Vigilancia de todo el genoma de errores de transcripción en organismos eucariotas

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la mutagénesis transcripcional, como qué subunidades de ARN polimerasa o procesos biológicos controlan la fidelidad de la transcripción. La principal ventaja de esta técnica es que permite medir errores de transcripción endógenos en los transcriptomas de organismos eucariotas. Por lo general, las personas nuevas en este protocolo tendrán dificultades debido a la longitud y complejidad del ensayo y a la necesidad de bioinformática avanzada para interpretar los datos.

Para comenzar el protocolo, circularice los fragmentos de ARN mediante desnaturalización por calor de 20 microlitros de la muestra previamente preparada a 65 grados centígrados durante un minuto. Después de un minuto, coloque inmediatamente la muestra en hielo durante dos minutos. A continuación, agregue cuatro microlitros de tampón de ARN ligasa T4 10x, cuatro microlitros de ATP 10 milimolar, un microlitro de inhibidor de RNasa, un microlitro de agua libre de nucleasa y ocho microlitros de 50% de polietilenglicol o PEG.

A continuación, mezcle bien la muestra mediante vórtice. A continuación, añadir dos microlitros de 10 unidades por microlitro de ARN ligasa T4 uno. Mezclar la muestra de nuevo por pipeteo e incubarla a 25 grados centígrados durante dos horas en un termociclador con la temperatura de la tapa ajustada a 30 grados centígrados.

Después de las dos horas de incubación, agregue 10 microlitros de agua libre de nucleasas a la muestra y limpie la muestra con un kit de limpieza y concentración de oligonucleótidos. Eluir la muestra en 20 microlitros de agua libre de nucleasas. Para transcribir inversamente las moléculas circulares de ARN, agregue cuatro microlitros de dNTP de 10 milimolares, cuatro microlitros de 50 nanogramos por hexámeros aleatorios de microlitro y nueve microlitros de agua libre de nucleasa a nueve microlitros de ARN.

Mezclar bien pipeteando y desnaturalizar la muestra a 65 grados centígrados durante un minuto. Después de desnaturalizar la muestra, colóquela en hielo durante dos minutos. Añadir a la muestra ocho microlitros de tampón de síntesis de primera cadena 5x, dos microlitros de DTT de 0,1 miliMolar y cuatro microlitros de 200 unidades por microlitro de transcriptasa inversa y mezclar mediante pipeteo.

Incubar la muestra a 25 grados centígrados durante 10 minutos con la tapa colocada cinco grados centígrados por encima de la temperatura de incubación. A continuación, incubar la muestra durante 20 minutos a 42 grados centígrados con la tapa ajustada a 47 grados centígrados. Eluir la muestra en 42 microlitros de solución de elución después de limpiar con el kit de limpieza y concentrador.

Utilice el kit de síntesis de segunda cadena para generar una biblioteca de ADNc de doble cadena. Coloque las muestras en hielo y agregue 30 microlitros de agua NF a 38 microlitros de su muestra. A continuación, agregue ocho microlitros de tampón de segunda hebra 10x y cuatro microlitros de enzima de segunda hebra y mezcle la muestra mediante un pipeteo suave antes de incubar a 16 grados centígrados durante dos horas y media.

Limpie las muestras con el kit de limpieza y concentración de oligonucleótidos para reacciones de 100 microlitros y eluya las muestras en 38 microlitros de agua libre de nucleasas. Mezclar la reacción de reparación final por pipeteo e incubarla a 20 grados centígrados durante 30 minutos. Siga la incubación a 20 grados centígrados con una incubación de 30 minutos a 65 grados centígrados.

En primer lugar, diluya los adaptadores para la secuenciación de próxima generación diez veces en 10 miliMolar tris HCl hasta una concentración final de 1,5 microMolar. A continuación, añada 2,5 microlitros de adaptador diluido y un microlitro de potenciador de ligadura a cada muestra y mézclelas en vórtice. A continuación, agregue 15 microlitros de mezcla maestra de ligasa TA roma.

Pipetear la muestra hacia arriba y hacia abajo para mezclarla e incubarla a 20 grados centígrados durante 15 minutos. A continuación, añada tres microlitros de enzima reactivo de escisión específica de uracilo e incube la muestra a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Una vez completada la ligadura, agregue 13,5 microlitros de agua libre de nucleasa a la muestra para un volumen total de 100 microlitros y proceda a la selección del tamaño.

Aclimata las perlas magnéticas a temperatura ambiente. Agregue 30 microlitros de perlas magnéticas aclimatadas y resuspendidas a cada muestra y mezcle mediante pipeteo. Transfiera la muestra a un tubo de 1,5 mililitros e incube a temperatura ambiente durante cinco minutos.

Coloque la muestra en un soporte magnético durante cinco minutos para separar las perlas del sobrenadante. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 mililitros y deseche las perlas magnéticas. Agregue una nueva alícuota de 15 microlitros de perlas magnéticas a cada muestra.

Mezclar bien pipeteando e incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente. Coloque las muestras en una rejilla magnética e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego, retire y deseche con cuidado los sobrenadantes, asegurándose de no alterar las cuentas.

Añadir 200 microlitros de etanol 80% recién preparado a cada una de las muestras sin alterar las perlas magnéticas peletizadas e incubar durante 30 segundos. A continuación, elimine por completo cualquier rastro de etanol de las muestras y seque las perlas al aire durante cinco minutos, pero tenga cuidado de no secarlas en exceso. Para eluir las muestras de las perlas, retire los tubos del soporte magnético.

Agregue 19 microlitros de 10 miliMolar tris HCl. Pipetee la mezcla hacia arriba y hacia abajo varias veces para resuspender las perlas e incubar las muestras durante cinco minutos a temperatura ambiente. Vuelva a colocar las muestras en el soporte magnético e incubelas durante cinco minutos para separar las perlas del sobrenadante.

Extraiga con cuidado 15 microlitros del sobrenadante que contiene las bibliotecas de ADNc purificadas y de tamaño seleccionado de los tubos y transfiéralo a un tubo nuevo de 1,5 mililitros. Agregue cinco microlitros de cebador universal y cinco microlitros de un cebador índice único a cada biblioteca de ADNc purificada y mezcle bien mediante pipeteo. Revise cuidadosamente la mezcla maestra de polimerasa en busca de cristales y otros precipitados y caliente la mezcla maestra a mano hasta que los precipitados se disuelvan.

Agregue 25 microlitros de la mezcla maestra de polimerasa a la muestra. Mezcle la muestra mediante pipeteo y siga las condiciones de ciclo enumeradas en el protocolo de texto adjunto para la amplificación por PCR. Limpie las bibliotecas finales añadiendo 45 microlitros de perlas magnéticas resuspendidas directamente a la reacción de PCR.

Mezclarlos pipeteando e incubarlos a temperatura ambiente durante cinco minutos. Transfiera la muestra a un tubo de 1,5 mililitros y colóquela en un soporte magnético durante cinco minutos. Después de la incubación, deseche el sobrenadante y lávelo dos veces con etanol al 80% recién preparado durante 30 segundos.

Después del segundo lavado, retire completamente el etanol de la muestra y seque al aire el pellet de perla durante cinco minutos. A continuación, eluirlo en 35 microlitros de 0,1x TE. Vuelva a suspender las perlas pipeteándolas e incubelas a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de que el tubo haya estado en el soporte magnético durante cinco minutos, transfiera 30 microlitros del sobrenadante a un tubo nuevo de 1,5 mililitros.

Almacene las bibliotecas a menos 80 grados centígrados. Después del aislamiento del ARN, dos picos distintos de ARNr son visibles en el electroforetograma. La fragmentación del ARN dará como resultado de 50 a 70 fragmentos de ARN de pares de bases.

Se utilizó la transcripción inversa de círculo rodante para generar moléculas de ADNc que se componen de al menos tres repeticiones en tándem de las plantillas circulares de ARN. La selección de tamaño con perlas magnéticas permite purificar bibliotecas del tamaño adecuado. La información de secuenciación de una sola biblioteca C-seq muestra que la mayoría de las repeticiones tienden a tener una longitud de 45 a 80 bases.

Aproximadamente el 50% de las bases que se secuenciaron forman parte de estas repeticiones. Dado que la mayoría de estas bases están presentes en tasas que contienen tres repeticiones o más, el número de bases únicas que se secuencian es aproximadamente un tercio del número total de bases secuenciadas. Una vez que se ha dominado, esta técnica se puede realizar en dos o tres días si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante mantener siempre un entorno de trabajo estéril, libre de ARNas que puedan interferir con su trabajo. También es importante seguir cuidadosamente cada paso para asegurarse de que no se cometan errores durante el procedimiento. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir los errores de transcripción en eucariotas utilizando el ensayo C-seq.