td>bolas de vidrio (2 mm de diámetro)</td><td>Hecht Karl</td><td>1401/2</td><td>Esterilizable en autoclave, dispositivo alternativo a la espátula Drigalski</td></tr><tr><td>Bolsas de autoclave</td><td>DELTALAB</td><td>200318</td><td>Para esterilizar residuos microbiológicos o material contaminado</td></tr><tr><td>Dispositivo electrónico de llenado de pipetas</td><td>JetPip</td><td>JET BIOFIL</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de laboratorio con rosca ISO, graduado, borosilicato 3.3</td><td>LABBOX</td><td>SBG3-100-010</td><td>100 mL, para autoclave de medios</td></tr><tr><td>de cultivo Frasco de laboratorio con rosca ISO, graduado, de borosilicato 3.3</td><td>LABBOX</td><td>SBG3-250-010</td><td>250 mL, para autoclave de medios de cultivo</td></tr><tr><td>Frasco de laboratorio con rosca ISO, graduado, borosilicato 3.3</td><td>LABBOX</td><td>SBG3-500-010</td><td>500 mL, para autoclave de medios</td></tr><tr><td>de cultivo Frasco de laboratorio con rosca ISO, graduado, de borosilicato 3.3</td><td>LABBOX</td><td>SBG3-1K0-010</td><td>1000 mL, para autoclave de medios de cultivo</td></tr><tr><td>Guantes de látex</td><td>DENIA</td><td>2278000000</td><td></td></tr><tr><td>Cinta indicadora para esterilización</td><td>LABBOX</td><td>STAP-A55-001</td><td>Cinta autoadhesiva con papel impregnado que se colorea cuando se expone al proceso de esterilización.</td></tr><tr><td>Gradilla universal para tubos de ensayo</td><td>LABBOX</td><td>MTSP-001-001</td><td>Para sujetar tubos de centrífuga Gradilla</td></tr><tr>para<td>tubos de microcentrífuga</td><td>VWR</td><td>211-0210</td><td>Para sujetar tubos de microcentrífuga</td></tr><tr><td>Asa estéril</td><td>ACEFE S.A.</td><td>100140055</td><td>10 y micro; L de capacidad para cultivo microbiano&nbsp;</td></tr><tr><td>Material M1</td><td>Universidad Cat&oacute; lica de Valencia, San Vicente, M&aacute; rtir (UCV)</td><td></td><td>Tipo de material 1&nbsp;</td></tr><tr><td>Material M2</td><td>Universidad Cat&oacute; lica de Valencia, San Vicente, M&aacute; rtir (UCV)</td><td></td><td>Tipo de material 2&nbsp;</td></tr><tr><td>Material: M3</td><td>Universidad Cat&oacute; lica de Valencia, San Vicente, M&aacute; rtir (UCV)</td><td></td><td>Tipo de material3</td></tr><tr><td>Material M4</td><td>Universidad Cat&oacute; lica de Valencia, San Vicente, M&aacute; rtir (UCV)</td><td></td><td>Tipo de material 4&nbsp;</td></tr><tr><td>Material C</td><td>Universidad Cat&oacute; lica de Valencia, San Vicente, M&aacute; rtir (UCV)</td><td></td><td>Material de control</td></tr></tbody></table>

caracterización antimicrobiana de materiales avanzados para aplicaciones de bioingeniería

Antimicrobial Characterization of Advanced Materials for Bioengineering Applications

El desarrollo de nuevos materiales avanzados con propiedades mejoradas se está convirtiendo en cada vez más importante en una amplia gama de aplicaciones de la bioingeniería. Así, muchos biomateriales novedosos se están diseñando para simular entornos específicos para aplicaciones biomédicas tales como ingeniería de tejidos y el suministro de medicamentos controlados. El desarrollo de materiales con propiedades mejoradas para la inmovilización de células o enzimas también es un tema actual de investigación en ingeniería de bioprocesos. Sin embargo, una de las propiedades más deseables de un material en estas aplicaciones es la capacidad antimicrobiana para evitar cualquier infección indeseables. Para esto, presentamos, fácil de seguir los protocolos para la caracterización antimicrobiana de materiales basados en (i) la prueba de difusión de discos de agar (método de difusión) y (ii) la norma ISO 22196:2007 para medir la actividad antimicrobiana en superficies (contacto método). Este protocolo debe realizarse utilizando bacterias Gram-positivas y gram negativas y levaduras para cubrir una amplia gama de microorganismos. Por ejemplo, 4 materiales con diferentes naturalezas químicas son probados siguiendo este Protocolo contra Staphylococcus aureus, Escherichia coliy Candida albicans. Los resultados de estas pruebas exhiben actividad antimicrobiana no para el primer material y aumentar la actividad antibacteriana contra bacterias Gram positivas y gram-negativas para los otros 3 materiales. Sin embargo, ninguno de los 4 materiales son capaces de inhibir el crecimiento de Candida albicans.

Este protocolo fue empleado, por ejemplo, para probar la capacidad antimicrobiana de 4 materiales con diferentes naturalezas químicas contra los 3 recomienda microorganismos: Staphylococcus aureus, Escherichia coliy Candida albicans . Los resultados de las pruebas de difusión del disco de agar (método de difusión) mostraron actividad antimicrobiana no para el primer material (M1) como ocurrió en el disco de control (C, no se muestra imagen) y el aumento de actividad antibacteriana contra bacterias grampositivas y gramnegativas bacterias de los otros 3 materiales M2, M3 y M4 (ver figura 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57710/57710fig2.jpg"> Figura 2: resultados del método de difusión antimicrobiana. Este panel muestra el método de difusión antimicrobiana para los 4 materiales (M1, M2, M3 y M4) discos (diámetro 10 mm x 1 mm de espesor) contra S. aureus y e. coli después de 24 h de incubación. <a href="/files/ftp_upload/57710/57710fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
La figura 3 muestra los anchos normalizados de los antimicrobianos "halo" (nwhalo) para el ejemplo diferentes materiales M1, M2, M3 y M4 contra bacterias Gram positivas y gram-negativos calculado con la ecuación (1). Sin embargo, ninguno de los 4 materiales fueron capaces de inhibir el crecimiento de la levadura Candida albicans (imágenes que no se muestran).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57710/57710fig3v2.jpg"> Figura 3: resultados de "Halo" de difusión antimicrobiana. Este panel muestra el normalizado "halo" (nwhalo) para cada material (M1, M2, M3 y M4) en disco (diámetro 10 mm x 1 mm de espesor) contra S. aureus y e. coli después de 24 h de incubación. Las diferencias son estadísticamente significativas (p &lt; 0.01). Sin embargo, muestra M1 exhibió ninguna actividad antimicrobiana. <a href="/files/ftp_upload/57710/57710fig3v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Los resultados del método contacto también exhibieron actividad no antimicrobiano para el primer material (M1) como ocurrió en el disco de control (C) y aumento de la actividad antibacteriana contra Grampositive y bacterias Gram-negativas para los otros 3 materiales (véase Figura 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57710/57710fig4v3.jpg"> Figura 4: antimicrobianos resultados método de contacto. Este panel muestra las placas respectivas de 90 mm de 4 materiales (M1, M2, M3 y M4) actividad antimicrobiana superficie ensayo según la ISO 22196:2007 después de 24 h de incubación para S. aureus y e. coli (factor de dilución de 10-4). C es la bacteria viable recuperada desde el disco de control después de 24 h de incubación. <a href="/files/ftp_upload/57710/57710fig4v3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
La pérdida de viabilidad (%) se determinó por la ecuación (2) y (3) como se indica en el presente Protocolo (ver figura 5).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57710/57710fig5v2.jpg"> Figura 5: pérdida de viabilidad por método de contacto. Este panel muestra la pérdida de viabilidad (%) de M1, M2, M3 y M4 frente a S. aureus y e. coli en las superficies materiales. Muestra M1 no exhibió ninguna actividad antimicrobiana. <a href="/files/ftp_upload/57710/57710fig5v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Sin embargo, ninguno de los 4 materiales fueron capaces de inhibir el crecimiento de la levadura Candida albicans por el método de contacto o (imágenes que no se muestra). Por lo tanto, 3 de estos 4 materiales avanzados demostró resultados positivos antimicrobianos contra bacterias Gram positivas y gram-negativas y así podría ser muy útil para muchas aplicaciones de Bioingeniería con requerimientos de alta actividad antibacteriana. Sin embargo, ninguno de los 4 materiales fueron capaces de inhibir el crecimiento de la levadura.

Presentamos un protocolo para la caracterización antimicrobiana de materiales avanzados. Aquí, la actividad antimicrobiana en superficies de material se mide mediante dos métodos que se complementan: uno se basa en la prueba de difusión de discos de agar, y el otro es un procedimiento estándar basado en la norma ISO de 22196:2007.

Caracterización antimicrobiana de materiales avanzados para aplicaciones de bioingeniería

The development of new advanced materials with enhanced properties is becoming more and more important in a wide range of bioengineering applications. ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la ingeniería de materiales, como las propiedades antimicrobianas, que son muy deseables para muchas aplicaciones de bioingeniería. Esta técnica se puede utilizar como un protocolo coherente en todos los laboratorios para ayudar a los investigadores menos experimentados que requieren procedimientos detallados paso a paso para obtener resultados precisos. Tuvimos la idea de este método cuando empezamos a buscar protocolos antimicrobianos, y nos dimos cuenta de que no había protocolos detallados sobre este en la literatura.En este estudio, se probará la actividad antimicrobiana de cuatro materiales avanzados con diferentes naturalezas químicas y un material de control. Prepare cada material cortándolo en discos de 10 mm de diámetro. A continuación, esterilice cada muestra por inmersión en etanol al 70% durante 10 minutos, seguido de radiación ultravioleta durante una hora por lado.Se utilizarán tres microorganismos diferentes para probar la actividad antimicrobiana de los materiales avanzados. La bacteria grampositiva, Staphylococcus aureus, la bacteria gramnegativa, Escherichia coli, y la levadura, Candida albicans. Con un hisopo de algodón estéril, vuelva a suspender algunas colonias de cada microorganismo en 25 ml de caldo de soja tríptico, o TSB, contenido en un tubo de centrífuga estéril.Vórtice durante un minuto para lograr una mezcla uniforme. Mida la absorbencia a 540 nm para cada cultivo de microorganismos con un espectrofotómetro. Ajuste la concentración de cada microorganismo a un número adecuado de unidades formadoras de colonias, o UFC por mililitro.Agite la suspensión microbiana durante cinco segundos para mejorar la dispersión de microorganismos y sumerja brevemente un hisopo de algodón estéril en esta suspensión microbiana. Retire el exceso de líquido del hisopo presionando el hisopo contra la pared del tubo que contiene el cultivo. Raye uniformemente cada suspensión de caldo microbiano con el hisopo de algodón estéril sobre la superficie de un agar de soja tríptico, o placa TSA, en tres planos para cubrir toda la superficie con el microorganismo.Deje que las placas se sequen durante cinco minutos después de la inoculación. Deje las suspensiones de caldo microbiano en la mesa de trabajo para usarlas más tarde para verificar la concentración y pureza de la suspensión microbiana. Esterilice un par de pinzas sumergiéndolas en un vaso de precipitados con etanol al 96% y luego flameándolas con un quemador de alcohol.Utilice las pinzas estériles para colocar los discos de muestra que se van a analizar en el centro de las placas TSA. Incubar las placas TSA en posición invertida a 37 grados centígrados durante 24 horas. Para analizar los resultados de la prueba de difusión, mida el diámetro de la zona de inhibición y el diámetro del disco de muestra con un calibrador digital, o tomando una fotografía y utilizando un software de procesamiento de imágenes adecuado.Este procedimiento es necesario para verificar que las concentraciones microbianas determinadas anteriormente son correctas y garantizar la ausencia de contaminación ambiental microbiana. Utilizando una micropipeta con puntas de autoclave adecuadas y condiciones asépticas, dispense TSB estéril en tubos de microcentrífuga estériles. Incluya una muestra que se utilizará como control negativo.Realice diluciones en serie de seis decimales con las suspensiones de caldo microbiano utilizadas anteriormente para rayar las placas TSA. Con una espátula Drigalski preesterilizada, extienda 100 l de cada dilución seleccionada en una placa TSA. Extienda 100 l de medio TSB sin microorganismos en una placa TSA como control negativo.Incubar las placas TSA a 37 grados centígrados durante 24 horas. Al día siguiente, contar el número de colonias para comprobar que la UFC por mililitro es similar a la determinada anteriormente. Revise la placa de control negativo para confirmar que no haya contaminación ambiental microbiana.Comience este procedimiento cultivando los diferentes microorganismos que se van a analizar en TSB, en un agitador orbital a 37 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, mida la OD540 de cada cultivo durante la noche y luego diluya cada cultivo en 20 mL de TSB en un tubo de centrífuga preesterilizado de 50 mL a una concentración de aproximadamente diez a la sexta UFC por mililitro. Coloque cuatro discos de cada tipo de material y cuatro discos de control en pocillos separados de una placa estéril de 48 pocillos.Pipetear 150 l de la suspensión microbiana en cada superficie del disco. Incube la placa en la incubadora a 37 grados centígrados durante 24 horas. Después de que la placa de 48 pocillos se haya incubado durante 24 horas, pipetee 850 l de PBS estéril en la superficie de cada uno de los cuatro discos de muestra y cuatro discos de control, y mézclelo con la suspensión microbiana.Recoja cada mezcla de suspensión microbiana de PBS y cada disco de la placa de 48 pocillos, y transfiéralo a un tubo preesterilizado de 15 mL. Agite las mezclas y discos de suspensión microbiana de PBS durante un minuto. Sonicar a 50 Hz durante cinco minutos, y vórtice de nuevo durante un minuto para asegurarse de que no queden microorganismos viables adheridos a la superficie del material.Realizar diluciones decimales en serie de los cultivos sonicados y de los tubos de microcentrífuga estériles que contienen TSB. Extienda 100 l de cada dilución en una placa TSA e incube las placas aeróbicamente a 37 grados centígrados durante 24 horas. Después de 24 horas, cuente el número de colonias y exprese este número en UFC por mililitro.A continuación, se analizan los resultados del método de contacto tal y como se describe en el protocolo de texto. Los resultados de las pruebas de difusión en disco de agar muestran una actividad no antimicrobiana para el primer material, y un aumento de la actividad antibacteriana contra S. aureus y E. coli para los otros tres materiales. Este gráfico muestra el halo normalizado para cada disco de material contra S. aureus y E. coli después de 24 horas de incubación.Los resultados del método de contacto también indican una actividad no antimicrobiana para el primer material, y un aumento de la actividad antibacteriana contra bacterias gram positivas y gram negativas para los otros tres materiales. C son las bacterias viables recuperadas del disco de control después de 24 horas de incubación. Este gráfico muestra el porcentaje de pérdida de viabilidad de los cuatro materiales frente a S. aureus y E. coli en las superficies de los materiales.La muestra M1 no mostró actividad antimicrobiana. Aunque no se muestra aquí, ninguno de los cuatro materiales es capaz de inhibir el crecimiento de la levadura, Candida albicans, por otro método. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo determinar la actividad antimicrobiana mediante estos dos métodos complementarios.

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