Name: Donde usted cortar materias: Una disección y guía de análisis para la orientación espacial de la Retina de ratón de hitos Ocular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Aprenda a orientar la retina de ratón mediante disección precisa utilizando hitos anatómicos oculares como músculos rectos, fisura coroidea y gradiente de S-opsina. Este protocolo estandarizado mejora la exactitud en estudios de neurociencia y oftalmología.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Nos gustaría agradecer a Bretaña día y Jessica Onyak su asistencia técnica y el Dr. Liu por favor dejarnos utilizar su microscopio epifluorescente. Agradecimientos de apoyo: NIH R15EY026255-01 y la Fundación de Kirchgessner Karl.

<ol><li>Applebury, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+cone+photoreceptor%3A+A+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The murine cone photoreceptor: A single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).</li>
<li>Hughes, S., Watson, T. S., Foster, R. G., Peirson, S. N., Hankins, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonuniform+distribution+and+spectral+tuning+of+photosensitive+retinal+ganglion+cells+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Nonuniform distribution and spectral tuning of photosensitive retinal ganglion cells of the mouse retina.</a> Curr Biol. 23 (17), 1696-1701 (2013).</li>
<li>Sondereker, K. B., Onyak, J. R., Islam, S. W., Ross, C. L., Renna, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanopsin+ganglion+cell+outer+retinal+dendrites%3A+Morphologically+distinct+and+asymmetrically+distributed+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Melanopsin ganglion cell outer retinal dendrites: Morphologically distinct and asymmetrically distributed in the mouse retina.</a> J Comp Neurol. 525 (17), 3653-3665 (2017).</li>
<li>Bleckert, A., Schwartz, G. W., Turner, M. H., Rieke, F., Wong, R. O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+space+is+represented+by+nonmatching+topographies+of+distinct+mouse+retinal+ganglion+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Visual space is represented by nonmatching topographies of distinct mouse retinal ganglion cell types.</a> Current Biology. 24 (3), 310-315 (2014).</li>
<li>Warwick, R. A., Kaushansky, N., Sarid, N., Golan, A., Rivlin-Etzion, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhomogeneous+Encoding+of+the+Visual+Field+in+the+Mouse+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Inhomogeneous Encoding of the Visual Field in the Mouse Retina.</a> Curr Biol. 28 (5), 655-665 (2018).</li>
<li>Valiente-Soriano, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+melanopsin+positive+neurons+in+pigmented+and+albino+mice%3A+evidence+for+melanopsin+interneurons+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Distribution of melanopsin positive neurons in pigmented and albino mice: evidence for melanopsin interneurons in the mouse retina.</a> Front Neuroanat. 8, 131(2014).</li>
<li>Sabbah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+retinal+code+for+motion+along+the+gravitational+and+body+axes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A retinal code for motion along the gravitational and body axes.</a> Nature. 546 (7659), 492-497 (2017).</li>
<li>Vaney, D. I., Sivyer, B., Taylor, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direction+selectivity+in+the+retina%3A+Symmetry+and+asymmetry+in+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Direction selectivity in the retina: Symmetry and asymmetry in structure and function.</a> Nat Rev Neurosci. 13 (3), 194-208 (2012).</li>
<li>Huberman, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+identification+of+an+On-Off+direction-selective+retinal+ganglion+cell+subtype+reveals+a+layer-specific+subcortical+map+of+posterior+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic identification of an On-Off direction-selective retinal ganglion cell subtype reveals a layer-specific subcortical map of posterior motion.</a> Neuron. 62 (3), 327-334 (2009).</li>
<li>Ueki, Y., Ramirez, G., Salcedo, E., Stabio, M. E., Lefcort, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Ikbkap+causes+slow%2C+progressive+retinal+degeneration+in+a+mouse+model+of+familial+dysautonomia%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Loss of Ikbkap causes slow, progressive retinal degeneration in a mouse model of familial dysautonomia.</a> eNeuro. 3 (5), (2016).</li>
<li>Maiorano, N. A., Hindges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricted+perinatal+retinal+degeneration+induces+retina+reshaping+and+correlated+structural+rearrangement+of+the+retinotopic+map%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Restricted perinatal retinal degeneration induces retina reshaping and correlated structural rearrangement of the retinotopic map.</a> Nat Commun. 4, 1938(2013).</li>
<li>Hadj-Said, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+topographical+analysis+of+the+losses+of+cone+photoreceptors+and+retinal+ganglion+cells+under+taurine+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitative and topographical analysis of the losses of cone photoreceptors and retinal ganglion cells under taurine depletion.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (11), 4692-4703 (2016).</li>
<li>Tao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+temporal+topography+of+the+N-Methyl-+N-nitrosourea+induced+photoreceptor+degeneration+in+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The temporal topography of the N-Methyl- N-nitrosourea induced photoreceptor degeneration in mouse retina.</a> Sci Rep. 5, 18612(2015).</li>
<li>Risner, M. L., Pasini, S., Cooper, M. L., Lambert, W. S., Calkins, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axogenic+mechanism+enhances+retinal+ganglion+cell+excitability+during+early+progression+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Axogenic mechanism enhances retinal ganglion cell excitability during early progression in glaucoma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2018).</li>
<li>Estevez, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Form+and+function+of+the+M4+cell%2C+an+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cell+type+contributing+to+geniculocortical+vision%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Form and function of the M4 cell, an intrinsically photosensitive retinal ganglion cell type contributing to geniculocortical vision.</a> J Neurosci. 32 (39), 13608-13620 (2012).</li>
<li>Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transretinal+ERG+recordings+from+mouse+retina%3A+Rod+and+cone+photoresponses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transretinal ERG recordings from mouse retina: Rod and cone photoresponses.</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li>
<li>Lin, B., Wang, S. W., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+ganglion+cell+type%2C+size%2C+and+spacing+can+be+specified+independent+of+homotypic+dendritic+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Retinal ganglion cell type, size, and spacing can be specified independent of homotypic dendritic contacts.</a> Neuron. 43 (4), 475-485 (2004).</li>
<li>Ortin-Martinez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Number+and+distribution+of+mouse+retinal+cone+photoreceptors%3A+differences+between+an+albino+%28Swiss%29+and+a+pigmented+%28C57%2FBL6%29+strain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Number and distribution of mouse retinal cone photoreceptors: differences between an albino (Swiss) and a pigmented (C57/BL6) strain.</a> PLoS One. 9 (7), 102392(2014).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+degeneration+and+apoptosis+patterns+of+cone+photoreceptors+in+rd11+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The degeneration and apoptosis patterns of cone photoreceptors in rd11 Mice.</a> J Ophthalmol. 2017, 9721362(2017).</li>
<li>Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+targeted+recording+of+GFP-expressing+neurons+for+light+responses+and+live-cell+imaging+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina.</a> Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+spatial+organization+of+Muller+glia+in+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Anatomy and spatial organization of Muller glia in mouse retina.</a> J Comp Neurol. 525 (8), 1759-1777 (2017).</li>
<li>Stabio, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+map+of+the+mouse+eye+for+orienting+retinal+topography+in+anatomical+space%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">A novel map of the mouse eye for orienting retinal topography in anatomical space.</a> J Comp Neurol. 526 (11), (2018).</li>
<li>Lamb, T. D., Collin, S. P., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+vertebrate+eye%3A+Opsins%2C+photoreceptors%2C+retina+and+eye+cup%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Evolution of the vertebrate eye: Opsins, photoreceptors, retina and eye cup.</a> Nat Rev Neurosci. 8 (12), 960-976 (2007).</li>
<li>Sterratt, D. C., Lyngholm, D., Willshaw, D. J., Thompson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+anatomical+and+visual+space+for+the+mouse+retina%3A+Computational+reconstruction+and+transformation+of+flattened+retinae+with+the+Retistruct+package%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Standard anatomical and visual space for the mouse retina: Computational reconstruction and transformation of flattened retinae with the Retistruct package.</a> PLoS Comput Biol. 9 (2), 1002921(2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

No ha habido ningún protocolo completa, estandarizada para la determinación y la orientación de la retina de ratón aislados en el espacio anatómico de etiquetado. El protocolo detallado aquí intenta llenar este vacío por estandarizar y detallando cómo utilizar puntos profundos anatómicos como referencia puntos a confiablemente identificar orientación retiniana. Se ha demostrado que los puntos anatómicos profundos en este protocolo proporcionan un método más preciso y confiable para orientar la retina de ratón que hitos superficiales tales como quemaduras corneales22. Así, estudios que han confiado en quemaduras corneales para orientación retiniana pueden haber tenido mayor errores en orientación de estudios que se han basado en puntos de referencia como los músculos del músculo recto y fisura coroide. Esta discrepancia pone de relieve la necesidad y la importancia de este protocolo estandarizado con respecto a la interpretación de los resultados y realizar comparaciones entre los estudios que dependen de la orientación exacta de retina. En general, un protocolo estandarizado proporcionará un método común para los investigadores de la visión a seguir, eliminando así la presencia de una variable de confusión en la adquisición de datos que puede ocurrir con el uso de métodos no estandarizados para la identificación de retina orientación.
Los métodos presentados aquí son fácilmente repetible y aplicable a muchos tipos de protocolos experimentales. De hecho, una de las mayores ventajas de este protocolo es su adaptabilidad. Debido a la fisura coroide, expresión de s-opsina y monumentos de músculo de músculo recto se todos han encontrado confiablemente identificar orientación retiniana22 la señal que mejor se adapte a los parámetros experimentales se puede elegir para optimizar la adquisición de datos (tabla 1). Además, se pueden combinar métodos de disección con el fin de aclarar aún más la orientación de la retina. Por ejemplo, cortes de fisura coroide pueden combinarse con inmunohistoquímica s-opsina para orientar todos los cuatro polos de la retina: hemisferios nasal y temporales pueden ser identificados por los cortes de fisura coroide y s-opsina inmunohistoquímica se puede identificar hemisferios ventrales y dorsales. Sin embargo, la adaptabilidad de este protocolo puede estar limitada por la naturaleza sensible al tiempo de los experimentos de Fisiología. Porque el tiempo que toma para identificar un punto de referencia, hacer una quemadura corneal y ejecutar un corte alivio podría resultar en la muerte de tejido importante en experimentos ex vivo , algunos de estos métodos de disección pueden ser inferior al óptimos. Afortunadamente, una vez que un disector se ha convertido en familiar con la fisura coroide o el método de disección de músculo recto superior, identificar los hitos profunda y el alivio de cortes rápidamente a formar parte de la rutina de disección y no añadir significativamente a la longitud de la disección. Aunque reconocemos que los pasos detallados aquí pueden añadir el tiempo a experimentos extremadamente sensibles al tiempo, le sugerimos utilizar el gradiente s-opsina para post hoc retiniana orientación cuando la viabilidad de los tejidos ya no es un problema (figura 3 ). Coloración de la retina para s-opsina es una forma efectiva para orientar a la retina, como pueden identificar todos los cuatro polos: s-opsina coloración divide la retina en polos dorsales y ventrales y permite la identificación de la nasal y temporal postes dependiendo de si la retina es de un ojo derecho o izquierdo (figura 3). Por lo tanto, creemos que este protocolo ofrece un conjunto de métodos para la orientación exacta de retina que puede cumplir con los parámetros experimentales confiable y repetible.
Como con cualquier disección modificada retiniana, la validez del método de disección está limitada por la exactitud del disector y la calidad del tejido que ha sido aislado. Si los tejidos se pierde durante la disección o una retina es demasiado destrozada para la reconstrucción precisa, Retistruct y el programa MATLAB no serán capaces de reconstruir confiablemente u orientar la retina. Por lo tanto, es importante practicar el método de disección antes de experimentos utilizando para la recolección de datos. Mientras que los tipos de disecciones explicaron aquí no es difícil, debe ser practicadas para asegurar la repetibilidad de identificar orientación retiniana con una señal particular. Además, es esencial que se utiliza la práctica de disector visualmente identificar los puntos anatómicos antes de comenzar la recolección de datos para asegurarse de que la señal correcta. Una forma de comprobar la precisión de un disector especial es hacer cualquier fisura coroide cortes o músculo recto superior corta y luego comparar la ubicación de los cortes para el gradiente s-opsina, puesto que es un marcador fijo y así no es dependiente de la precisión de dissectio n. disectores potenciales también pueden comparar sus retinas reconstruidos a los ejemplos de retinas reconstruidos con señal precisa cortes se muestran en la figura 1 y la figura 2. Esencialmente, un disector potencial debe realizar los pasos descritos en este protocolo para un tipo particular de la disección, ya sea el músculo recto superior o coroides fisuras método y comparar los resultados con el gradiente s-opsina para establecer la validez de una disector de particular. Porque si no está seguro acerca de la ubicación de la señal del disector, puede resultar en una orientación incorrecta de la retina que va por defecto, afectan interpretación y recopilación de datos.

Un aspecto importante y a veces pasado por alto de Neurociencia retiniana es la orientación adecuada y el análisis de la retina de todo Monte aislada, ya sea la orientación de una retina en una cámara de grabación de electrofisiología o en una diapositiva histológica. Esto es particularmente importante para los estudios que implican la retina de ratón, que es actualmente el modelo más ampliamente utilizado para las investigaciones del sistema visual mamífero. Descubrimientos recientes revelan que la retina de ratón no es espacial uniforme pero tiene gradientes de densidad y tamaño de tipos de células retinianas funcionalmente distintas, como las células del ganglio de melanopsina, las de células ganglionares OFF-alfa de transitorias y opsins cono1,2 ,3,4,5. En consecuencia, el método utilizado para determinar la orientación de la retina puede afectar los resultados experimentales con células tipo o opsin distribuciones2,3,6, ajuste de dirección de dirección selectiva del ganglio las células7,8,9y los patrones topográficos de degeneración retiniana10,11,12,13,14 . De hecho, no informa cómo retiniana orientación se divulga puede provocar discrepancias en la literatura y la confusión cuando se intenta comparar los datos entre los estudios. Por lo tanto es vital que los investigadores informan el método para identificar la orientación de la retina por lo que pueden interpretarse exactamente los resultados de dichos estudios.
Orientación retiniana es identificado comúnmente por anotando la córnea dorsal, ventral, nasal o temporal antes de la enucleación ocular1,3,12,15,16,17 ,18,19 o por corte o monumentos, ojos profundos anatómicos como los músculos extraoculares6,7la coloración, el coroides fisuras20,21, o s-opsina gradiente2,3. Los músculos rectos se pueden utilizar para identificar la nasal dorsal, ventral y la retina temporal haciendo un corte profundo alivio que biseca el accesorio de el el recto superior, recto inferior, recto medial o músculo recto lateral, respectivamente. Sin embargo, para la mayoría de los experimentos, usando un músculo es suficiente para orientar la retina22. La fisura coroide, que es un remanente del desarrollo del ojo, puede verse como una línea horizontal tenue en la parte posterior del ojo. Cada extremo de esta línea termina en el polo temporal del mundo23o la nasal. Por último, expresión de s-opsina se distribuye asimétricamente a la retina ventral en ratones y anticuerpos s-opsina se pueden utilizar para revelar la retina ventral en immunohistochemical experimentos1.
Trabajo reciente de Stabio, et al. 22 demostró que superficial ocular tales como quemaduras corneales son un método menos confiable para orientar la retina en el espacio anatómico, muy probablemente debido a error humano y la variabilidad en la fabricación de la quemadura corneal cuando se utilizan temporal y medial ángulos palpebrales como puntos de referencia. En cambio, puntos de interés profundos, como el músculo recto superior, fisura coroide y el gradiente s-opsina, han demostrado ser más fiables y precisos puntos de referencia para orientar la retina22. Sin embargo, la identificación de estos puntos anatómicos requiere disección únicos pasos que se describen en detalle en la literatura. Así, el objetivo de este protocolo es proporcionar un tutorial completo sobre cómo usar el músculo recto superior, fisura coroide y gradiente s-opsina para identificar con precisión la orientación espacial de la retina de ratón. Además, hemos incluido una comparación de la efectividad de dos anticuerpos s-opsina, así como un protocolo de inmunohistoquímica s-opsina.
Un desafío adicional a los estudios de depender de la orientación exacta de retina es los grandes cortes alivio necesarios para aplanar la retina wholemount en una cámara de grabación, plato o diapositiva. Esto puede presentar desafíos para el análisis de lo que naturalmente es una estructura tridimensional cuando es reflejada como una estructura plana de dos dimensiones. Un programa llamado Retistruct24 puede utilizarse para devolver una retina plana wholemount a su estructura tridimensional antes de que los datos recogidos desde se analizaron. Así, una sección de este protocolo se dedica a destacar los pasos que son necesarios para utilizar el software de Retistruct para reconstruir la retina de ratón immunostained s-opsina. También hemos incluido una sección de protocolo para usar nuestro script personalizado de MATLAB, que fue desarrollado para rotar y orientar con precisión del ratón retinas con s-opsina.

<table><tbody><tr><td>0,1 m solución salina tamponada con fosfato</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P5244</td><td></td></tr><tr><td>Axioplan2 Microscopio epifluorescente</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Esmalte de uñas transparente</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Corning LSE Agitador orbital de baja velocidad</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS6780FP</td><td></td></tr><tr><td>Costar Placas de 24 pocillos con tratamiento TC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3524</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>Burro anti-Cabra Alexa 594</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>A11058</td><td></td></tr><tr><td>Burro anti-Conejo Alexa 594</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>A21207</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Normal Serum</td><td>Millipore</td><td>566460</td><td>Usar al 5.2% (52 &mu; L con 86 &mu; L de 20% Triton X-100 y 863 &mu; L de 0.1M PBS para 1 mL de solución de bloqueo)</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-s-opsin</td><td>Santa Cruz Biotechnologies&nbsp;</td><td>sc-14363</td><td>No disponible comercialmente a partir de 2017</td></tr><tr><td>Graefe Pinzas curvas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ o FIJI</td><td>National Institute of Health</td><td>N/A</td><td>Software disponible</td></tr><tr><td>gratuitamente Cauterizador oftálmico de punta fina con cauterización de baja temperatura</td><td>Bovie Medical Corporation</td><td>AA00</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>N/A</td><td>Al menos versión 2007b o posterior</td></tr><tr><td>Micro Cover Glasses&nbsp;</td><td>VWR International</td><td>48393-241</td><td></td></tr><tr><td>Micro Bandejas Deslizantes</td><td>VWR International</td><td>82020-913</td><td></td></tr><tr><td>Moira Pinzas ultrafinas</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>11370-40</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de nitrocelulosa</td><td>Millipore</td><td>HAWP04700</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Microscopía Electrónica Ciencias</td><td>15714-S Uso</td><td>al 4% (25 &mu; L y 875 &mu; L de 0,1 M PBS para 1 mL de fijador)</td></tr><tr><td>Aguja PrecisionGlide 20G (0,90 mm x 25 mm)&nbsp;</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex Placa de Petri de vidrio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3160152</td><td></td></tr><tr><td></td><td>R El Proyecto R para la Computación Estadística</td><td>N/A</td><td>Software disponible gratuitamente; versión 3.4.3 o posterior</td></tr><tr><td>Conejo anti-s-opsina</td><td>Millipore</td><td>ABN1660</td><td></td></tr><tr><td>Retiga R3 Cámara microscópica</td><td>Qimaging</td><td>01-RET-R3-R-CLR-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Retistruct</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Software disponible gratuitamente&nbsp; compatible con Windows 7 o Windows 10</td></tr><tr><td>Shandon Aqua-Mount Slide Mounting Medios</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-390-5</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Uso 1.7% (86 &mu; L de 20% Triton-X con 52 &mu; L de Burro Suero Normal y 863 &mu; L de 0,1 M PBS para 1 mL de solución de bloqueo)</td></tr><tr><td>Tijeras de disección Vannas Spring&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio USB de 5MP Cámara digital</td><td>AmScope</td><td>MU500</td><td>Para usar con el microscopio de disección Olympus</td></tr></tbody></table>

donde usted cortar materias: una disección y guía de análisis para la orientación espacial de la retina de ratón de hitos ocular

Where You Cut Matters: A Dissection and Analysis Guide for the Spatial Orientation of the Mouse Retina from Ocular Landmarks

Precisa y segura identificación de orientación espacial de la retina de ratón aislados es importante para muchos estudios en Neurociencia visual, incluyendo el análisis de densidad y gradientes de tamaño de tipos de células retinianas, el ajuste de dirección de dirección selectiva las células del ganglio y el examen de los patrones topográficos degeneración en algunas enfermedades de la retina. Sin embargo, hay muchos métodos diferentes de disección ocular divulgados en la literatura que se utilizan para identificar y etiquetar orientación retiniana en la retina de ratón. Mientras que el método de orientación utilizado en este tipo de estudios es a menudo pasado por alto, no informa cómo retiniana orientación está determinada puede provocar discrepancias en la literatura y la confusión cuando se intenta comparar los datos entre los estudios. Hitos oculares superficiales tales como quemaduras corneales son de uso general pero se han demostrado recientemente para ser menos confiables que más lugares de interés como los músculos rectos, la fisura de la coroide o el gradiente s-opsina. Aquí, ofrecemos a una guía completa para el uso de hitos profundos oculares para diseccionar con precisión y documentar la orientación espacial de una retina de ratón aislados. Hemos también comparó la efectividad de dos anticuerpos s-opsina e incluye un protocolo de inmunohistoquímica s-opsina. Porque la orientación de la retina según el gradiente s-opsina requiere reconstrucción retiniana con software Retistruct y rotación con código personalizado, hemos presentado los pasos importantes para usar tanto de estos programas. En general, el objetivo de este protocolo es proporcionar un conjunto de métodos para la orientación exacta de retina que es adaptable a protocolos experimentales más confiable y repetible. Un objetivo primordial de este trabajo es estandarizar métodos de retina orientación para futuros estudios.

Un solo corte alivio que biseca el músculo recto superior con precisión y fiabilidad identifica la retina dorsal (figura 1). La fisura coroide precisa y segura la retina nasal y temporal identifica con profundos alivio cortes a lo largo de la fisura coroide temporal y nasal (figura 2). En este ejemplo, un corte alivio también se ha en la retina dorsal con el fin de identificar el eje de la dorsal/ventral de la retina (figura 2D, flecha vertical). Los pasos de estos procesos aparecen con propósito de replicación por futuro disectores. Una combinación de la s-opsina inmunohistoquímica (Figura 3A y 3D), reconstrucción con software Retistruct (3B, 3E) y rotación exacta con un código personalizado de MATLAB (3C, 3F) permite la identificación de las mitades ventrales y dorsales de la retina, así como los polos nasal y temporales si se conoce si la retina de un ojo derecho o izquierdo (figura 3). También comparamos dos anticuerpos primarios utilizados s-opsina para efectividad en etiquetado conos s-opsina (figura 4A, D): tanto la cabra anticuerpo primario anti-s-opsina y los anticuerpos primarios anti-s-opsina efectivamente etiqueta conos de s-opsina (figura 4E) en el mismo ratón.
Cortes de alivio se identificaron en retinas de s-opsina immunostained reconstruido y sus ubicaciones se compararon con la orientación determinada por el gradiente s-opsina. Usando nuestro encargo MATLAB código retinas (ver Materiales suplementarios), precisa se gira para que la mayor concentración de s-opsina tinción está situada ventralmente, lo que coloca verdadero dorsal en 90 ° (para el recto superior), verdadero nasal en 0 ° (para nasal fisura coroide) y temporal a 180 ° (para la temporal fisura coroide). El valor de alivio cada ángulo de corte se determinó con la herramienta ángulo de ImageJ después retinas se gira según el gradiente s-opsina. Un ángulo promedio se calculó para cada alivio corte tipo y el valor promedio de cada tipo de corte para aliviar entonces se traza en un diagrama polar (figura 6). En promedio, los cortes de músculo de músculo recto superior identificaron el polo dorsal a 96,3 ± 4,3 ° (n = 11) (figura 6). La fisura coroide nasal identificado el polo nasal a 6,7 ± 5,8 ° y la temporal fisura coroide identificado el polo temporal a 172.0 ± 4,4 ° (n = 9; Figura 6).
<img alt="Análisis microscópico de la estructura ocular; efecto de quemadura dorsal; diagramas de neuroanatomía; datos de investigación." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: utilizando el músculo recto superior para identificar con precisión la retina dorsal de un ojo derecho. (A) un ejemplo de una quemadura córnea dorsal cerca de la frontera córneo-escleral con un rotulador de punta de cauterio (flecha blanca). Músculo recto superior también es visible en esta vista (flecha blanca). (B) un ejemplo de un conjunto de retina montado con un alivio de corte en la retina dorsal por bisecan el músculo recto superior. Flecha muestra el profundo alivio de corte hecho en la retina dorsal por bisecan el músculo recto superior. La retina se tiñe con anticuerpo primario cabra anti-s-opsina (véase Tabla de materiales) y anticuerpo secundario burro anti-cabra Alexa 594 (véase Tabla de materiales; excitación: 590 nm, emisión: 620 nm) (cyan). Retina fue fotografiada con un microscopio epifluorescente con un filtro rojo de Texas (595 nm). (C) A retina reconstruido en Retistruct y rota con un código personalizado de MATLAB (ver Materiales complementarios) con el recto superior músculo para aliviar el corte visible (flecha blanca). D: dorsal, V: ventral, T: temporal, N: nasal. Barras de escala = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig1large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Análisis del desarrollo ocular; quemadura dorsal y fisura coroides; imagen de microscopio; Diagrama anatómico." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: usando la fisura coroide para identificar con precisión los polos temporales y nasal de la retina de un ojo derecho. (A) un ejemplo de una quemadura córnea dorsal cerca de la frontera córneo-escleral con un rotulador de punta de cauterización. (B) la coroides fisura visible en la parte posterior del ojo en la esclera (flecha blanca). La quemadura córnea dorsal también es visible en esta vista, ubicado a unos 90° de la temporal fisura coroide. (C) la coroides fisura visible en la parte posterior del ojo en la esclerótica, viajando desde el nervio óptico hasta la frontera córneo-escleral. (D) una retina teñidas con cabra anti-s-opsina (véase Tabla de materiales) y anticuerpo secundario burro anti-cabra Alexa 594 (véase Tabla de materiales; excitación: 590 nm, emisión: 620 nm) (cyan) con cortes de fisura coroide (horizontal las flechas) y el alivio de la dorsal (flecha vertical). Retina fue fotografiada con un microscopio epifluorescente con un filtro rojo de Texas (595 nm). (E) una retina reconstruido en Retistruct y rota con un código personalizado de MATLAB (ver materiales complementarios) con el corte alivio dorsal y los fisura coroide nasal y temporal cortes visibles (flechas blancas). D: dorsal, V: ventral, T: temporal, N: nasal. Barras de escala = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig2large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Diagrama de mapeo de retina; análisis de retina derecha e izquierda; visualización girada y sin girar." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: utilizando el gradiente s-opsina para identificar todos los cuatro polos de la retina. (A) un ejemplo de una retina disección de un ojo derecho immunostained para etiquetar s-opsina y fotografiada con un microscopio epifluorescente con un filtro rojo de Texas (595 nm). Los cortes en esta retina son arbitrarios, puesto que la orientación topográfica es determinada por el gradiente s-opsina. (B) los resultados de la reconstrucción de la retina en el A con Retistruct. Observe que el gradiente s-opsina no está alineado correctamente, porque la retina no se ha ejecutado mediante el código MATLAB (ver Materiales complementarios). (C) los resultados de la retina en el A con el código personalizado de rotación. La retina ha sido girada para que la mayor concentración de s-opsina coloración se encuentra en la parte inferior e identificado como la retina ventral. Porque la retina es de un ojo derecho, el polo temporal está situado 90° en sentido antihorario desde el polo dorsal y el polo nasal está situado 90° en sentido horario desde el polo dorsal. Disecado (D) un ejemplo de una retina de un ojo izquierdo immunostained para etiquetar s-opsina y fotografiada con un filtro rojo de Texas (595 nm). Los cortes en esta retina son arbitrarios, puesto que la orientación topográfica es determinada por el gradiente s-opsina. (E) los resultados de la reconstrucción digital de la retina en D con Retistruct. Observe que el gradiente s-opsina no está alineado correctamente, porque la retina no ha sido girada por el código personalizado. (F) los resultados de la retina en D con el código personalizado de rotación. La retina ha sido girada para que la mayor concentración de s-opsina coloración se encuentra en la parte inferior e identificado como la retina ventral. Porque la retina es de un ojo izquierdo, el polo nasal está situado 90° en sentido antihorario desde el polo dorsal y el polo temporal está situado 90° en sentido horario desde el polo dorsal. D: dorsal, V: ventral, T: temporal, N: nasal. Barras de escala = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig3large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="imágenes de microscopio de inmunotinción anti-s-opsina de conejo de cabra; cortes transversales de histología; Tabla de datos" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4: comparación de dos anticuerpos primarios s-opsina en etiquetado conos s-opsina. (A) A retina teñidas con el anticuerpo primario de cabra anti-s-opsina (véase Tabla de materiales). (B) la otra retina del ratón mismo teñidos con anticuerpos primarios anti-s-opsina (véase Tabla de materiales). (C) A representante de la región (0.1 x 0.1 mm2) de una retina teñida con el anticuerpo primario de cabra anti-s-opsina. Imagen tomada en un microscopio epifluorescente con 40 aumentos. (D) una región representativa (0.1 x 0.1 mm2) de una retina teñidas con conejo anti-s-opsina (véase Tabla de materiales), una alternativa de anticuerpo primario. Imagen fue tomada en un microscopio epifluorescente con 40 aumentos. (E) ambos anticuerpos etiqueta el mismo número de segmentos exteriores cono s porque no hay ninguna diferencia significativa en el número de conos s immunopositive que están manchados por cabra anti-s-opsina y conejo anti-s-opsina en cualquiera de la retina probado excentricidades (n = 2; ANOVA con post hoc de Bonferroni prueba; p &gt; 0.05). Barras de escala = 1 mm (A-B); 25 μm (C-D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Análisis de equilibrio estático, diagrama de interfaz de software con datos de imágenes, que muestra la estructura y los resultados." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figura 5: una guía visual para utilizar el software de Retistruct para reconstruir retinas immunostained con s-opsina. (A) A retina abrió en Retistruct con el contorno visible y un "desgarro" agregó. Puntos de la "lágrima" se indican con flechas blancas superpuestas. Todos los cortes en esta retina son arbitrarios, como ninguna señal particular fue utilizado para marcar la orientación de retina durante la disección. Botones importantes están señaladas en rojo. (B) una retina con todos «lágrimas» añadido y la retina dorsal identificado con "D" en el borde de la retina. Observe que el botón de "Reconstruir la Retina" ahora es visible. Botones importantes están señaladas en rojo. (C) el proceso de reconstrucción de una retina. La trama de la polar de la retina reconstruida aparecerá a la derecha, mostrando que el alivio cortes en cian (flechas azules superpuestas para aclarar puntos de corte). (D) el resultado de ejecutar una retina a través de Retistruct. La retina wholemount original sigue siendo el de la izquierda y la retina reconstruida aparece a la derecha. Los cortes de alivio son visibles en cian (flechas blancas superpuestas para aclarar puntos de corte). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Gráfico radial que muestra las direcciones de los músculos oculares; recto superior, datos de fisuras coroideas (nasales, temporales)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig6.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> Figura 6: la fisura superior del músculo recto músculo y coroides puede utilizarse para orientar con precisión la retina de ratón. Un diagrama polar de los ángulos obtenidos de cualquier músculo recto superior para aliviar los cortes o cortes de fisura coroide en retinas que han sido reconstruidas con Retistruct. Cortes de alivio se identificaron en retinas de s-opsina immunostained reconstruido y sus ubicaciones se compararon con la ubicación del gradiente s-opsina. Usando el código MATLAB para girar con precisión las retinas para que la mayor concentración de s-opsina tinción está situado ventralmente, verdadero dorsal (90° para el recto superior), verdadero nasal (a 0° para la fisura coroide nasal) y cierto temporal (180° de coroides temporal fisura) se determinaron para cada retina. Se calculó el valor de cada ángulo de corte se determinó en ImageJ y un ángulo medio de relevar individuales para cada alivio corte tipo. Cortes de músculo de músculo recto superior identificaron el polo dorsal a 96,3 ± 4,3 ° (n = 11). La fisura coroide nasal identificado el polo nasal a 6,7 ± 5,8 ° y la temporal fisura coroide identificado el polo temporal a 172.0 ± 4,5 ° (n = 9). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Histórica profunda</td>
			<td>Localización de la quemadura corneal</td>
			<td>Poste de Retina identificado</td>
			<td>Aplicación experimental</td>
		</tr>
<tr>
<td>Recto superior</td>
			<td>Dorsal</td>
			<td>Dorsal</td>
			<td>Vivo o fijo</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fisura coroide nasal</td>
			<td>Dorsal</td>
			<td>Nasal</td>
			<td>Vivo o fijo</td>
		</tr>
<tr>
<td>Temporal fisura coroide</td>
			<td>Dorsal</td>
			<td>Temporal</td>
			<td>Vivo o fijo</td>
		</tr>
<tr>
<td>S-opsina gradiente</td>
			<td>Ninguno</td>
			<td>Dorsal, Ventral, Nasal, Temporal</td>
			<td>Fijo</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Hitos profundos, el polo de la retina se identifican, y si pueden ser utilizados para la aplicación de tejido vivo o fijo.

Este protocolo proporciona a una guía completa de disección y análisis para la utilización de hitos profundos oculares s-opsina immunohistochemistry, Retistruct y código personalizado a exactamente y confiablemente Oriente la retina de ratón aislados en el espacio anatómico.

Donde usted cortar materias: Una disección y guía de análisis para la orientación espacial de la Retina de ratón de hitos Ocular

Accurately and reliably identifying spatial orientation of the isolated mouse retina is important for many studies in visual neuroscience, including the ...

El propósito de este protocolo de disección es proporcionar una metodología estandarizada para el uso de puntos de referencia anatómicos oculares, como los músculos rectos, la fisura coroidea y el gradiente de S-opsina para la orientación topográfica de la retina del ratón. La principal ventaja de estas técnicas es que proporcionan una forma fiable de identificar con precisión los polos dorsal, ventral, nasal y temporal de la retina de un ratón aislado. Comience identificando un punto en la córnea dorsal cerca del borde de la esclerótica de la córnea y entre el canto nasal y temporal.Toque la córnea con un bolígrafo de cauterización caliente durante menos de un segundo para crear una marca de quemadura con fines de orientación. Repita para el segundo ojo. La presencia de la quemadura dorsal permite la identificación del músculo recto superior.Para la enucleación, use pinzas curvas para empujar suavemente el ojo fuera de su órbita y agarrar el globo desde abajo. Luego, levante lentamente el globo de su cuenca mientras lo mueve suavemente de izquierda a derecha hasta que el globo se libere de la cuenca. Transfiera el globo con los músculos rectos adjuntos a una placa de Petri que contenga medio de disección.Si trabaja con ambos ojos, asegúrese de llevar un registro de cuál ojo es el ojo izquierdo y cuál es el ojo derecho. Bajo el endoscopio de disección, localice visualmente la quemadura corneal dorsal e identifique el músculo recto superior con el que está asociada. Con unas tijeras de disección o una aguja de calibre 20, perfore la córnea en la marca de la quemadura.Luego, haz un corte de alivio profundo en el globo hacia el nervio óptico para dividir el músculo superior. Aquí se ve una retina aislada con este corte, y aquí se muestra una retina reconstruida con este corte. Use dos juegos de fórceps para comenzar a aislar la retina rasgando suavemente el orificio hecho con la punción hasta que parte de la retina quede expuesta.Luego, separe la retina de la esclerótica hasta que la esclerótica se haya extirpado por completo. Extirpar el iris, el cristalino, el vítreo y cualquier estructura restante hasta que la retina quede completamente aislada. La presencia de una quemadura dorsal permite identificar la fisura de la coroidea nasal y temporal.Si se trabaja con el ojo derecho, la fisura de la coroides nasal se encuentra a la derecha de la quemadura y la fisura de la coroidea temporal se encuentra a la izquierda de la quemadura. Esto es al revés de trabajar con el ojo izquierdo. Para usar el punto de referencia de la fisura coroidea para identificar la orientación de la retina, localice e identifique la fisura coroidea en la parte posterior del ojo.Oriente el globo de modo que la marca de quemadura dorsal se encuentre en el polo superior, como lo sería si el ojo todavía estuviera en el ratón. Luego, usa unas tijeras de disección o una aguja de calibre 20 para hacer una punción en el globo, primero donde se encuentra la quemadura dorsal. A continuación, haga un corte de alivio poco profundo hacia el nervio óptico donde se encuentra la quemadura corneal dorsal.A continuación, haz los siguientes dos cortes profundos de alivio hacia el nervio óptico. Una alineando las hojas de las tijeras de disección con la línea de fisura de la coroidea temporal en la parte posterior del ojo, y otra alineando las hojas de las tijeras de disección con la línea de la fisura de la coroidea nasal en la parte posterior del ojo. Estos cortes se muestran aquí en una retina aislada y reconstruida.Después de hacer estos cortes, use dos juegos de pinzas para arrancar suavemente los orificios de punción hasta que parte de la retina quede expuesta. Con unas tijeras de disección, haga cuatro cortes de alivio en la retina para que quede plana. Monte la retina, con las células ganglionares hacia arriba, sobre la membrana de nitrocelulosa presionando suavemente cada esquina de la retina sobre la membrana con pinzas.Luego, use fórceps para sumergir la retina montada en un mililitro de paraformaldehído al 4% contenido en el primer pocillo de una placa de 24 pocillos. Coloque la placa de 24 pocillos en un agitador orbital a temperatura ambiente y fije la retina durante exactamente 40 minutos. Después de la fijación, transfiera la retina al segundo pocillo de la placa, que se llena con un mililitro de PBS 0,1 molar y lave la retina durante 15 minutos a temperatura ambiente.Una vez finalizado el lavado, transfiera la retina montada al quinto pocillo que contenga un mililitro de solución de bloqueo e incube durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, agregue el anticuerpo primario anti-S-opsina de conejo a la solución de bloqueo a una concentración de uno a 500 e incube durante tres días a cuatro grados centígrados. Después de la incubación de tres días, lave el exceso de anticuerpo primario de la retina seis veces colocándolo secuencialmente en seis pocillos llenos de un mililitro de PBS durante 10 minutos cada uno a temperatura ambiente.A continuación, coloque la retina lavada en un pocillo con una solución bloqueadora fresca y añada el anticuerpo secundario anti-conejo Alexa 594. Incubar la retina con el anticuerpo secundario durante la noche a cuatro grados centígrados. Después de la incubación, lavar la retina en PBS seis veces, como antes.Con fórceps, transfiera la retina montada a una placa de Petri que contenga PBS. Libere la retina de la membrana de nitrocelulosa insertando suavemente las puntas de las pinzas entre la retina y la membrana hasta que la retina ya no esté unida. Sumerja un portaobjetos de microscopio de vidrio en el PBS y monte la retina en el portaobjetos flotando sobre el portaobjetos y pinchándolo suavemente con pinzas hasta que la retina se pegue al cristal.Cubra la retina del portaobjetos con un medio de montaje y coloque un cubreobjetos de 1,5. Coloque el portaobjetos en una bandeja y déjelo reposar a temperatura ambiente durante una hora. Después de una hora, coloque la bandeja deslizante a cuatro grados centígrados.Después de que el portaobjetos haya estado cubierto durante 24 horas, use esmalte de uñas para sellar los lados del portaobjetos y evitar que se desece. Este es un ejemplo de una retina aislada del ojo derecho que ha sido inmunoteñida para marcar S-opsina y se han obtenido imágenes con un microscopio de epifluorescencia. Es importante tener en cuenta que los cortes en esta retina son arbitrarios, ya que la orientación topográfica se puede identificar por el gradiente S-opsina.La imagen adquirida de la retina se puede reconstruir digitalmente con el software ReadiStruct. Los cortes originales son de pseudocolor rojo en esta imagen. Observe que el archivo de salida de este programa no alinea correctamente la retina.Una vez que la retina se ha pasado por el código de laboratorio personalizado, la retina se rota para que la concentración más alta de tinción de S-opsina se coloque en la parte inferior y se identifique como la retina ventral. Esta imagen muestra la retina de un ojo izquierdo. El polo temporal se encuentra a 90 grados en sentido contrario a las agujas del reloj desde el polo ventral y el polo nasal se encuentra a 90 grados en el sentido de las agujas del reloj desde el polo ventral.Una vez dominadas, estas técnicas de disección se pueden realizar con bastante rapidez en solo unos minutos si se realizan correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo orientar de manera precisa y confiable la retina del ratón utilizando el músculo recto superior, la fisura coroidea o el gradiente S-opsina como punto de referencia.

where-you-cut-matters-dissection-analysis-guide-for-spatial

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Una demostración formal de la disección de un ojo del ratón, lo que resulta en un montaje de todo el epitelio pigmentario de la retina.

Disección de un ojo del ratón de un monte entero del epitelio pigmentario de la retina

Source: Jagodzinska, J., et. al., Tomografía de Coherencia Óptica: Imágenes de las Células Gangliales de la Retina del Ratón In Vivo. J. Vis. Exp. (2017)  En este video, demostramos el uso de la tomografía de coherencia óptica de dominio espectral (SD-OCT) para obtener imágenes de las capas de la retina y evaluar los cambios estructurales en un modelo de ratón modificado genéticamente con neuropatía óptica.

Obtención de imágenes in vivo de la retina del ratón mediante tomografía de coherencia óptica

La eliminación de los ojos, también llamado enucleación, ofrece una estrategia útil para estudiar los aspectos de la visual, cross-modal, y la plasticidad del desarrollo a lo largo del sistema visual de mamíferos ya que induce irreversible parcial (monocular) o completa (binocular) pérdida de la visión. Aquí se describe un enfoque altamente reproducible y fácil de realizar en la enucleación vivo.

Un método altamente reproducible y fácil de Perform En Vivo Ocular enucleación en el ratón después de la abertura del ojo

Hemos desarrollado una preparación rebanada horizontal de la retina de mamíferos adultos con el plano de seccionamiento en paralelo a la superficie de la retina. campos dendríticas de las neuronas de la retina orientadas nonradially no fueron truncados, lo que permite el estudio de las técnicas de procesamiento de señales con patch-clamp y de imagen.

Preparación de cortes horizontales de ratón adulto Retina de Estudios electrofisiológicos

Este manuscrito describe un protocolo para la proyección de imagen en vivo de la retina de ratón con tomografía de coherencia óptica de alta resolución de dominio espectral (SD-OCT). Se centra en las células ganglionares de la retina (RGC) en la región de pepipapilar, con varios análisis y cuantificación de enfoques descritos.

Tomografía de coherencia óptica: Proyección de imagen de ratón ganglionares de la retina las células In Vivo

Este informe describe métodos completos para preparar secciones de retina de ratón congeladas para inmunohistoquímica (IHC).  Los métodos descritos incluyen disección de la copa ocular posterior, fijación de paraformaldehído, incrustación en la temperatura de corte óptima (OCT) orientación de medios y tejidos, seccionamiento e inmunomancha.

Preparación de criosecciones retinianas de ratón para inmunohistoquímica

Aquí, describimos el uso de la tomografía de coherencia óptica de dominio espectral (SD-OCT) para visualizar estructuras retinianas y oculares in vivo en modelos de degeneración retiniana, glaucoma, retinopatía diabética y miopía.

Evaluaciones estructurales in vivo de enfermedades oculares en modelos de roedores mediante tomografía de coherencia óptica

Aquí, describimos una técnica de imagen in vivo utilizando tomografía de coherencia óptica para facilitar el diagnóstico y la medición cuantitativa de la retinopatía en ratones.

Aplicación de la tomografía de coherencia óptica a un modelo de retinopatía en ratones

Este artículo presenta un protocolo para la microdisección ocular en roedores. El proceso implica la enucleación del globo ocular junto con la membrana nictitante (es decir, el tercer párpado). Esto es seguido por la separación de las copas oculares posterior y anterior.

Microdisección del ojo de roedor

El presente protocolo describe los pasos para alinear las imágenes de fibragrafía de tomografía de coherencia óptica en luz visible (vis-OCTF) in vivo con imágenes confocales ex vivo de la misma retina de ratón con el fin de verificar la morfología del haz de axones de las células ganglionares de la retina observada en las imágenes in vivo .

Alineación de figramas de tomografía de coherencia óptica en luz visible con imágenes confocales de la misma retina de ratón

La retina exhibe una organización espacial compleja a través de su estructura laminar. La transcriptómica espacial moderna y las técnicas de secuenciación requieren secciones de tejido &lt; 20 μm de grosor, lo que limita su aplicabilidad en la investigación de la retina. Este método de criosección recién congelada produce secciones delgadas en la cara de la retina del ratón al tiempo que preserva las relaciones espaciales planas, lo que permite un mapeo molecular completo a través de las...

En la cara Crioseccionamiento de retina de ratón para análisis molecular espacial de alta dimensión

Aprenda a orientar la retina de ratón mediante disección precisa utilizando hitos anatómicos oculares como músculos rectos, fisura coroidea y gradiente de S-opsina. Este protocolo estandarizado mejora la exactitud en estudios de neurociencia y oftalmología.

Donde usted cortar materias: Una disección y guía de análisis para la orientación espacial de la Retina de ratón de hitos Ocular (Video) | JoVE Journal

Donde usted cortar materias: Una disección y guía de análisis para la orientación espacial de la Retina de ratón de hitos Ocular

Explorar más videos