Frecuentes muestras de sangre de la punta de la cola en ratones para la evaluación de la secreción pulsátil de hormona luteinizante
4 de julio de 2018
Aquí presentamos un protocolo de muestreo de sangre de la punta de la cola para la recogida de muestras frecuentes en ratones sin restricciones. Este método es útil para evaluar patrones de secreción pulsátil de hormona luteinizante y podría ser adaptado para el análisis de otros factores de circulación.
El objetivo general de la toma frecuente de muestras de sangre en la punta de la cola es obtener muestras de sangre completa para la medición de la secreción pulsátil de la hormona luteinizante, conocida como LH, en ratones despiertos, no anestesiados y de comportamiento normal. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neuroendocrinología reproductiva al proporcionar un protocolo fiable para evaluar la secreción pulsátil de la hormona luteinizante en ratones. La principal ventaja de esta técnica es que la manipulación y la habituación frecuentes garantizarán mediciones sólidas y fiables del pulso de la hormona luteinizante después de tratamientos experimentales agudos o crónicos.
Durante las cinco semanas anteriores a la extracción de sangre, manipule a los ratones a diario de lunes a viernes. En las últimas dos semanas, manipule los ratones los sábados y domingos también. Realice el régimen de manejo del mouse en un gabinete de bioseguridad.
Saca el primer ratón de su jaula y colócalo en una superficie adecuada dentro del armario. Sujete suavemente al ratón sobre esta superficie sosteniendo la base de su cola. Luego, con la otra mano, acaricie firmemente la superficie ventral de la cola desde la base hasta la punta.
Haga esto un total de seis veces y luego devuelva el ratón a su jaula. Esto constituye un conjunto de manipulación. Ahora espere seis minutos y realice otra serie de manipulación.
Continuando con este patrón con intervalos entre conjuntos, realice cuatro conjuntos de control por sesión de control. En total, esto proporciona veinticuatro golpes de cola por sesión. Si los tratamientos experimentales durante el período de muestreo incluyen algún método de manipulación adicional, como el desaliño o una inyección intraperitoneal, también hay que aclimatar a los ratones a dicha actividad de manipulación durante las sesiones de manipulación.
Dos semanas antes del día previsto para la recolección de sangre, aloje a los ratones en parejas para minimizar su interrupción durante el período de muestreo. Para las recolecciones de sangre, prepare tubos de microcentrífuga de 0,6 mililitros para el almacenamiento de sangre. Etiquete los tubos y, para las recolecciones de sangre de tres microlitros, alícuota cincuenta y siete microlitros de tampón ACES en cada tubo.
Una vez preparados, guarde los tubos a cuatro grados centígrados. En el armario de bioseguridad tiene a mano los siguientes elementos: puntas de pipeta, un cubo de basura, un temporizador, un registro experimental, una cubitera que contiene los tubos de extracción de sangre, tijeras afiladas y estériles, un rotulador permanente y una gasa pequeña. Cuarenta y cinco minutos antes de comenzar la recolección de sangre, retire el primer ratón de su jaula y colóquelo sobre una superficie adecuada.
Luego marque la cola para identificar rápidamente a este ratón de su compañero de jaula. Ahora use unas tijeras para quitar uno o dos milímetros de la punta de la cola. Después de cortar esa cola, acaricie cuidadosamente la cola hasta que se forme una gota de sangre en la punta.
A continuación, recoge tres microlitros de sangre y desecha tanto la sangre como la punta en el cubo de basura. A continuación, asegúrese de que el flujo sanguíneo se haya detenido. Si es necesario, aplique una presión suave con una gasa estéril.
Luego regrese el ratón a su jaula durante seis minutos. Ahora, en intervalos de seis minutos durante cuarenta y cinco minutos, acaricie la cola con firmeza para tomar muestras de sangre adicionales del ratón. Si no se forma una gota de sangre, frote la cola con una gasa empapada en solución salina para ayudar a eliminar el coágulo de sangre.
Durante el período previo a la toma de muestras, deseche todas las alícuotas de sangre. Después de cuarenta y cinco minutos, comience el período de muestreo. Al tomar muestras, transfiera tres microlitros de sangre a un tubo de recolección, mezcle el tubo por inversión y vuelva a ponerlo en hielo.
Ahora proceda con el muestreo durante el tiempo que sea necesario. Una vez terminado, eutanasia a los ratones o asegúrese de que el flujo sanguíneo de su cola se haya detenido por completo y luego proporcione a los ratones una jaula limpia. A continuación, transfiera las muestras de sangre a una caja de almacenamiento y almacene las muestras a menos veinte grados centígrados hasta que puedan ser analizadas.
Se midió la hormona luteinizante o LH en muestras de sangre frecuentes para determinar la respuesta a un desafío de estrés psicosocial agudo. Se ovariectomizó a los ratones hembra adulta C57 negro seis y se recolectaron muestras de sangre durante noventa minutos para establecer una línea de base previa al tratamiento de la secreción pulsátil de LH. Para el tratamiento del estrés, durante el muestreo de noventa minutos, los animales de experimentación fueron colocados en dispositivos de restricción de roedores y trasladados a una nueva jaula, mientras que los controles permanecieron en sus jaulas domésticas y no fueron restringidos.
El análisis mostró que los animales de control tenían pulsos de LH claros e inequívocos durante todo el período de muestreo. Por el contrario, el estrés psicosocial de la restricción suprimió rápida e inequívocamente la secreción pulsátil de LH en el grupo experimental. Al prepararse para usar esta técnica, es importante recordar minimizar las perturbaciones ambientales, como el ruido o las interrupciones de otros investigadores, que podrían estresar a los ratones e interrumpir la secreción pulsátil de LH.
Desde su desarrollo por el Dr. Stein y otros en el laboratorio de Chen, esta técnica ha comenzado a allanar el camino para que los investigadores en el campo de la neuroendocrinología exploren la regulación del pulso de LH en una especie donde las herramientas moleculares y genéticas complejas son prácticas y están disponibles.
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Descripción general
Este estudio describe un protocolo de muestreo de sangre a partir de la punta de la cola para la obtención de muestras sanguíneas en ratones sin restricción, centrándose en la medición de la secreción pulsátil de la hormona luteinizante (LH). El método está diseñado para permitir evaluaciones confiables de la secreción pulsátil de LH, contribuyendo así a la investigación en neuroendocrinología reproductiva.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neuroendocrinología
- Biología reproductiva
- Comportamiento animal
Antecedentes
- La secreción pulsátil de la hormona luteinizante es fundamental en la fisiología reproductiva.
- Las técnicas confiables de muestreo sanguíneo son esenciales para medir con precisión las fluctuaciones hormonales.
- Los métodos existentes pueden no tener adecuadamente en cuenta los efectos del estrés en los animales.
- Este protocolo tiene como objetivo minimizar el estrés en los ratones durante la recolección de sangre.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un protocolo confiable de muestreo de sangre de la punta de la cola en ratones no restringidos.
- Evaluar la secreción pulsátil de LH en respuesta a tratamientos agudos y crónicos.
- Mejorar la precisión de los métodos de investigación neuroendocrinológica.
Métodos Utilizados
- El protocolo incluye el manejo diario y la habituación de los ratones antes de la recolección de sangre.
- Se utilizaron ratones hembras adultas C57BL/6, con recolección de sangre del extremo de la cola para la medición de LH.
- Sesiones frecuentes de manejo ayudaron a facilitar un entorno libre de estrés.
- Las muestras de sangre se recolectaron durante un período de tiempo establecido para determinar las concentraciones hormonales basales.
Resultados principales
- La técnica permitió la recolección exitosa de niveles de LH en animales control.
- El estrés psicosocial provocado por la restricción suprimió significativamente la secreción de LH en los grupos experimentales.
- El estrés minimizó las mediciones confiables de la secreción pulsátil de LH, destacando la eficacia del método.
- Se encontró que las perturbaciones ambientales afectan las mediciones hormonales.
Conclusiones
- Este estudio establece un nuevo método para obtener mediciones hormonales precisas en ratones.
- El protocolo permite a los investigadores explorar eficazmente la regulación de la LH en estudios de neuroendocrinología.
- Comprender el impacto del estrés en la secreción hormonal contribuye a una mayor comprensión de la fisiología reproductiva y el comportamiento animal.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El muestreo frecuente de sangre a partir de la punta de la cola en ratones permite una evaluación de alta resolución de la secreción pulsátil de la hormona luteinizante (LH), abordando una brecha crítica en la validación de dianas neuroendocrinas. Este enfoque fortalece la confianza predictiva en la exploración de vías mediadas por hormonas e informa las decisiones iniciales de cartera al proporcionar lecturas endocrinas cuantitativas y robustas. La capacidad del método para capturar patrones hormonales dinámicos en ratones con comportamiento libre mejora la continuidad traslacional desde la investigación básica hasta la preclínica.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite investigar las vías de señalización neuroendocrina mediante la medición directa de la secreción pulsátil de LH.
- Apoya la reducción de riesgos biológicos al distinguir las fluctuaciones hormonales fisiológicas de las inducidas por estrés.
- Proporciona datos funcionales de validación de dianas para programas de investigación reproductiva y neuroendocrina.
- Facilita la confianza predictiva en estudios mecanicistas de la regulación hormonal.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Prepara modelos animales validados para ensayos endocrinos y de neurobiología posteriores.
- Proporciona mediciones estandarizadas, reproducibles y cuantitativas de hormonas adecuadas para el desarrollo de ensayos.
- Permite el cribado de intervenciones experimentales que afectan la dinámica de secreción hormonal.
- Facilita la evaluación confiable de perturbaciones por compuestos o genéticas in vivo.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Se alinea con modelos relevantes para la enfermedad al estudiar la disregulación endocrina y las respuestas al estrés.
- Asegura la continuidad desde hallazgos en etapas de descubrimiento hasta la validación preclínica de intervenciones que modulan hormonas.
- Proporciona datos ajustados por riesgo para avanzar objetivos neuroendocrinos en la fase de desarrollo.
- Mejora la desviación predictiva de riesgos para el desarrollo de biomarcadores traslacionales.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la fase preclínica al permitir la medición dinámica de hormonas en modelos animales vivos, apoyando tanto estudios mecanicistas como investigaciones traslacionales.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías en sistemas neuroendocrinos.
- Selección: Proporciona lecturas cuantitativas y reproducibles de LH para evaluar la preparación del ensayo y la selección de intervenciones.
- Análisis: Ofrece datos hormonales con resolución temporal que permiten comparaciones estadísticas entre condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Conecta los hallazgos del descubrimiento con modelos preclínicos de función endocrina y respuesta al estrés.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para la evaluación dinámica de hormonas en múltiples programas de investigación.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos neuroendocrinos.
- Valor operativo: Estandariza la recolección de muestras hormonales, asegurando la reproducibilidad y escalabilidad entre estudios.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción del proyecto y la eficiencia del capital al proporcionar datos endocrinos cuantitativos y robustos.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de objetivos y tratamientos que modulan hormonas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de animales y en protocolos de muestreo neuroendocrino.
- Necesita acceso a ensayos hormonales de alta sensibilidad y a una infraestructura analítica adecuada.
- Exige una estandarización rigurosa entre equipos para minimizar los factores estresantes ambientales y derivados del manejo.
- Es adaptable a diversos modelos de ratón, aunque puede requerir optimización del protocolo según la cepa o los puntos finales.
- Las limitaciones prácticas incluyen la necesidad de un período prolongado de aclimatación y un control cuidadoso del entorno para garantizar la integridad de los datos.
