Producción y visualización de Esferoplastos bacterianos y protoplastos para caracterizar la localización de péptido antimicrobiano

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los péptidos antimicrobianos sobre si los péptidos se localizan o translocalizan a través de la membrana celular. El uso de esferoplastos y protoplastos permite la visualización y el análisis de la localización de péptidos en un sistema modelo fisiológicamente relevante sin los desafíos de resolución que se encuentran con las imágenes de células bacterianas. Aunque este método puede proporcionar información sobre los péptidos antimicrobianos, también se puede aplicar a otros agentes activos de membrana, como los péptidos que penetran en las células.

Los esferoplastos Gram-negativos de E. coli y los Protoplastos Gram-positivos de B. megaterium deben prepararse en una cabina de seguridad biológica o en una campana de flujo laminar utilizando una técnica estéril adecuada. Si se desea, las cepas bacterianas pueden contener un plásmido resistente a los antibióticos, y los esferoplastos y protoplastos se pueden preparar en una mesa de laboratorio abierta. En este vídeo, los esferoplastos y protoplastos se preparan en una mesa de laboratorio abierta utilizando cepas bacterianas resistentes a los antibióticos.

Para establecer un cultivo nocturno, use una punta de micropipeta estéril para transferir una sola colonia bacteriana de una placa de cultivo de agar sólido a un tubo de cultivo de 14 mililitros, que contiene de dos a tres mililitros de caldo de soja tripticasaso al tres por ciento, TSB, para una incubación de 16 a 21 horas a 37 grados centígrados con agitación. Para preparar esferoplastos de E. coli gramnegativos, diluya el cultivo durante la noche en una proporción de uno a 100 y 25 mililitros de TSB en un matraz de 250 mililitros, y devuelva las bacterias a la incubadora agitadora durante otras 2,5 horas. Cuando la solución haya alcanzado una densidad óptica de 0,5 a 0,8 a 600 nanómetros, diluir el cultivo en una proporción de uno a diez en TSB fresca en un matraz nuevo de 250 mililitros para una segunda incubación de 2,5 horas con una concentración efectiva final de 60 microgramos por mililitro de cefalexina.

Para producir filamentos unicelulares de aproximadamente 50 a 150 micrómetros de longitud, visualizados bajo un microscopio óptico con un aumento de 1000x. Centrifugar la solución bacteriana para recolectar los filamentos y decantar el sobrenadante. Lave los filamentos con la adición suave de un mililitro de sacarosa 0,8 molar, teniendo cuidado de no alterar el pellet.

Pasado un minuto desechar el sobrenadante sin alterar el pellet, y añadir los reactivos indicados en su orden respectivo a los filamentos. Después de diez minutos a temperatura ambiente, agregue gradualmente un mililitro de solución A durante un período de un minuto, mientras agita suavemente la solución con la mano. Incubar la solución durante cuatro minutos a temperatura ambiente, luego dividir la suspensión del filamento en dos alícuotas iguales entre dos tubos cónicos de 15 mililitros que contienen siete mililitros de solución de cuatro grados Celsius B. A continuación, granule los filamentos por centrifugación y use una pipeta asiriológica para eliminar cuidadosamente todos menos uno o dos mililitros del sobrenadante sin perturbar los gránulos.

Utilice una micropipeta p1000 para volver a suspender suavemente los pellets. Compruebe una pequeña alícuota de la muestra para detectar la formación de esferoplastos mediante microscopía óptica. El esferoplasto puede almacenarse a menos 20 grados centígrados durante un máximo de una semana o hasta que hayan pasado por tres ciclos de congelación y descongelación.

Para preparar protoplastos Gram-positivos de B. megaterium, diluir el cultivo bacteriano durante la noche en una proporción de uno a 1000 en 100 mililitros de TSB al tres por ciento en un matraz de 250 mililitros para una incubación de 4,5 horas a 37 grados Celsius con agitación. Cuando el cultivo líquido alcance una densidad óptica de 0,9 a 1,0 a 600 nanómetros, divida las bacterias en dos tubos cónicos de 50 mililitros para su centrifugación y use una pipeta asiriológica para asperar los sobrenadantes. Vuelva a suspender los gránulos en 2,5 mililitros de medio protoplast por tubo y tire de la suspensión en un solo tubo cónico para el cultivo en un matraz de 125 mililitros.

Agregue un mililitro de cinco miligramos por mililitro de lisozima al cultivo para una incubación de una hora a 37 grados Celsius con agitación. Monitorear el crecimiento del protoplasto bajo el microscopio óptico y anotar cualquier irregularidad, como bacterias que aparecen como bastones hinchados en lugar de esferas. Al final de la incubación, transfiera la suspensión a un tubo cónico de 15 mililitros para la centrifugación y vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de medio protoplasto.

El protoplasto puede almacenarse a menos 20 grados centígrados durante un máximo de una semana o hasta que hayan pasado por tres ciclos de congelación y descongelación. Para la visualización del esferoplasto o protoplasto, transfiera cinco microlitros de la suspensión de interés a un portaobjetos de vidrio recubierto de poli L lisina, seguidos de dos microlitros de péptido antimicrobiano o AMP etiquetados con fitc de 100 a 200 micromolares. Después de una incubación de tres minutos protegida de la luz, agregue un microlitro de un troquel de membrana apropiado a la muestra para otra incubación de tres minutos en la oscuridad.

Al final de la incubación, cubra el esferoplasto o protoplast etiquetado con un cubreobjetos de vidrio y selle el cubreobjetos con el esmalte de uñas. Para obtener imágenes de las células, encienda el microscopio confocal y el láser apropiado y seleccione el objetivo 63x, luego use el software de imagen apropiado para obtener imágenes compuestas de 8 bits de 512 por 512 pilas Z compuestas por cortes de 0,5 micrómetros de la totalidad de cada célula bacteriana de interés. Para visualizar la localización del AMP marcado con fluorescencia, abra las imágenes compuestas de la pila Z en un programa de análisis de imágenes adecuado y localice la porción más central del primer esferoplasto o protoplasto de interés.

Coloque una región circular de interés de 0,3 micrómetros de diámetro en la membrana, una en el centro de la célula y otra lejos de la célula para medir la fluorescencia de fondo, teniendo cuidado de evitar píxeles saturados. El software puede calcular la intensidad media de fluorescencia en cada región de interés. Los límites de resolución de los microscopios ópticos convencionales dificultan la distinción de si las señales peptídicas marcadas con fluorescencia surgen de la membrana o del espacio intracelular en las bacterias normales.

A medida que las señales se localizan en la membrana, parecerá superponerse con el espacio intracelular. Por el contrario, el aumento del tamaño del esferoplasto y del protoplasto en comparación con las bacterias normales da como resultado una clara resolución entre el marcador de membrana y el espacio intracelular. Facilitando la distinción de la localización de péptidos.

Por ejemplo, la localización en la membrana y la translocación a través de la membrana celular de un péptido marcado con fluorescencia se puede visualizar tanto en el esferoplasto de E. coli como en el protoplasto de B. megaterium, mediante microscopía de fluorescencia confocal, como se acaba de demostrar. La ubicación de las regiones de interés en la membrana y el espacio intracelular del esferoplasto o protoplasto y en el fondo, permite calcular la relación entre la intensidad de la fluorescencia del péptido intracelular y la intensidad de fluorescencia del péptido en la membrana de cada esferoplasto o protoplasto que interactúa con el AMP. Por ejemplo, este método se puede utilizar para visualizar las interacciones de un péptido microbiano mutante derivado de histonas con E. coli spheroplast y B. megaterium protoplasts.

En este experimento, el AMP demostró un patrón de localización similar en ambas cepas de bacterias. Destacando su translocación reducida en relación con el péptido de tipo salvaje. En última instancia, esta técnica permite a los investigadores explorar los patrones de localización de péptidos a nivel de una sola célula.

Ofrece información sobre el mecanismo de acción de un péptido de interés. Además de permitir a los investigadores recopilar un mayor número de imágenes para la caracterización sistemática de los mecanismos peptídicos, las imágenes de esferoplastos y protoplastos más grandes son más manejables para el análisis cuantitativo que las de células bacterianas más pequeñas.