Name: Vigilancia de todo el genoma de errores de transcripción en organismos eucariotas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Aprende a medir errores de transcripción endógenos en organismos eucariotas mediante el ensayo C-seq. Este protocolo computacional utiliza bioinformática avanzada para analizar la fidelidad de la transcripción y estudiar la mutagénesis transcripcional.

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Esta publicación fue hecha posible por el financiamiento del grant T32ES019851 (para C. Fritsch), R01AG054641 y un investigador joven AFAR conceden (a M. Vermulst).

<ol><li>Kireeva, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+reversal+of+RNA+polymerase+II+active+site+closing+controls+fidelity+of+transcription+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Transient reversal of RNA polymerase II active site closing controls fidelity of transcription elongation.</a> Molecular Cell. 30, 557-566 (2008).</li>
<li>Walmacq, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rpb9+subunit+controls+transcription+fidelity+by+delaying+NTP+sequestration+in+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rpb9 subunit controls transcription fidelity by delaying NTP sequestration in RNA polymerase II.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284, 19601-19612 (2009).</li>
<li>Strathern, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fidelity+of+transcription%3A+RPB1+%28RPO21%29+mutations+that+increase+transcriptional+slippage+in+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The fidelity of transcription: RPB1 (RPO21) mutations that increase transcriptional slippage in S. cerevisiae.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288, 2689-2699 (2013).</li>
<li>Irvin, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+assay+for+transcription+errors+reveals+multilayer+control+of+RNA+polymerase+II+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A genetic assay for transcription errors reveals multilayer control of RNA polymerase II fidelity.</a> PLoS Genetics. 10, e1004532(2014).</li>
<li>Gout, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+transcription+errors+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">The landscape of transcription errors in eukaryotic cells.</a> Science Advances. 3, e1701484(2017).</li>
<li>Gout, J. F., Thomas, W. K., Smith, Z., Okamoto, K., Lynch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+detection+of+in+vivo+transcription+errors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Large-scale detection of in vivo transcription errors.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110, 18584-18589 (2013).</li>
<li>Viswanathan, A., You, H. J., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+change+caused+by+transcriptional+bypass+of+uracil+in+nondividing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phenotypic change caused by transcriptional bypass of uracil in nondividing cells.</a> Science. 284, 159-162 (1999).</li>
<li>Bregeon, D., Doddridge, Z. A., You, H. J., Weiss, B., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+mutagenesis+induced+by+uracil+and+8-oxoguanine+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional mutagenesis induced by uracil and 8-oxoguanine in Escherichia coli.</a> Molecular Cell. 12, 959-970 (2003).</li>
<li>Saxowsky, T. T., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+encounters+with+DNA+damage%3A+transcription-coupled+repair+or+transcriptional+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase encounters with DNA damage: transcription-coupled repair or transcriptional mutagenesis.</a> Chemical Reviews. 106, 474-488 (2006).</li>
<li>Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((8-Oxoguanine-mediated+transcriptional+mutagenesis+causes+Ras+activation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 105, 18877-18882 (2008).</li>
<li>Vermulst, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+errors+induce+proteotoxic+stress+and+shorten+cellular+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Transcription errors induce proteotoxic stress and shorten cellular lifespan.</a> Nature Communications. 6, 8065(2015).</li>
<li>van Leeuwen, F. W., Burbach, J. P., Hol, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+RNA%3A+a+first+example+of+molecular+misreading+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Mutations in RNA: a first example of molecular misreading in Alzheimer's disease.</a> Trends in Neurosciences. 21, 331-335 (1998).</li>
<li>van Leeuwen, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frameshift+mutants+of+beta+amyloid+precursor+protein+and+ubiquitin-B+in+Alzheimer%27s+and+Down+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Frameshift mutants of beta amyloid precursor protein and ubiquitin-B in Alzheimer's and Down patients.</a> Science. 279, 242-247 (1998).</li>
<li>Morreall, J. F., Petrova, L., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+mutagenesis+and+its+potential+roles+in+the+etiology+of+cancer+and+bacterial+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional mutagenesis and its potential roles in the etiology of cancer and bacterial antibiotic resistance.</a> Journal of Cellular Physiology. 228, 2257-2261 (2013).</li>
<li>Strathern, J. N., Jin, D. J., Court, D. L., Kashlev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+transcription+fidelity+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of transcription fidelity mutants.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1819, 694-699 (2012).</li>
<li>Acevedo, A., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Library+preparation+for+highly+accurate+population+sequencing+of+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Library preparation for highly accurate population sequencing of RNA viruses.</a> Nature Protocols. 9, 1760-1769 (2014).</li>
<li>Traverse, C. C., Ochman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Spectra+of+Transcription+Insertions+and+Deletions+Reveal+That+Slippage+Depends+on+RNA%3ADNA+Hybrid+Complementarity%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Spectra of Transcription Insertions and Deletions Reveal That Slippage Depends on RNA:DNA Hybrid Complementarity.</a> mBio. 8, (2017).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200">Cutadapt Removes Adapter Sequences From High-Throughput Sequencing Reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
<li>Kent, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLAT--the+BLAST-like+alignment+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">BLAT--the BLAST-like alignment tool.</a> Genome Research. 12, 656-664 (2002).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat2%3A+accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions%2C+deletions+and+gene+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biology. 14, R36(2013).</li>
<li>Zhou, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+RNA+polymerase+rpoB+mutations+that+alter+transcription+slippage+during+elongation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of RNA polymerase rpoB mutations that alter transcription slippage during elongation in Escherichia coli.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288, 2700-2710 (2013).</li>
<li>Reid-Bayliss, K. S., Loeb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+RNA+consensus+sequencing+for+high-fidelity+detection+of+transcriptional+mutagenesis-induced+epimutations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Accurate RNA consensus sequencing for high-fidelity detection of transcriptional mutagenesis-induced epimutations.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114, 9415-9420 (2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, describimos un protocolo optimizado para la elaboración de bibliotecas de C-seq para la detección de errores de transcripción en Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogastery Caenorhabditis elegans. Este protocolo tiene numerosas ventajas sobre los protocolos existentes, así como técnicas alternativas.
En los últimos 15 años, numerosos reportero han desarrollado sistemas que dependen de luciferase7,8</su...

El genoma proporciona un preciso plan biológico de la vida. Para implementar correctamente este anteproyecto, es importante que el genoma se transcribe con gran precisión. Sin embargo, la transcripción es poco probable que sea libre de errores. Por ejemplo, ARN Polimerasas durante mucho tiempo se han sabido para ser propenso en vitro1,2, y fue demostrado recientemente que cometen errores en vivo 3,5,6, así particularmente cuando se enfrenta con ADN daños7,8,9,10. Tomados en conjunto, estas observaciones indican que errores de transcripción se producen continuamente en todas las células vivas, sugiriendo que podría ser una fuente potente de proteínas mutadas.
Este proceso, llamado mutagénesis transcripcional, difiere de la mutagénesis clásica de dos maneras. En primer lugar, en contraste con las mutaciones genéticas, errores de transcripción afectan las células mitotic y poste-mitotic, como no dependen de la replicación del ADN. Estudio de los mecanismos que afectan a la fidelidad de la transcripción, por lo tanto, proporcionará información valiosa sobre la carga de mutación de las células mitotic y poste-mitotic. Curiosamente, errores de transcripción recientemente han sido implicados en la promoción de la agregación de proteína11,12,13 y presumidos para contribuir a ambas de la carcinogénesis10 y el desarrollo de resistencia antibiótica en bacterias14.
En segundo lugar, en contraste con las mutaciones genéticas, errores de transcripción son transitorias en la naturaleza. Su existencia temporal es particularmente desafiante ya que hace sumamente difícil detectar errores de transcripción. Por ejemplo, mientras que varios laboratorios han ideado ensayos reportero valiosa para el estudio de mutagénesis transcripcional, estos ensayos sólo son capaces de medir los errores de transcripción en un número limitado de contextos y modelo organismos4,15. Para superar estas limitaciones, muchos investigadores han recurrido a la tecnología de la secuenciación del RNA (RNA-seq), que teóricamente permite errores de transcripción que se registrará en el transcriptoma de cualquier especie. Sin embargo, estos estudios son fácilmente confundidos por artefactos de construcción de biblioteca, tales como errores de transcripción inversa, PCR amplificación errores y lo errores de la secuencia sí mismo. Por ejemplo, reverso transcriptasas cometer un error de aproximadamente cada bases ~ 20.000, mientras que ARN Polimerasas (RNAPs) se esperan que sólo un error cada 300.000 bases5,6. Porque la tasa de error de transcripción reversa solo empequeñece la tasa de error de Polimerasas del RNA dentro de las células, es prácticamente imposible distinguir entre errores de transcripción verdadero artefactos causados por la preparación de la biblioteca en datos tradicionales de RNA-Seq ( Figura 1a).
Para resolver este problema, hemos desarrollado una versión optimizada de la secuenciación del círculo (Cirseq, o C-seq en adelante) ensayo5,16. Este ensayo permite detectar errores de transcripción y otras variantes raras en RNA en el transcriptoma5. El análisis de secuencia circular lleva este nombre porque un paso clave en este ensayo gira en torno a circularización de RNA. Una vez que los objetivos de RNA son circular, son revés transcrito de manera círculo rodante, para producir moléculas de cDNA lineal que contienen numerosas copias de la misma plantilla del RNA. Si un error estuvo presente en una de estas plantillas, este error también estaría presente en cada repetición única dentro de la molécula de cDNA. En cambio, errores introducidos por transcripción reversa y amplificación por PCR secuenciación tienden a surgir al azar y así estará presentes en sólo una o dos repeticiones. Por lo tanto, generando una secuencia de consenso para cada molécula de ADNc y distinguir errores aleatorios de los errores que se producen en todas las repeticiones, artefactos de construcción de biblioteca con eficacia pueden ser separados de los errores de transcripción verdadera (Figura 1b).
Si se utiliza correctamente, puede utilizarse el ensayo C-seq para detectar con precisión la tasa de base sustituciones, inserciones y eliminaciones en el ARN en el transcriptoma de cualquier especie (por ejemplo, véase travesía y Ochman17). Por ejemplo, hemos utilizado el ensayo C-seq para proporcionar mediciones de todo el genoma de la tasa de error de transcripción en Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogastery Caenorhabditis elegans con una única resolución base5 (inéditas observaciones). Originalmente utilizado para exactamente la secuencia de las poblaciones de virus de ARN, esta versión optimizada del ensayo C-seq ha racionalizado para reducir al mínimo las agresiones durante la preparación de la biblioteca que contribuyen a los artefactos de construcción de biblioteca. Además, mediante el uso de un número de kits disponibles en el mercado, el rendimiento de la prueba se mejora, así como su facilidad de uso. Si se usa correctamente, este análisis pueden detectar con precisión miles de errores de transcripción por repetición, de tal modo grandemente mejorando en anteriores estudios6. En general, este método proporciona una poderosa herramienta para el estudio de mutagénesis transcripcional y permitirá al usuario obtener nuevos conocimientos sobre los mecanismos que controlan la fidelidad de la transcripción en una amplia gama de organismos.

<table><tbody><tr><td>Kit de purificación de ARN RiboPure</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1926</td><td>Purificación total de ARN</td></tr><tr><td>Kit de purificación de ARNm de Genelute</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MRN70-1KT</td><td>Purificación de ARNm</td></tr><tr><td>Agua libre de nucleasas</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td>Elución y dilución</td></tr><tr><td>Ambion RNasa III</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2290</td><td>Fragmentación de ARN</td></tr><tr><td>T4 Ligasa 1 (ssRNA Ligasa)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204S Circularización</td> de <td>ARN</td></tr><tr><td>Ribolock</td><td>ThermoFisher</td><td>EO0381</td><td>Inhibidor de RNasa</td></tr><tr><td>SuperScript III Transcriptasa inversa</td><td>ThermoFisher</td><td>18080044</td><td>Transcripción inversa de círculo rodante</td></tr><tr><td>10 mM Mezcla dNTP</td><td>ThermoFisher 18427013</td><td></td><td>Transcripción inversa de círculo rodante</td></tr><tr><td>Hexámeros aleatorios (50 ng/&micro; L)</td><td>ThermoFisher</td><td>N8080127</td><td>Transcripción inversa de círculo rodante</td></tr><tr><td>Módulo de síntesis de segunda cadena NEB Síntesis</td> de segunda <td>cadena</td><td>E6111S</td> de <td>New England Biolabs</td></tr><tr><td>Kit de preparación de la biblioteca de ADN NEBNext Ultra para la</td><td>preparación de la biblioteca de ADNc</td><td>Illumina New England Biolabs</td><td>E7370S</td></tr><tr><td>Imprimaciones de índice NEB Next Imprimaciones</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>de PCR multiplex NEB E7335SOligo Limpio & Concentrador</td><td>Zymo Research</td><td>D4061</td><td>Limpieza de muestras de ARN y ADN</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Imán</td><td>ThermoFisher</td><td>12321D</td><td>Purificación magnética de perlas</td></tr><tr><td>AMPure XP Perlas</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Purificación magnética de perlas</td></tr><tr><td>Eppendorf 5424 Microcentrífuga FisherScientific</td><td></td><td>05-403-93</td><td></td></tr><tr><td>INCU-Shaker 10 L</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H1010</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>T100 Termociclador</td><td>BIO RAD</td><td>1861096</td><td>Condiciones de ciclo de media a alta temperatura</td></tr><tr><td>PTC-200 Termociclador GMI</td><td></td><td>8252-30-0001&nbsp;</td><td>Condiciones de ciclo a baja temperatura</td></tr><tr><td>RNase Away Molecular</td><td>Bioproducts</td><td>700S-11</td><td>Esterilización</td></tr><tr><td>50 mL Tubo de centrífuga</td><td>Corning</td><td>430290</td> Tubo de centrífuga de 15 mL <td>sin nucleasa</td></tr><tr><td></td><td>Corning</td><td>430052</td> Tubos Eppendorf <td>sin nucleasa</td></tr><tr><td></td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td> Sistema de estación de cinta 4200 <td>sin nucleasas</td></tr><tr><td></td><td>Agilent</td><td>G2991AA</td><td>Instrumento de análisis de nucleótidos para el control de calidad de muestras de ARN y ADN monocatenario</td></tr><tr><td>Cinta de cribado de ARN de alta sensibilidad</td><td>Agilent</td><td>5067-5579</td><td>Control de calidad de muestras de ARN y ADN monocatenario</td></tr><tr><td>Tampón de muestras RNA ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5577</td><td>Control de calidad de muestras de ARN y ADN monocatenario</td></tr><tr><td>Escalera RNA ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5578</td><td>Control de calidad de muestras de ARN y ADN monocatenario</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer Instrument</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td>Control de calidad de ADN bicatenario</td></tr><tr><td>Kit de ADN de alta sensibilidad</td><td>Agilent</td><td>5067-4626 Control de</td><td>calidad para muestras de ADNc bicatenario</td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>VWR</td><td>462-0244</td><td>Incubación</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000C Espectrofotómetro</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-2000C</td><td>Determinación de la concentración de ARN</td></tr></tbody></table>

vigilancia de todo el genoma de errores de transcripción en organismos eucariotas

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Transcripción exacta es necesaria para la expresión fiel de la información genética. Sorprendentemente sin embargo, poco se sabe sobre los mecanismos que controlan la fidelidad de la transcripción. Para llenar este vacío en los conocimientos científicos, hemos optimizado recientemente el análisis de secuenciación del círculo para detectar errores de transcripción en el transcriptoma de Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogastery Caenorhabditis de elegans de. Este protocolo proporcionará a los investigadores una poderosa nueva herramienta para el paisaje de errores de transcripción en las células eucariotas por lo que los mecanismos que controlan la fidelidad de la transcripción pueden ser aclados en detalle sin precedentes.

Como todos los enfoques de secuenciación masivamente paralela, cada experimento C-seq produce un conjunto de datos grandes, difíciles de manejar. Para los usuarios de primera vez, puede ser difícil de manejar estos conjuntos de datos; por lo tanto, se recomienda que todos los usuarios en contacto con un bio-informático experimentado antes de la experimentación. En promedio, la expectativa es que los usuarios generen aproximadamente 55 – 70 Giga bases (Gbases) por ejecutar en más plataform...

Este protocolo ofrece a los investigadores una nueva herramienta para controlar la fidelidad de la transcripción en organismos modelo múltiples.

Vigilancia de todo el genoma de errores de transcripción en organismos eucariotas

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la mutagénesis transcripcional, como qué subunidades de ARN polimerasa o procesos biológicos controlan la fidelidad de la transcripción. La principal ventaja de esta técnica es que permite medir errores de transcripción endógenos en los transcriptomas de organismos eucariotas. Por lo general, las personas nuevas en este protocolo tendrán dificultades debido a la longitud y complejidad del ensayo y a la necesidad de bioinformática avanzada para interpretar los datos.Para comenzar el protocolo, circularice los fragmentos de ARN mediante desnaturalización por calor de 20 microlitros de la muestra previamente preparada a 65 grados centígrados durante un minuto. Después de un minuto, coloque inmediatamente la muestra en hielo durante dos minutos. A continuación, agregue cuatro microlitros de tampón de ARN ligasa T4 10x, cuatro microlitros de ATP 10 milimolar, un microlitro de inhibidor de RNasa, un microlitro de agua libre de nucleasa y ocho microlitros de 50% de polietilenglicol o PEG.A continuación, mezcle bien la muestra mediante vórtice. A continuación, añadir dos microlitros de 10 unidades por microlitro de ARN ligasa T4 uno. Mezclar la muestra de nuevo por pipeteo e incubarla a 25 grados centígrados durante dos horas en un termociclador con la temperatura de la tapa ajustada a 30 grados centígrados.Después de las dos horas de incubación, agregue 10 microlitros de agua libre de nucleasas a la muestra y limpie la muestra con un kit de limpieza y concentración de oligonucleótidos. Eluir la muestra en 20 microlitros de agua libre de nucleasas. Para transcribir inversamente las moléculas circulares de ARN, agregue cuatro microlitros de dNTP de 10 milimolares, cuatro microlitros de 50 nanogramos por hexámeros aleatorios de microlitro y nueve microlitros de agua libre de nucleasa a nueve microlitros de ARN.Mezclar bien pipeteando y desnaturalizar la muestra a 65 grados centígrados durante un minuto. Después de desnaturalizar la muestra, colóquela en hielo durante dos minutos. Añadir a la muestra ocho microlitros de tampón de síntesis de primera cadena 5x, dos microlitros de DTT de 0,1 miliMolar y cuatro microlitros de 200 unidades por microlitro de transcriptasa inversa y mezclar mediante pipeteo.Incubar la muestra a 25 grados centígrados durante 10 minutos con la tapa colocada cinco grados centígrados por encima de la temperatura de incubación. A continuación, incubar la muestra durante 20 minutos a 42 grados centígrados con la tapa ajustada a 47 grados centígrados. Eluir la muestra en 42 microlitros de solución de elución después de limpiar con el kit de limpieza y concentrador.Utilice el kit de síntesis de segunda cadena para generar una biblioteca de ADNc de doble cadena. Coloque las muestras en hielo y agregue 30 microlitros de agua NF a 38 microlitros de su muestra. A continuación, agregue ocho microlitros de tampón de segunda hebra 10x y cuatro microlitros de enzima de segunda hebra y mezcle la muestra mediante un pipeteo suave antes de incubar a 16 grados centígrados durante dos horas y media.Limpie las muestras con el kit de limpieza y concentración de oligonucleótidos para reacciones de 100 microlitros y eluya las muestras en 38 microlitros de agua libre de nucleasas. Mezclar la reacción de reparación final por pipeteo e incubarla a 20 grados centígrados durante 30 minutos. Siga la incubación a 20 grados centígrados con una incubación de 30 minutos a 65 grados centígrados.En primer lugar, diluya los adaptadores para la secuenciación de próxima generación diez veces en 10 miliMolar tris HCl hasta una concentración final de 1,5 microMolar. A continuación, añada 2,5 microlitros de adaptador diluido y un microlitro de potenciador de ligadura a cada muestra y mézclelas en vórtice. A continuación, agregue 15 microlitros de mezcla maestra de ligasa TA roma.Pipetear la muestra hacia arriba y hacia abajo para mezclarla e incubarla a 20 grados centígrados durante 15 minutos. A continuación, añada tres microlitros de enzima reactivo de escisión específica de uracilo e incube la muestra a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Una vez completada la ligadura, agregue 13,5 microlitros de agua libre de nucleasa a la muestra para un volumen total de 100 microlitros y proceda a la selección del tamaño.Aclimata las perlas magnéticas a temperatura ambiente. Agregue 30 microlitros de perlas magnéticas aclimatadas y resuspendidas a cada muestra y mezcle mediante pipeteo. Transfiera la muestra a un tubo de 1,5 mililitros e incube a temperatura ambiente durante cinco minutos.Coloque la muestra en un soporte magnético durante cinco minutos para separar las perlas del sobrenadante. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 mililitros y deseche las perlas magnéticas. Agregue una nueva alícuota de 15 microlitros de perlas magnéticas a cada muestra.Mezclar bien pipeteando e incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente. Coloque las muestras en una rejilla magnética e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego, retire y deseche con cuidado los sobrenadantes, asegurándose de no alterar las cuentas.Añadir 200 microlitros de etanol 80% recién preparado a cada una de las muestras sin alterar las perlas magnéticas peletizadas e incubar durante 30 segundos. A continuación, elimine por completo cualquier rastro de etanol de las muestras y seque las perlas al aire durante cinco minutos, pero tenga cuidado de no secarlas en exceso. Para eluir las muestras de las perlas, retire los tubos del soporte magnético.Agregue 19 microlitros de 10 miliMolar tris HCl. Pipetee la mezcla hacia arriba y hacia abajo varias veces para resuspender las perlas e incubar las muestras durante cinco minutos a temperatura ambiente. Vuelva a colocar las muestras en el soporte magnético e incubelas durante cinco minutos para separar las perlas del sobrenadante.Extraiga con cuidado 15 microlitros del sobrenadante que contiene las bibliotecas de ADNc purificadas y de tamaño seleccionado de los tubos y transfiéralo a un tubo nuevo de 1,5 mililitros. Agregue cinco microlitros de cebador universal y cinco microlitros de un cebador índice único a cada biblioteca de ADNc purificada y mezcle bien mediante pipeteo. Revise cuidadosamente la mezcla maestra de polimerasa en busca de cristales y otros precipitados y caliente la mezcla maestra a mano hasta que los precipitados se disuelvan.Agregue 25 microlitros de la mezcla maestra de polimerasa a la muestra. Mezcle la muestra mediante pipeteo y siga las condiciones de ciclo enumeradas en el protocolo de texto adjunto para la amplificación por PCR. Limpie las bibliotecas finales añadiendo 45 microlitros de perlas magnéticas resuspendidas directamente a la reacción de PCR.Mezclarlos pipeteando e incubarlos a temperatura ambiente durante cinco minutos. Transfiera la muestra a un tubo de 1,5 mililitros y colóquela en un soporte magnético durante cinco minutos. Después de la incubación, deseche el sobrenadante y lávelo dos veces con etanol al 80% recién preparado durante 30 segundos.Después del segundo lavado, retire completamente el etanol de la muestra y seque al aire el pellet de perla durante cinco minutos. A continuación, eluirlo en 35 microlitros de 0,1x TE. Vuelva a suspender las perlas pipeteándolas e incubelas a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de que el tubo haya estado en el soporte magnético durante cinco minutos, transfiera 30 microlitros del sobrenadante a un tubo nuevo de 1,5 mililitros.Almacene las bibliotecas a menos 80 grados centígrados. Después del aislamiento del ARN, dos picos distintos de ARNr son visibles en el electroforetograma. La fragmentación del ARN dará como resultado de 50 a 70 fragmentos de ARN de pares de bases.Se utilizó la transcripción inversa de círculo rodante para generar moléculas de ADNc que se componen de al menos tres repeticiones en tándem de las plantillas circulares de ARN. La selección de tamaño con perlas magnéticas permite purificar bibliotecas del tamaño adecuado. La información de secuenciación de una sola biblioteca C-seq muestra que la mayoría de las repeticiones tienden a tener una longitud de 45 a 80 bases.Aproximadamente el 50% de las bases que se secuenciaron forman parte de estas repeticiones. Dado que la mayoría de estas bases están presentes en tasas que contienen tres repeticiones o más, el número de bases únicas que se secuencian es aproximadamente un tercio del número total de bases secuenciadas. Una vez que se ha dominado, esta técnica se puede realizar en dos o tres días si se realiza correctamente.Al intentar este procedimiento, es importante mantener siempre un entorno de trabajo estéril, libre de ARNas que puedan interferir con su trabajo. También es importante seguir cuidadosamente cada paso para asegurarse de que no se cometan errores durante el procedimiento. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir los errores de transcripción en eucariotas utilizando el ensayo C-seq.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Presentamos un plan estratégico y un protocolo para identificar variantes genéticas no codificantes que afectan la unión al ADN del factor de transcripción (TF). Se proporciona un protocolo experimental detallado para el análisis del ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA) y el ensayo de precipitación de afinidad del ADN (DAPA) de la unión al ADN TF dependiente del genotipo.

La detección de funcional no codificante-variantes genéticas Uso de movilidad electroforética Shift ensayo (EMSA) y el ADN afinidad Precipitación Ensayo (DAPA)

Aquí, presentamos un protocolo para lograr la resolución de pares de bases cercanos a las interacciones proteína-ADN. Esto se obtiene mediante el tratamiento con exonucleasas de fragmentos de ADN enriquecidos selectivamente por inmunoprecipitación de cromatina (ChIP-exo) seguido de secuenciación de alto rendimiento.

El Método chip-exo: La identificación de las interacciones proteína-ADN con zona de Base Par de precisión

Describimos un enfoque experimental básico para el análisis de la terminación de la transcripción por la ARN polimerasa II in vivo utilizando BrUTP mediante el enfoque de rodaje de transcripción específica de cadena (TRO) en levadura en ciernes. Este protocolo puede extenderse para estudiar la terminación de la transcripción por otras ARN polimerasas tanto en levaduras como en eucariotas superiores.

Análisis de terminación de la transcripción Uso Enfoque BrUTP-capítulo específico de la transcripción de ejecución en (TRO)

Describimos la división endógena de la cromatina junto con la secuenciación de alto rendimiento (ChEC-seq), un método ortogonal de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) para cartografiar los sitios de unión a proteínas del genoma con proteínas de fusión de nucleasa micrococcal (MNasa).

Genoma de todo el mapa de las interacciones Proteína-ADN con ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Este protocolo describe el uso combinatorio de ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq y perfiles para las líneas celulares y células primarias del ribosoma. Permite el seguimiento de cambios en el factor de transcripción vinculante, novo de transcripción, procesamiento de RNA, rotación y traducción con el tiempo y viendo el curso general de los acontecimientos en las células activadas o cambiantes.

Análisis en tiempo real del Factor de transcripción vinculante, transcripción, traducción y rotación para mostrar los eventos globales durante la activación celular

Utilizando un Cas9 Confecciones complejo de ribonucleoproteína (RNP) es un método eficaz para la edición del genoma exacto, eficiente. Aquí, podemos destacar su utilidad en una amplia gama de células y organismos, incluyendo las células humanas primarias y ambos clásicos y emergentes en organismos modelo.

Mayor genoma edición con Cas9 ribonucleoproteína en diversas células y organismos

Secuenciación de próxima generación (NGS) es una poderosa herramienta para la caracterización genómica que está limitada por la tasa alta de error de la plataforma (~0.5–2.0%). Describimos nuestros métodos de corrección de error de la secuencia que nos permiten obviar la tasa de error NGS y detectar mutaciones en fracciones de alelo variante tan raros como 0.0001.

Detección de eventos raros usando ADN Error corregido y secuenciación de ARN

Presentamos un método rápido y eficiente para detectar roturas comunes de sitios frágiles a través de la inmunoprecipitación de cromatina nativa γH2A.X (ChIP). Este enfoque reduce significativamente tanto el tiempo como la mano de obra asociados con los ensayos ChIP γH2A.X tradicionales, al tiempo que mantiene una alta reproducibilidad y confiabilidad de los resultados.

Captura de roturas de sitios frágiles comunes mediante γH2A nativo. X ChIP

La mutagénesis insercional es una herramienta esencial en genética avanzada para identificar elementos genómicos funcionales. Aquí, describimos el Cribado basado en la inserción para elementos funcionales y transcripciones (InSET), un método para detectar sitios de integración de lentivirus dentro de una biblioteca de células de mutagénesis de inserción basada en lentivirus.

Identificación de sitios de integración de lentivirus funcionalmente relevantes en una biblioteca de células de mutagénesis insercional

En este manuscrito, describimos un protocolo para examinar funcionalmente la transcripción y la actividad inhibitoria de agentes antibacterianos dirigidos a la transcripción bacteriana.

Los ensayos in vitro de transcripción y su aplicación en el descubrimiento de medicamentos

Aprende a medir errores de transcripción endógenos en organismos eucariotas mediante el ensayo C-seq. Este protocolo computacional utiliza bioinformática avanzada para analizar la fidelidad de la transcripción y estudiar la mutagénesis transcripcional.

Vigilancia de todo el genoma de errores de transcripción en organismos eucariotas

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