Name: Frecuentes muestras de sangre de la punta de la cola en ratones para la evaluación de la secreción pulsátil de hormona luteinizante (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Aprende el protocolo de muestreo de sangre de la punta de la cola en ratones sin restricción para evaluar la secreción pulsátil de hormona luteinizante. Este método minimiza el estrés y mejora la precisión en estudios de neuroendocrinología reproductiva.

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Los autores agradecen a los Drs. Jennifer Yang y Kauffman Alexander (Sasha) para asistencia técnica con esta técnica así como numerosas discusiones útiles y críticas. Análisis de la hormona del suero fueron realizados por Yang et al., 2017 en la Universidad de Virginia centro de investigación en reproducción Ligand análisis y base de análisis, apoyado por Eunice Kennedy Shriver NIH/NICHD (NCTRI) Grant P50-HD28934.
Fuentes de apoyo a la investigación: R01 NICHD 86100 (KMB), RBM fue apoyado por T32 NICHD 007203.

El método descrito aquí está de acuerdo con el nacional institutos de Salud Animal Care y directrices de uso y han sido autorizados por el cuidado de Animal institucional y Comité de uso de la Universidad de California, San Diego.
1. aclimatación a la dirección
<ol><li>Procedimiento de control<ol>
<li>Ratón de lugar jaulas en el gabinete de seguridad de la biotecnología. Retire el primer ratón de la jaula y el lugar en una superficie adecuada (por ejemplo una tapa de la jaula limpia) en el gabinete de seguridad de la biotecnología.</li>
		<li>Frenar suavemente el mouse sobre la superficie de trabajo manteniendo la base de la cola con el dedo índice y pulgar de una mano. Luego, firmemente movimiento la cara ventral de la cola, desde la base hasta la punta de la cola, con el índice y el pulgar de la otra mano. Repetir esto 6 veces de caricias (es decir, 1 juego) y retomar el ratón de su jaula.</li>
		<li>Esperar 6 minutos y repita el paso 1.1.2. Nota: En total, paso 1.1.2 se repetirá 4 veces por ratón (es decir, 4 grupos de 6 golpes), para que cada ratón recibirán un total de 24 movimientos de la cola en cada día de manejo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>La frecuencia de manejo diario<ol>
<li>De cinco hasta dos semanas antes del día de colección de sangre prevista, manejar ratones como se describe en el paso 1.1, cinco días por semana (los ratones no se manejan en el sábado o el domingo hasta las últimas dos semanas de aclimatación).</li>
		<li>Si el tratamiento experimental durante el periodo de muestreo incluirá cualquier manejo adicional (e.g. scruffing o inyección intraperitoneal), aclimatarse a los ratones a esta actividad de manipulación durante cada sesión de tratamiento. Nota: Para la aclimatación a los procedimientos de inyección, utilizar una aguja blunted para realizar una inyección simulada.</li>
		<li>Durante las dos semanas antes del día de colección de sangre prevista, manejar ratones como se describe en 1.1, siete días por semana.</li>
		<li>Por lo menos dos semanas antes del día de colección de sangre prevista, casa ratones en pares para minimizar las interrupciones a los ratones durante el muestreo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparación de tubos de sangre
<ol><li>Preparar el tampón de ensayo LH ultrasensible en una botella de vidrio: albúmina de suero bovino 0,2% y 0.05% Tween-20 en PBS [0,2 g de KCl, 8 g de NaCl, 1,44 g de Na2HPO4 (anhidro), 0,24 g KH2PO4, agua ultrapura a 1 L, pH 7,4, filtro y autoclave] , almacenar a 4° C. 1 Nota: Volumen de tampón de ensayo LH ultrasensible para estar preparados puede calcularse basándose en el número de muestras y el volumen por ejemplo como se indica a continuación (2.2 y discusión)</li>
	<li>Preparar tubos (tubos de microcentrífuga de 0,6 mL) de sangre. Etiqueta de tubos y buffer de ensayo alícuota (57 μl de tampón por tubo; de nota, este volumen puede variar dependiendo del volumen de sangre recogida o la relación de la sangre en el búfer deseado). Tubos puede ser preparado días antes de la toma de muestras, almacenar a 4 ° C.</li>
</ol>3. sangre
<ol><li>Preparación de materiales de colección de sangre.<ol>
<li>Preparar el gabinete de seguridad para su uso y organizar los materiales en la campana o en un carrito cerca de: 10 μl de pipeta (set 3 μl o volumen de la colección de sangre deseado), las puntas de pipeta, cubo de basura para puntas de pipeta usadas, temporizador, impresión con el número de animales y muestra números ( Notas sobre problemas de muestreo o animales), cubo con tubos sangre, tijeras y gasas pequeñas (2 "x 2") de hielo. Nota: El "contar hasta" función de un temporizador de laboratorio es útil porque tiene una alarma audible que podría molestar a los ratones</li>
		<li>Utilice un marcador permanente para marcar la cola de cada ratón (cerca de la base) para ayudar en la identificación rápida del ratón correcto durante el muestreo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recorte de la preparación de la cola y la sangre de la colección.<ol>
<li>A 45 minutos antes del inicio de la colección de sangre, quite el primer ratón de su jaula y coloque sobre una superficie adecuada (una tapa de la jaula limpia funciona bien) dentro de la bioseguridad gabinete.</li>
		<li>Utilizar tijeras afiladas, estériles para eliminar 1-2 mm de la punta de la cola de ratón, siguiendo la preparación aséptica (es decir, frote con alcohol y betadine). Nota: Esto puede lograrse en animales despiertos con sujeción suave o bajo anestesia isoflurano.  Además, la analgesia puede ser proporcionada siguiendo las recomendaciones de la IACUC local.</li>
		<li>La cola del ratón del movimiento cuidadosamente como se describió anteriormente (1.1.2; son generalmente suficientes trazos 1-2) hasta la gota de sangre en la punta de la cola.</li>
		<li>Utilice una pipeta con una punta limpia para recoger 3 μl de sangre desde la punta de la cola y deseche la punta de la pipeta con sangre.</li>
		<li>Antes de regresar el ratón a su jaula, asegúrese de que ha detenido el flujo de sangre. Si es necesario, aplique una presión suave con gasa estéril.</li>
		<li>Repita los pasos 3.2.1 - 3.2.5 para todos los ratones. Pueden recoger muestras de sangre subsecuente por firmemente acariciando la cola del ratón hasta una gota de sangre en la punta de la cola. Nota: Si una gota de sangre no se forma después de trazos firmes, la cola puede ser secó con una gasa empapada en solución salina. Los coágulos tienen más probabilidades de forma durante el muestreo menos frecuente (es decir, > intervalos de 15 min). Una vez que se elimina el coágulo de la vena, puede continuar el muestreo.</li>
		<li>Seguir recoger 3 μl de sangre de cada ratón como descrito cada 6 minutos durante aproximadamente 45 minutos, durante este período de preparación de muestras de sangre antes. Deseche la punta de sangre y pipeta.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Muestra de sangre<ol>
<li>Recoger 3 μl de sangre desde la punta de la cola como se describió anteriormente. Tener precaución para asegurar que toda la muestra de 3 μl se tiene en la punta de la pipeta (sin burbujas o contaminación de la ropa de cama). Extraer la muestra de sangre en el buffer de ensayo en un tubo etiquetado. Mezclar por inversión y devolver el tubo en hielo.</li>
		<li>Antes de regresar el ratón a su jaula, asegúrese de que ha detenido el flujo de sangre. Si es necesario, aplique una presión suave con gasa estéril.</li>
		<li>Repita los pasos 3.3.1 - 3.3.2 para cada ratón, cada 6 minutos, durante el tiempo de muestreo predeterminado. Seguimiento de cada animal para detectar signos de sufrimiento (e.g. parcialmente cerrados párpados, posición jorobada [no causado por otro tratamiento] o falta de respuesta al tratamiento) y terminar el muestreo, si es necesario. Nota: Dificultades conductuales u otras complicaciones que requieren terminación de muestreo ocurren muy raramente en nuestro laboratorio.</li>
		<li>Si los animales no son sacrificados después de tomar muestras de sangre, asegúrese de que el flujo de sangre desde la punta de la cola se haya detenido completamente. Limpie cualquier sangre derramada desde el interior de cada animal jaula (o cambio jaulas) y volver a las jaulas de animales a la cremallera de la cubierta.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. procesamiento y análisis de la muestra
<ol><li>Almacenar las muestras de sangre a-20 ° C hasta su análisis. Nota: LH se evaluaron en muestras de sangre entera diluidas en tampon de ensayo; no hay separación de sueros o plasma es requerida antes de almacenamiento o análisis.</li>
	<li>Las muestras de sangre de análisis por ELISA ultrasensible como describen previamente1 e informe valores en ng/mL de sangre después de corrección por dilución del volumen de muestra en el tampón de ensayo.</li>
	<li>Identificar los pulsos de LH en el conjunto de datos. Calcular y comparar la amplitud de pulso promedio y frecuencia del pulso (o intervalo de inter-pulso) según corresponda para el conjunto de datos. Nota: Programas y criterios publicados13,14 ,15,16 para la detección de pulsos de LH están disponibles.</li>
</ol>

<ol><li>Steyn, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+methodology+for+and+assessment+of+pulsatile+luteinizing+hormone+secretion+in+juvenile+and+adult+male+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Development of a methodology for and assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion in juvenile and adult male mice.</a> Endocrinology. 154 (12), 4939-4945 (2013).</li>
<li>McArdle, C. A., Roberson, M. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMcArdle%2C+CA+%22Knobil+and+Neill%27s+Physiology+of+Reproduction%22">Knobil and Neill's Physiology of Reproduction</a>. Plant, T. M., Zeleznik, A. J. , (2015).</li>
<li>Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+sample+collection+in+small+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Blood sample collection in small laboratory animals.</a> Journal of Pharmacology and Pharmacotherapy. 1 (2), 87-93 (2010).</li>
<li>Steiner, R. A., Bremner, W. J., Clifton, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+luteinizing+hormone+pulse+frequency+and+amplitude+by+testosterone+in+the+adult+male+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Regulation of luteinizing hormone pulse frequency and amplitude by testosterone in the adult male rat.</a> Endocrinology. 111 (6), 2055-2061 (1982).</li>
<li>Moore, A. M., Prescott, M., Marshall, C. J., Yip, S. H., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+a+robust+arcuate+GABAergic+input+to+gonadotropin-releasing+hormone+neurons+in+a+model+of+polycystic+ovarian+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Enhancement of a robust arcuate GABAergic input to gonadotropin-releasing hormone neurons in a model of polycystic ovarian syndrome.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 112 (2), 596-601 (2015).</li>
<li>Czieselsky, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulse+and+Surge+Profiles+of+Luteinizing+Hormone+Secretion+in+the+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Pulse and Surge Profiles of Luteinizing Hormone Secretion in the Mouse.</a> Endocrinology. 157 (12), 4794-4802 (2016).</li>
<li>Campos, P., Herbison, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+activation+of+GnRH+neurons+reveals+minimal+requirements+for+pulsatile+luteinizing+hormone+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Optogenetic activation of GnRH neurons reveals minimal requirements for pulsatile luteinizing hormone secretion.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 111 (51), 18387-18392 (2014).</li>
<li>Yang, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+Psychosocial+Stress+Inhibits+LH+Pulsatility+and+Kiss1+Neuronal+Activation+in+Female+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Acute Psychosocial Stress Inhibits LH Pulsatility and Kiss1 Neuronal Activation in Female Mice.</a> Endocrinology. 158 (11), 3716-3723 (2017).</li>
<li>Clarkson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+the+hypothalamic+GnRH+pulse+generator+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Definition of the hypothalamic GnRH pulse generator in mice.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 114 (47), E10216-E10223 (2017).</li>
<li>Lewis, V. J., Thacker, W. L., Mitchell, S. H., Baer, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+technic+for+obtaining+blood+from+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">A new technic for obtaining blood from mice.</a> Laboratory Animal Science. 26 (2 Pt 1), 211-213 (1976).</li>
<li>Abatan, O. I., Welch, K. B., Nemzek, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+saphenous+venipuncture+and+modified+tail-clip+blood+collection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+of+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Evaluation of saphenous venipuncture and modified tail-clip blood collection in mice.</a> Journal of the American Association of Laboratory Animal Science. 47 (3), 8-15 (2008).</li>
<li>Durschlag, M., Wurbel, H., Stauffacher, M., Von Holst, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+blood+collection+in+the+laboratory+mouse+by+tail+incision--modification+of+an+old+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Repeated blood collection in the laboratory mouse by tail incision--modification of an old technique.</a> Physiology and Behavior. 60 (6), 1565-1568 (1996).</li>
<li>Goodman, R. L., Karsch, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsatile+secretion+of+luteinizing+hormone%3A+differential+suppression+by+ovarian+steroids%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Pulsatile secretion of luteinizing hormone: differential suppression by ovarian steroids.</a> Endocrinology. 107 (5), 1286-1290 (1980).</li>
<li>Clarke, I. J., Cummins, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+gonadotropin-releasing+hormone+pulse+frequency+associated+with+estrogen-induced+luteinizing+hormone+surges+in+ovariectomized+ewes%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Increased gonadotropin-releasing hormone pulse frequency associated with estrogen-induced luteinizing hormone surges in ovariectomized ewes.</a> Endocrinology. 116 (6), 2376-2383 (1985).</li>
<li>Vidal, A., Zhang, Q., Medigue, C., Fabre, S., Clement, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DynPeak%3A+an+algorithm+for+pulse+detection+and+frequency+analysis+in+hormonal+time+series%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">DynPeak: an algorithm for pulse detection and frequency analysis in hormonal time series.</a> PLoS One. 7 (7), e39001(2012).</li>
<li>Merriam, G. R., Wachter, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Algorithms+for+the+study+of+episodic+hormone+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Algorithms for the study of episodic hormone secretion.</a> American Journal of Physiology. 243 (4), E310-E318 (1982).</li>
<li>Xie, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Deletion+of+Ghrelin-O-Acyltransferase+on+the+Pulsatile+Release+of+Growth+Hormone+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Effect of Deletion of Ghrelin-O-Acyltransferase on the Pulsatile Release of Growth Hormone in Mice.</a> Journal of Neuroendocrinology. 27 (12), 872-886 (2015).</li>
<li>Koch, C. E., Leinweber, B., Drengberg, B. C., Blaum, C., Oster, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+circadian+rhythms+and+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Stress%22%5BJournal%5D)">Interaction between circadian rhythms and stress.</a> Neurobiology of Stress. 6, 57-67 (2017).</li>
<li>Tuli, J. S., Smith, J. A., Morton, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corticosterone%2C+adrenal+and+spleen+weight+in+mice+after+tail+bleeding%2C+and+its+effect+on+nearby+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animal%22%5BJournal%5D)">Corticosterone, adrenal and spleen weight in mice after tail bleeding, and its effect on nearby animals.</a> Laboratory Animal. 29 (1), 90-95 (1995).</li>
<li>United States Department of Agriculture. Animal Welfare Inspection Guide. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.aphis.usda.gov/animal_welfare/downloads/Animal-Care-Inspection-Guide.pdf">https://www.aphis.usda.gov/animal_welfare/downloads/Animal-Care-Inspection-Guide.pdf</a> (2017).</li>
<li>Steyn, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+method+for+the+determination+of+pulsatile+growth+hormone+secretion+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Development of a method for the determination of pulsatile growth hormone secretion in mice.</a> Endocrinology. 152 (8), 3165-3171 (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí se describe un protocolo para recogida de sangre frecuente de muestras de sangre entera cola de punta para la evaluación de la secreción pulsátil de LH en ratones. Este protocolo permite la recogida de muestras para la detección de cambios agudos en la secreción pulsátil de LH después de la exposición a estrés psicosocial y es adecuado para la evaluación de pulsos de LH bajo otras manipulaciones agudas o crónicas.
Un componente fundamental de este protocolo para lograr perfiles fiables y ...

Función de la gónada en mamíferos depende de la secreción de gonadotropinas, hormona luteinizante (LH) y folículo estimulante hormona de la glándula pituitaria. Las gonadotropinas son secretadas en un patrón pulsátil o surge en respuesta a la secreción hipotalámica de hormona liberadora de gonadotropina (GnRH). La síntesis y secreción de LH y FSH están reguladas a través de la acción endocrina, paracrina y autocrina de una variedad de moléculas GnRH hipotalámico, las hormonas esteroides gonadales y el sistema inhibina-activina-folistatina, así como una miríada de condiciones fisiológicas incluyendo balance de tensión y energía. 2
El patrón pulsátil de la LH en sangre surge de una descarga más bien abrupta de la LH en sangre periférica, seguida por aproximadamente exponencial eliminación. Importantes características del modelo incluyen la frecuencia de cada descarga de LH y la amplitud de la respuesta de la LH, que son dictadas, en parte, por la liberación de GnRH. debido a la dificultad en la recolección de sangre portal hipotalámico-hipofisario para la medición de GnRH pulsátil, el muestreo y la medición de la LH se utiliza como proxy para la regulación de GnRH del eje hipotalámico-pituitario-gonadal. Por lo tanto, información crítica está codificada en la frecuencia y amplitud de pulsos de LH, que no se puede determinar de una sola muestra.
Análisis de la secreción pulsátil de LH ha sido históricamente limitado a grandes mamíferos (seres humanos, primates y ovejas) debido a su volumen de sangre grande y tolerancia para la recogida de muestras de sangre frecuentes. En roedores, tomar muestras de sangre frecuentes se limitaba a la rata y través de la sonda permanente. 3 , 4 el relativamente bajo costo y la disponibilidad de la genética (por ejemplo, cre-lox, CRISPR) y manipulaciones de circuito neuronales complejas (e.g. optogenetics, chemogenetics) ratones un organismo modelo atractivo; sin embargo, obtención de muestras de sangre frecuentes y posterior análisis de las concentraciones de LH ha hasta recientemente, probado evasivos. Esta tarea monumental fue pionero por Steyn y compañeros de trabajo. 1 desde entonces, varios laboratorios han empezado a utilizar el análisis de LH ultra sensibles para evaluar la secreción pulsátil de LH en una variedad de paradigmas experimentales y tomar muestras de sangre frecuentes. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 cabe señalar que la búsqueda de un método práctico de recoger múltiples muestras de sangre de los ratones ha sido en curso por lo menos 40 años10 con múltiples mejoras a lo largo de la manera. 11 , 12
Evaluación de patrones de pulso de LH (es decir, frecuencia y amplitud) representa un refinamiento importante en la supervisión de la secreción de gonadotropina basal en este modelo animal genéticamente manejable. Tradicionalmente, las concentraciones de LH en ratones se determinan en una muestra de sangre solo. Una debilidad de las muestras de un solo punto es un conjunto de datos altamente variable porque las concentraciones de LH son naturalmente fluctuantes durante cada pulso. Otra debilidad es que las mediciones aisladas inherentemente perder información crítica por los patrones de secreción de pulsos de LH. Por lo tanto, un método para recoger muestras de sangre frecuente en comportarse libremente, ratones sin restricciones (excepto la dirección apacible durante el muestreo) proporcionará mayor información y ser útiles a muchos laboratorios de investigación de la regulación pulsátil de la hormona.
Aquí, describimos un protocolo para la recogida de frecuentes muestras de ratones despiertos, libre de la sangre (cada 6 minutos). Lo importante, incluimos una dirección Protocolo de aclimatación que permite detección sólida y continua de la secreción pulsátil de LH en muestras de sangre entera recogida durante un período de tiempo en el que pre- y post-evaluación un reto agudo puede ser determinado, como la respuesta al estrés psicosocial de inmovilización y sujeción. Un ensayo eficaz para determinar las concentraciones de LH de muestras de sangre entera se ha descrito anteriormente; 1 el presente Protocolo se centra en un método para la recolección de las muestras de sangre para la medición del pulso de LH.

<table><tbody><tr><td>Gabinete de bioseguridad</td><td>Lab Products Inc</td><td>L/F-B</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma</td><td>A5403</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 (anhidro)</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Agua ultrapura</td><td>Millipore</td><td></td><td>Agua purificada y filtrada</td></tr><tr><td>Dispositivo de contención de roedores Broome</td><td>Harvard Apparatus</td><td>52-0460</td><td>No es necesario para la recolección de sangre, pero se utilizaron en la recolección de datos representativos.</td></tr><tr><td>DynPeak</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001</td></tr></tbody></table>

frecuentes muestras de sangre de la punta de la cola en ratones para la evaluación de la secreción pulsátil de hormona luteinizante

Frequent Tail-tip Blood Sampling in Mice for the Assessment of Pulsatile Luteinizing Hormone Secretion

En muchos sistemas endocrinos, circulación factores u hormonas no son liberadas continuamente, pero son secretadas como un discreto impulso en respuesta a un factor de liberación. Muestreo de un solo punto las medidas es insuficiente para comprender el significado biológico del patrón secretor de hormonas pulsátiles bajo condiciones fisiológicas normales o en condiciones de desregulación. La hormona luteinizante (LH) es sintetizada por las células del gonadotrope pituitario anterior y secretada en forma pulsátil que requiere frecuente recolección de muestras de sangre para la evaluación del pulso. Esto no ha sido posible en los ratones hasta que recientemente, debido al desarrollo de un análisis de LH de alta sensibilidad y progreso en una técnica de frecuente recolección de muestras de bajo volumen, inicialmente descrita por Steyn y colegas. 1 aquí se describe un protocolo para la recogida de muestras frecuentes de sangre periférica de ratones con aclimatación de manejo suficiente para detectar la secreción pulsátil de LH. El actual protocolo de detalles de un período de aclimatación ampliada que permite la evaluación de pulsos sólidas y continuadas de LH durante varias horas. En este protocolo, la punta de la cola se recorta y se recoge la sangre de la cola con una pipeta de mano. Para la evaluación de la LH pulsátil en ratones gonadectomized, muestras seriales son recogidos cada 5-6 min. 90-180 minutos, la recolección de sangre y medición de robustos pulsos de LH se pueden lograr en ratones despiertos, comportarse libremente, dados el manejo adecuado aclimatación y el esfuerzo para minimizar los factores de estrés ambientales. Aclimatación suficiente puede lograrse dentro de 4-5 semanas antes de la recogida de sangre. Este protocolo destaca avances en la metodología para recolección de muestras de sangre para la evaluación de los patrones de secreción pulsátiles de LH durante varias horas en el ratón, un modelo animal de gran alcance de investigación neuroendocrina.

Representante patrones de pulso de LH de 4 ratones se muestran en la figura 1 (datos reimprimidos de Yang et al., 2017). LH se midió en muestras de sangre frecuentes para determinar la respuesta a un desafío de estrés psicosocial agudo. Ratones C57/Bl6 hembra adultos fueron ovariectomizadas y manejados como se detalla en el presente Protocolo para la recogida de sangre frecuentes. Se recolectaron muestras de sangre para los primeros 90 minutos en tod...

Aquí presentamos un protocolo de muestreo de sangre de la punta de la cola para la recogida de muestras frecuentes en ratones sin restricciones. Este método es útil para evaluar patrones de secreción pulsátil de hormona luteinizante y podría ser adaptado para el análisis de otros factores de circulación.

Frecuentes muestras de sangre de la punta de la cola en ratones para la evaluación de la secreción pulsátil de hormona luteinizante

In many endocrine systems, circulating factors or hormones are not released continuously, but are secreted as a discrete pulse in response to a releasing ...

El objetivo general de la toma frecuente de muestras de sangre en la punta de la cola es obtener muestras de sangre completa para la medición de la secreción pulsátil de la hormona luteinizante, conocida como LH, en ratones despiertos, no anestesiados y de comportamiento normal. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neuroendocrinología reproductiva al proporcionar un protocolo fiable para evaluar la secreción pulsátil de la hormona luteinizante en ratones. La principal ventaja de esta técnica es que la manipulación y la habituación frecuentes garantizarán mediciones sólidas y fiables del pulso de la hormona luteinizante después de tratamientos experimentales agudos o crónicos.Durante las cinco semanas anteriores a la extracción de sangre, manipule a los ratones a diario de lunes a viernes. En las últimas dos semanas, manipule los ratones los sábados y domingos también. Realice el régimen de manejo del mouse en un gabinete de bioseguridad.Saca el primer ratón de su jaula y colócalo en una superficie adecuada dentro del armario. Sujete suavemente al ratón sobre esta superficie sosteniendo la base de su cola. Luego, con la otra mano, acaricie firmemente la superficie ventral de la cola desde la base hasta la punta.Haga esto un total de seis veces y luego devuelva el ratón a su jaula. Esto constituye un conjunto de manipulación. Ahora espere seis minutos y realice otra serie de manipulación.Continuando con este patrón con intervalos entre conjuntos, realice cuatro conjuntos de control por sesión de control. En total, esto proporciona veinticuatro golpes de cola por sesión. Si los tratamientos experimentales durante el período de muestreo incluyen algún método de manipulación adicional, como el desaliño o una inyección intraperitoneal, también hay que aclimatar a los ratones a dicha actividad de manipulación durante las sesiones de manipulación.Dos semanas antes del día previsto para la recolección de sangre, aloje a los ratones en parejas para minimizar su interrupción durante el período de muestreo. Para las recolecciones de sangre, prepare tubos de microcentrífuga de 0,6 mililitros para el almacenamiento de sangre. Etiquete los tubos y, para las recolecciones de sangre de tres microlitros, alícuota cincuenta y siete microlitros de tampón ACES en cada tubo.Una vez preparados, guarde los tubos a cuatro grados centígrados. En el armario de bioseguridad tiene a mano los siguientes elementos: puntas de pipeta, un cubo de basura, un temporizador, un registro experimental, una cubitera que contiene los tubos de extracción de sangre, tijeras afiladas y estériles, un rotulador permanente y una gasa pequeña. Cuarenta y cinco minutos antes de comenzar la recolección de sangre, retire el primer ratón de su jaula y colóquelo sobre una superficie adecuada.Luego marque la cola para identificar rápidamente a este ratón de su compañero de jaula. Ahora use unas tijeras para quitar uno o dos milímetros de la punta de la cola. Después de cortar esa cola, acaricie cuidadosamente la cola hasta que se forme una gota de sangre en la punta.A continuación, recoge tres microlitros de sangre y desecha tanto la sangre como la punta en el cubo de basura. A continuación, asegúrese de que el flujo sanguíneo se haya detenido. Si es necesario, aplique una presión suave con una gasa estéril.Luego regrese el ratón a su jaula durante seis minutos. Ahora, en intervalos de seis minutos durante cuarenta y cinco minutos, acaricie la cola con firmeza para tomar muestras de sangre adicionales del ratón. Si no se forma una gota de sangre, frote la cola con una gasa empapada en solución salina para ayudar a eliminar el coágulo de sangre.Durante el período previo a la toma de muestras, deseche todas las alícuotas de sangre. Después de cuarenta y cinco minutos, comience el período de muestreo. Al tomar muestras, transfiera tres microlitros de sangre a un tubo de recolección, mezcle el tubo por inversión y vuelva a ponerlo en hielo.Ahora proceda con el muestreo durante el tiempo que sea necesario. Una vez terminado, eutanasia a los ratones o asegúrese de que el flujo sanguíneo de su cola se haya detenido por completo y luego proporcione a los ratones una jaula limpia. A continuación, transfiera las muestras de sangre a una caja de almacenamiento y almacene las muestras a menos veinte grados centígrados hasta que puedan ser analizadas.Se midió la hormona luteinizante o LH en muestras de sangre frecuentes para determinar la respuesta a un desafío de estrés psicosocial agudo. Se ovariectomizó a los ratones hembra adulta C57 negro seis y se recolectaron muestras de sangre durante noventa minutos para establecer una línea de base previa al tratamiento de la secreción pulsátil de LH. Para el tratamiento del estrés, durante el muestreo de noventa minutos, los animales de experimentación fueron colocados en dispositivos de restricción de roedores y trasladados a una nueva jaula, mientras que los controles permanecieron en sus jaulas domésticas y no fueron restringidos.El análisis mostró que los animales de control tenían pulsos de LH claros e inequívocos durante todo el período de muestreo. Por el contrario, el estrés psicosocial de la restricción suprimió rápida e inequívocamente la secreción pulsátil de LH en el grupo experimental. Al prepararse para usar esta técnica, es importante recordar minimizar las perturbaciones ambientales, como el ruido o las interrupciones de otros investigadores, que podrían estresar a los ratones e interrumpir la secreción pulsátil de LH.Desde su desarrollo por el Dr. Stein y otros en el laboratorio de Chen, esta técnica ha comenzado a allanar el camino para que los investigadores en el campo de la neuroendocrinología exploren la regulación del pulso de LH en una especie donde las herramientas moleculares y genéticas complejas son prácticas y están disponibles.

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Frecuentes muestras de sangre de la punta de la cola en ratones para la evaluación de la secreción pulsátil de hormona luteinizante (Video) | JoVE Journal

Frecuentes muestras de sangre de la punta de la cola en ratones para la evaluación de la secreción pulsátil de hormona luteinizante

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