Donde usted cortar materias: Una disección y guía de análisis para la orientación espacial de la Retina de ratón de hitos Ocular

El propósito de este protocolo de disección es proporcionar una metodología estandarizada para el uso de puntos de referencia anatómicos oculares, como los músculos rectos, la fisura coroidea y el gradiente de S-opsina para la orientación topográfica de la retina del ratón. La principal ventaja de estas técnicas es que proporcionan una forma fiable de identificar con precisión los polos dorsal, ventral, nasal y temporal de la retina de un ratón aislado. Comience identificando un punto en la córnea dorsal cerca del borde de la esclerótica de la córnea y entre el canto nasal y temporal.

Toque la córnea con un bolígrafo de cauterización caliente durante menos de un segundo para crear una marca de quemadura con fines de orientación. Repita para el segundo ojo. La presencia de la quemadura dorsal permite la identificación del músculo recto superior.

Para la enucleación, use pinzas curvas para empujar suavemente el ojo fuera de su órbita y agarrar el globo desde abajo. Luego, levante lentamente el globo de su cuenca mientras lo mueve suavemente de izquierda a derecha hasta que el globo se libere de la cuenca. Transfiera el globo con los músculos rectos adjuntos a una placa de Petri que contenga medio de disección.

Si trabaja con ambos ojos, asegúrese de llevar un registro de cuál ojo es el ojo izquierdo y cuál es el ojo derecho. Bajo el endoscopio de disección, localice visualmente la quemadura corneal dorsal e identifique el músculo recto superior con el que está asociada. Con unas tijeras de disección o una aguja de calibre 20, perfore la córnea en la marca de la quemadura.

Luego, haz un corte de alivio profundo en el globo hacia el nervio óptico para dividir el músculo superior. Aquí se ve una retina aislada con este corte, y aquí se muestra una retina reconstruida con este corte. Use dos juegos de fórceps para comenzar a aislar la retina rasgando suavemente el orificio hecho con la punción hasta que parte de la retina quede expuesta.

Luego, separe la retina de la esclerótica hasta que la esclerótica se haya extirpado por completo. Extirpar el iris, el cristalino, el vítreo y cualquier estructura restante hasta que la retina quede completamente aislada. La presencia de una quemadura dorsal permite identificar la fisura de la coroidea nasal y temporal.

Si se trabaja con el ojo derecho, la fisura de la coroides nasal se encuentra a la derecha de la quemadura y la fisura de la coroidea temporal se encuentra a la izquierda de la quemadura. Esto es al revés de trabajar con el ojo izquierdo. Para usar el punto de referencia de la fisura coroidea para identificar la orientación de la retina, localice e identifique la fisura coroidea en la parte posterior del ojo.

Oriente el globo de modo que la marca de quemadura dorsal se encuentre en el polo superior, como lo sería si el ojo todavía estuviera en el ratón. Luego, usa unas tijeras de disección o una aguja de calibre 20 para hacer una punción en el globo, primero donde se encuentra la quemadura dorsal. A continuación, haga un corte de alivio poco profundo hacia el nervio óptico donde se encuentra la quemadura corneal dorsal.

A continuación, haz los siguientes dos cortes profundos de alivio hacia el nervio óptico. Una alineando las hojas de las tijeras de disección con la línea de fisura de la coroidea temporal en la parte posterior del ojo, y otra alineando las hojas de las tijeras de disección con la línea de la fisura de la coroidea nasal en la parte posterior del ojo. Estos cortes se muestran aquí en una retina aislada y reconstruida.

Después de hacer estos cortes, use dos juegos de pinzas para arrancar suavemente los orificios de punción hasta que parte de la retina quede expuesta. Con unas tijeras de disección, haga cuatro cortes de alivio en la retina para que quede plana. Monte la retina, con las células ganglionares hacia arriba, sobre la membrana de nitrocelulosa presionando suavemente cada esquina de la retina sobre la membrana con pinzas.

Luego, use fórceps para sumergir la retina montada en un mililitro de paraformaldehído al 4% contenido en el primer pocillo de una placa de 24 pocillos. Coloque la placa de 24 pocillos en un agitador orbital a temperatura ambiente y fije la retina durante exactamente 40 minutos. Después de la fijación, transfiera la retina al segundo pocillo de la placa, que se llena con un mililitro de PBS 0,1 molar y lave la retina durante 15 minutos a temperatura ambiente.

Una vez finalizado el lavado, transfiera la retina montada al quinto pocillo que contenga un mililitro de solución de bloqueo e incube durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, agregue el anticuerpo primario anti-S-opsina de conejo a la solución de bloqueo a una concentración de uno a 500 e incube durante tres días a cuatro grados centígrados. Después de la incubación de tres días, lave el exceso de anticuerpo primario de la retina seis veces colocándolo secuencialmente en seis pocillos llenos de un mililitro de PBS durante 10 minutos cada uno a temperatura ambiente.

A continuación, coloque la retina lavada en un pocillo con una solución bloqueadora fresca y añada el anticuerpo secundario anti-conejo Alexa 594. Incubar la retina con el anticuerpo secundario durante la noche a cuatro grados centígrados. Después de la incubación, lavar la retina en PBS seis veces, como antes.

Con fórceps, transfiera la retina montada a una placa de Petri que contenga PBS. Libere la retina de la membrana de nitrocelulosa insertando suavemente las puntas de las pinzas entre la retina y la membrana hasta que la retina ya no esté unida. Sumerja un portaobjetos de microscopio de vidrio en el PBS y monte la retina en el portaobjetos flotando sobre el portaobjetos y pinchándolo suavemente con pinzas hasta que la retina se pegue al cristal.

Cubra la retina del portaobjetos con un medio de montaje y coloque un cubreobjetos de 1,5. Coloque el portaobjetos en una bandeja y déjelo reposar a temperatura ambiente durante una hora. Después de una hora, coloque la bandeja deslizante a cuatro grados centígrados.

Después de que el portaobjetos haya estado cubierto durante 24 horas, use esmalte de uñas para sellar los lados del portaobjetos y evitar que se desece. Este es un ejemplo de una retina aislada del ojo derecho que ha sido inmunoteñida para marcar S-opsina y se han obtenido imágenes con un microscopio de epifluorescencia. Es importante tener en cuenta que los cortes en esta retina son arbitrarios, ya que la orientación topográfica se puede identificar por el gradiente S-opsina.

La imagen adquirida de la retina se puede reconstruir digitalmente con el software ReadiStruct. Los cortes originales son de pseudocolor rojo en esta imagen. Observe que el archivo de salida de este programa no alinea correctamente la retina.

Una vez que la retina se ha pasado por el código de laboratorio personalizado, la retina se rota para que la concentración más alta de tinción de S-opsina se coloque en la parte inferior y se identifique como la retina ventral. Esta imagen muestra la retina de un ojo izquierdo. El polo temporal se encuentra a 90 grados en sentido contrario a las agujas del reloj desde el polo ventral y el polo nasal se encuentra a 90 grados en el sentido de las agujas del reloj desde el polo ventral.

Una vez dominadas, estas técnicas de disección se pueden realizar con bastante rapidez en solo unos minutos si se realizan correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo orientar de manera precisa y confiable la retina del ratón utilizando el músculo recto superior, la fisura coroidea o el gradiente S-opsina como punto de referencia.