Frecuentes muestras de sangre de la punta de la cola en ratones para la evaluación de la secreción pulsátil de hormona luteinizante

El objetivo general de la toma frecuente de muestras de sangre en la punta de la cola es obtener muestras de sangre completa para la medición de la secreción pulsátil de la hormona luteinizante, conocida como LH, en ratones despiertos, no anestesiados y de comportamiento normal. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neuroendocrinología reproductiva al proporcionar un protocolo fiable para evaluar la secreción pulsátil de la hormona luteinizante en ratones. La principal ventaja de esta técnica es que la manipulación y la habituación frecuentes garantizarán mediciones sólidas y fiables del pulso de la hormona luteinizante después de tratamientos experimentales agudos o crónicos.

Durante las cinco semanas anteriores a la extracción de sangre, manipule a los ratones a diario de lunes a viernes. En las últimas dos semanas, manipule los ratones los sábados y domingos también. Realice el régimen de manejo del mouse en un gabinete de bioseguridad.

Saca el primer ratón de su jaula y colócalo en una superficie adecuada dentro del armario. Sujete suavemente al ratón sobre esta superficie sosteniendo la base de su cola. Luego, con la otra mano, acaricie firmemente la superficie ventral de la cola desde la base hasta la punta.

Haga esto un total de seis veces y luego devuelva el ratón a su jaula. Esto constituye un conjunto de manipulación. Ahora espere seis minutos y realice otra serie de manipulación.

Continuando con este patrón con intervalos entre conjuntos, realice cuatro conjuntos de control por sesión de control. En total, esto proporciona veinticuatro golpes de cola por sesión. Si los tratamientos experimentales durante el período de muestreo incluyen algún método de manipulación adicional, como el desaliño o una inyección intraperitoneal, también hay que aclimatar a los ratones a dicha actividad de manipulación durante las sesiones de manipulación.

Dos semanas antes del día previsto para la recolección de sangre, aloje a los ratones en parejas para minimizar su interrupción durante el período de muestreo. Para las recolecciones de sangre, prepare tubos de microcentrífuga de 0,6 mililitros para el almacenamiento de sangre. Etiquete los tubos y, para las recolecciones de sangre de tres microlitros, alícuota cincuenta y siete microlitros de tampón ACES en cada tubo.

Una vez preparados, guarde los tubos a cuatro grados centígrados. En el armario de bioseguridad tiene a mano los siguientes elementos: puntas de pipeta, un cubo de basura, un temporizador, un registro experimental, una cubitera que contiene los tubos de extracción de sangre, tijeras afiladas y estériles, un rotulador permanente y una gasa pequeña. Cuarenta y cinco minutos antes de comenzar la recolección de sangre, retire el primer ratón de su jaula y colóquelo sobre una superficie adecuada.

Luego marque la cola para identificar rápidamente a este ratón de su compañero de jaula. Ahora use unas tijeras para quitar uno o dos milímetros de la punta de la cola. Después de cortar esa cola, acaricie cuidadosamente la cola hasta que se forme una gota de sangre en la punta.

A continuación, recoge tres microlitros de sangre y desecha tanto la sangre como la punta en el cubo de basura. A continuación, asegúrese de que el flujo sanguíneo se haya detenido. Si es necesario, aplique una presión suave con una gasa estéril.

Luego regrese el ratón a su jaula durante seis minutos. Ahora, en intervalos de seis minutos durante cuarenta y cinco minutos, acaricie la cola con firmeza para tomar muestras de sangre adicionales del ratón. Si no se forma una gota de sangre, frote la cola con una gasa empapada en solución salina para ayudar a eliminar el coágulo de sangre.

Durante el período previo a la toma de muestras, deseche todas las alícuotas de sangre. Después de cuarenta y cinco minutos, comience el período de muestreo. Al tomar muestras, transfiera tres microlitros de sangre a un tubo de recolección, mezcle el tubo por inversión y vuelva a ponerlo en hielo.

Ahora proceda con el muestreo durante el tiempo que sea necesario. Una vez terminado, eutanasia a los ratones o asegúrese de que el flujo sanguíneo de su cola se haya detenido por completo y luego proporcione a los ratones una jaula limpia. A continuación, transfiera las muestras de sangre a una caja de almacenamiento y almacene las muestras a menos veinte grados centígrados hasta que puedan ser analizadas.

Se midió la hormona luteinizante o LH en muestras de sangre frecuentes para determinar la respuesta a un desafío de estrés psicosocial agudo. Se ovariectomizó a los ratones hembra adulta C57 negro seis y se recolectaron muestras de sangre durante noventa minutos para establecer una línea de base previa al tratamiento de la secreción pulsátil de LH. Para el tratamiento del estrés, durante el muestreo de noventa minutos, los animales de experimentación fueron colocados en dispositivos de restricción de roedores y trasladados a una nueva jaula, mientras que los controles permanecieron en sus jaulas domésticas y no fueron restringidos.

El análisis mostró que los animales de control tenían pulsos de LH claros e inequívocos durante todo el período de muestreo. Por el contrario, el estrés psicosocial de la restricción suprimió rápida e inequívocamente la secreción pulsátil de LH en el grupo experimental. Al prepararse para usar esta técnica, es importante recordar minimizar las perturbaciones ambientales, como el ruido o las interrupciones de otros investigadores, que podrían estresar a los ratones e interrumpir la secreción pulsátil de LH.

Desde su desarrollo por el Dr. Stein y otros en el laboratorio de Chen, esta técnica ha comenzado a allanar el camino para que los investigadores en el campo de la neuroendocrinología exploren la regulación del pulso de LH en una especie donde las herramientas moleculares y genéticas complejas son prácticas y están disponibles.