Name: Producción y visualización de Esferoplastos bacterianos y protoplastos para caracterizar la localización de péptido antimicrobiano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Aprende a producir esferoplastos de E. coli y protoplastos de B. megaterium para visualizar la localización de péptidos antimicrobianos. Este método permite estudiar interacciones péptido-bacteria con mayor resolución.

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Investigación fue apoyada por el Instituto Nacional de alergias y enfermedades infecciosas (NIH-NIAID) Premio R15AI079685.

1. preparación de la solución
Nota: Preparar soluciones que se describe en los pasos 1.1 – 1.9 y 1.8, 1.11 para la producción de Esferoplastos de e. coli y B. megaterium protoplastos, respectivamente.
<ol><li>Preparar 1 M Tris-Cl, pH 7.8 disolviendo 10,34 g Tris HCl y 4,17 g de Tris OH en 50 mL de dH2O en un matraz de 125 mL. Esterilizar por filtración a través de un filtro de jeringa de 25 mm con una membrana μm 0.2 y guardar en un tubo cónico a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparar la solución A (20 mM MgCl2, 0.7 M sacarosa, 10 mM Tris-Cl, pH 7.8) disolver 0,10 g de MgCl2 (95.2 g/mol) y 11,98 g sacarosa (342.3 g/mol) en 25 mL dH2O en un matraz de mL 125. Añadir 500 μL 1 M Tris-Cl (pH 7.8) y ajustar el volumen a 50 mL. Esterilizar por filtración a través de un filtro de jeringa de 25 mm con una membrana μm 0.2 y guardar en un tubo cónico a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparar la solución B (10 mM de MgCl2, sacarosa de 0,8 M, 10 mM Tris-Cl, pH 7.8) disolviendo 0.05 g de MgCl2 (95.2 g/mol) y 13,69 g sacarosa (342.3 g/mol) en 25 mL dH2O en un matraz de mL 125. Añadir 500 μL 1 M Tris-Cl (pH 7.8) y ajustar el volumen a 50 mL. Esterilizar por filtración a través de un filtro de jeringa de 25 mm con una membrana μm 0.2 y guardar en un tubo cónico a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparar 0,8 M sacarosa sacarosa g 13,69 (342.3 g/mol) en 50 mL dH2O en un matraz 125 de mL de disolución. Esterilizar por filtración a través de un filtro de jeringa de 25 mm con una membrana μm 0.2 y guardar en un tubo cónico a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparar desoxirribonucleasa de 5 mg/mL me (DNasa I) disolviendo 0,015 g DNasa I en 3 mL de dH2O en un matraz de 50 mL. Esterilizar por filtración a través de un filtro de jeringa de 25 mm con una membrana μm 0.2. Solución de alícuota en tubos de microcentrífuga y almacenar a-20 ° C.</li>
	<li>Preparar 0,125 M ácido etilendiaminotetracético (EDTA), pH 8.0 mediante la disolución de EDTA disódico 0,698 g deshidratar (372.2 g/mol) en 15 mL dH2O en un matraz de 125 mL. Esterilizar por filtración a través de un filtro de jeringa de 25 mm con una membrana μm 0.2 y guardar en un tubo cónico a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparar 600 cefalexina μg/mL de disolución 0,03 g de hidrato de cefalexina (365.404 g/mol) en 50 mL de dH2O en un matraz de 125 mL. Esterilizar por filtración a través de un filtro de jeringa de 25 mm con una membrana μm 0.2 y guardar en un tubo cónico a 4 ° C.</li>
	<li>Preparar la lisozima 5 mg/mL lisozima 0,015 g en 3 mL de dH2O en un matraz de 50 mL de disolución. Esterilizar por filtración a través de un filtro de jeringa de 25 mm con una membrana μm 0.2. Solución de alícuota en tubos de microcentrífuga y almacenar a-20 ° C.</li>
	<li>Preparar 3% w/v caldo de soya tripticasa (TSB) disolviendo 30 g de TSB en 1 L de dH2O en un matraz de 2 L. Parte alícuota de la solución en frascos que contienen 25 mL o 100 mL TSB para ser utilizado en la preparación de e. coli esferoplastos o B. megaterium protoplastos, respectivamente. Frascos de autoclave para esterilizar el medio líquido. TSB estéril puede almacenarse a temperatura ambiente o a 4 ° C.</li>
	<li>Preparar la solución C (1 M sacarosa, maleato de 0,04 M, 0,04 M de MgCl2, pH 6,5) 34,23 g sacarosa (342.3 g/mol), 0,46 g ácido maleico (116.07 g/mol) y 0,38 g MgCl2 (95.21 g/mol) en 100 mL de dH2O en un matraz de 250 mL de disolución. Ajustar el pH a 6.5. Esterilizar por filtración a través de un filtro de jeringa de 25 mm con una membrana μm 0.2 y guardar en un tubo cónico a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparar medio de protoplasto de 200 mL por 100 mL 3% w/v TSB y 100 mL de solución C en una botella de vidrio de 1 L de mezcla. Autoclave para esterilizar la solución y almacenar a temperatura ambiente.</li>
</ol>2. preparación de la cultura durante la noche
Nota: Realice las secciones 2-4 utilizando técnicas estériles adecuadas. Si lo desea, una cepa bacteriana puede contener un plásmido de resistencia a los antibióticos reducir la contaminación potencial. Si se utiliza una cepa con resistencia a los antibióticos, añadir los antibióticos necesarios en los pasos 2.1, 3.1, 3.2 y 4.1-4.4.
<ol><li>Preparar una cultura de la noche a la mañana escogiendo una sola Colonia de bacterias utilizando una pipeta estéril y colocar en un tubo de cultivo de 14 mL con 2 – 3 mL de 3% w/v TSB. Incubar a 37 ° C, agitando de 16 a 21 h.</li>
</ol>3. preparación de bacterias Gram negativas e. coli Esferoplastos
<ol><li>En un matraz de 250 mL, diluir la cultura durante la noche 1: 100 en volumen de 25 mL de 3% w/v TSB e incubar la solución bacteriana a 37 ° C, agitando durante aproximadamente 2,5 horas hasta que la solución ha alcanzado una densidad óptica de 0.5 – 0.8 a 600 nm. Medir la densidad óptica usando un espectrofotómetro.</li>
	<li>En un matraz de 250 mL, diluir esta cultura 1:10 en 30 mL de 3% w/v TSB e incubar a 37 ° C, agitando durante 2,5 h en presencia de 60 cefalexina μg/mL (347.4 g/mol) para producir filamentos unicelulares de unos 50-150 μm de longitud , que son observables bajo 1.000 aumentos utilizando un microscopio de luz (figura 1B).</li>
	<li>Recoger los filamentos por centrifugación de la solución bacteriana a 1.500 x g, 4 ° C por 4 minutos, decantar y desechar el sobrenadante, el sedimento para realizar.</li>
	<li>Lave los filamentos suavemente añadir 1 mL de sacarosa de 0,8 M, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento. Incubar durante 1 min y luego descartar el sobrenadante sin perturbar el pellet.</li>
	<li>Añadir 150 μL de 1 M Tris-Cl (pH 7.8), 120 μl de lisozima de 5 mg/mL, 30 μl de 5 mg/mL de DNasa I y 120 μl de EDTA de 0,125 M en sus respectivos fin el perdigón e incubar la solución a temperatura ambiente durante 10 minutos.</li>
	<li>Añadir 1 mL de solución A poco a poco más de 1 minuto a la solución preparada en 3.5 utilizando una micropipeta mientras que suavemente girando a mano la solución. Incubar la solución durante 4 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Colocar 7 mL de solución B de 4 º C en dos tubos cónicos de 15 mL. Añadir cantidades iguales de la solución preparada en 3.6 a cada uno de estos dos tubos. Centrifugue la solución a 1.500 x g, 4 ° C por 4 minutos.</li>
	<li>Con una pipeta serológica, retire con cuidado todo pero 1–2 mL de sobrenadante sin perturbar el pellet. Resuspender el precipitado mediante pipeteo suavemente arriba y abajo utilizando una micropipeta P1000. Visualmente Compruebe formación de Esferoplastos, observando la muestra a 1.000 aumentos utilizando un microscopio de luz (figura 1).</li>
	<li>Almacenar los Esferoplastos a-20 ° C hasta una semana o hasta que han pasado por 3 ciclos de congelación y descongelación.</li>
</ol>4. preparación de protoplastos Gram-positiva B. megaterium
<ol><li>En un matraz de 250 mL, diluir la noche cultura 1:1,000 en 100 mL de 3% w/v TSB e incubar la solución bacteriana a 37 ° C, agitando para aproximadamente 4.5 h hasta que la solución ha alcanzado una densidad óptica de 0.9–1.0 a 600 nm. Medir la densidad óptica usando un espectrofotómetro.</li>
	<li>Vierta el cultivo líquido en dos tubos cónicos de 50 mL y centrifugar a 2.000 x g, 4 º C durante 10 minutos.</li>
	<li>Con una pipeta serológica, deseche el sobrenadante de los tubos cónicos. Resuspender cada precipitado en medio del protoplasto de 2,5 mL y combinar las soluciones resuspendidas en un solo tubo cónico. Pipetear la solución combinada de resuspendidos en un matraz de 125 mL.</li>
	<li>Añadir 1 mL de lisozima de 5 mg/mL e incubar 1 h a 37 ° C, agitando.</li>
	<li>Vigilar el crecimiento de protoplastos bajo 1.000 aumentos utilizando un microscopio de luz, tomando nota de cualquier irregularidad, tales como bacterias que aparecen como hinchadas barras en lugar de esferas (figura 2). Mediante una pipeta serológica, transferir la solución a un tubo cónico de 15 mL y centrifugar a 2.000 x g, 4 º C durante 10 minutos.</li>
	<li>Decantar el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento en medios del protoplasto de 5 mL. Almacenar protoplastos a-20 ° C hasta una semana o hasta que han pasado por 3 ciclos de congelación y descongelación.</li>
</ol>5. preparación de la solución del péptido y tinte de membrana para la proyección de imagen
<ol><li>
Solución de péptido
	<ol>
<li>En un tubo de microcentrífuga envuelto en papel de aluminio, disolver 2 mg de FITC etiquetado BF2 P11A en 800 μl de dH2O. uso un péptido que contiene al menos un residuo de triptófano para llevar a cabo las mediciones de concentración de proteína.</li>
		<li>Espectrofotómetro, medir la absorbancia de la solución del péptido a 280 nm por triplicado. Calcular la concentración de péptido utilizando el coeficiente de extinción molar para el triptófano (5.700/Mcm).</li>
		<li>Diluir la concentración de péptido en dH2O a una concentración final de 100 – 200 μm. Almacene en un tubo de microcentrífuga a-20 ° C envuelto en papel de aluminio para proteger de la luz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tinte de membrana
	<ol>
<li>En un tubo de microcentrífuga, preparar un stock de 10 mM de di-8-ANEPPS (592.9 g/mol) disolviendo 5 mg de di-8-ANEPPS en 843.3 μl de DMSO. Almacenar a 4 ° C envuelto en papel de aluminio para proteger de la luz.</li>
		<li>En un tubo de microcentrífuga, preparar 1 mL de 0,03 mM di-8-ANEPPS por agregar 3 μl de 10 mM di-8-ANEPPS a 997 de μl DMSO. Almacenar en un tubo de microcentrífuga a 4 ° C envuelto en papel de aluminio para proteger de la luz.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. visualización de Esferoplastos de e. coli y B. megaterium protoplastos usando microscopia Confocal
<ol><li>Pipeta de 5 μl de esferoplastos o protoplastos en un portaobjetos de vidrio recubiertos de poli-l-lisina. Añadir 2 μl de FITC etiquetado AMP (100-200 μm) a la diapositiva e incubar 3 minutos protegido de la luz.</li>
	<li>Añadir 1 μl de la membrana tinte di-8-ANEPPS (0,03 mM) a la diapositiva e incubar 3 minutos protegido de la luz. Cubrir con un cubreobjetos de vidrio y sellarlo con el esmalte de uñas.</li>
	<li>Encienda el láser confocal microscopio y argón. Ajustar el láser de argón a la salida de energía de 20% y 20% de transmisión.</li>
	<li>Establecer rangos de longitud de onda de emisión de 499-532 nm y 670-745 nm para el canal de emisión del péptido marcado con FITC y membrana di 8-ANEPPS-marcado con tinte emisión canal, respectivamente.</li>
	<li>Protoplastos de imagen o Esferoplastos (figura 1 y figura 2) con el objetivo X 63. Utilizar software tratamiento de imágenes para obtener 8 bits, imágenes de 512 x 512 compuesto z-stack compuesto de 0,5 μm rebanadas de la totalidad del spheroplast o protoplasto. Nota: Tomar consideración cuidadosa para reducir la emisión de repintado y protoplastos y Esferoplastos. Véase para más detalles.</li>
</ol>7. Caracterización de la localización de la AMP
<ol><li>Abre la imagen compuesta z-stack en software de imágenes. Localizar el centro más segmento del spheroplast o protoplasto y coloque una región circular de interés (ROI) (0,3 μm de diámetro) en la membrana (ROI 1) uno en el centro del spheroplast o protoplasto (ROI 2) y uno del spheroplast o protoplasto a medida la fluorescencia del fondo (ROI 3) (figura 5). Evitar la inclusión de píxeles saturados. La intensidad de fluorescencia en cada retorno de la inversión puede ser calculada por el software de imágenes. Nota: En casos cuando el péptido no localizar a la totalidad de la membrana, dibujar 1 retorno de la inversión en un área de la membrana donde se localiza el péptido.</li>
	<li>Utilice la siguiente ecuación para determinar la relación entre intensidad de fluorescencia intracelular del péptido a la intensidad de fluorescencia de péptido de membrana: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57904/57904eq1.jpg"> Nota: La intensidad de fluorescencia en retorno de la inversión 3 se resta de intensidades de fluorescencia en retorno de la inversión 2 y 1 de retorno de la inversión para explicar la fluorescencia de fondo.</li>
</ol>

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<li>Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+electrophysiology+for+the+study+of+bacterial+ion+channels+in+giant+spheroplasts+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli.</a> Biophys J. 111 (1), 132-139 (2016).</li>
<li>Xie, Y., Fleming, E., Chen, J. L., Elmore, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+proline+position+on+the+antimicrobial+mechanism+of+buforin+II%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Effect of proline position on the antimicrobial mechanism of buforin II.</a> Peptides. 32 (4), 677-682 (2011).</li>
<li>Kobayashi, S., Takeshima, K., Park, C. B., Kim, S. C., Matsuzaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+the+Novel+Antimicrobial+Peptide+Buforin+2+with+Lipid+Bilayers%3A+Proline+as+a+Translocation+Promoting+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Interactions of the Novel Antimicrobial Peptide Buforin 2 with Lipid Bilayers: Proline as a Translocation Promoting Factor.</a> Biochem. 39 (29), 8648-8654 (2000).</li>
<li>Decad, G. M., Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+Membrane+of+Gram-Negative+Bacteria+XII.+Molecular-Sieving+Function+of+Cell+Wall%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Outer Membrane of Gram-Negative Bacteria XII. Molecular-Sieving Function of Cell Wall.</a> J. Bacteriol. 128 (1), 325-336 (1976).</li>
<li>Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell%2C+real-time+detection+of+oxidative+stress+induced+in+Escherichia+coli+by+the+antimicrobial+peptide+CM15%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in Escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), E303-E310 (2015).</li>
<li>Yang, Z., Choi, H., Weisshaar, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melittin-Induced+Permeabilization%2C+Re-sealing%2C+and+Re-permeabilization+of+E.+coli+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Melittin-Induced Permeabilization, Re-sealing, and Re-permeabilization of E. coli Membranes.</a> Biophys J. 114 (2), 368-379 (2018).</li>
<li>Ruthe, H. J., Adler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+bacterial+spheroplasts+by+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Fusion of bacterial spheroplasts by electric fields.</a> Biochim. Biophys. Acta. 819 (1), (1985).</li>
</ol>

No se declaran conflictos de interés.

Los protocolos aquí presentados hacen posible para los investigadores a obtener más rápidamente más grandes tamaños de muestra de imágenes bacterianas porque las bacterias ampliadas, esféricas son mucho más fáciles de ubicar, orientar y la imagen. Esta mayor capacidad para recopilar datos es valiosa en varios aspectos. En primer lugar, permite un análisis cuantitativo más sistemático de los patrones de localización de péptido. Mientras las tendencias cualitativas pueden demostrarse de pequeñas series de imágenes, muestra...

Péptidos antimicrobianos (AMPs) han obtenido la atención debido a su uso potencial como alternativas a los antibióticos convencionales1,2,3,4,5. Amperios de matan bacterias por translocación a través de la membrana celular e interactuando con componentes intracelulares tales como ácidos nucleicos o por permeabilizing la membrana causando fugas de contenido de la célula6. Además de su uso como antibióticos, translocación amperios puede ser adaptado para solicitudes de entrega de medicamentos porque no disruptiva puede cruzar la membrana celular impermeable7,8. Por lo tanto, buscamos comprender los mecanismos fundamentales de la AMP de acción para sentar las bases para su uso en el diseño de fármacos.
La microscopia confocal ofrece una manera para determinar patrones de localización de fluorescencia etiquetadas amperios en células bacterianas proporcionando penetraciones en su mecanismo de acción9,10,11,12, 13 , 14. al etiquetado de la membrana de las bacterias, uno puede determinar si un péptido fluorescente etiquetado localiza a la membrana o en el espacio intracelular de una célula bacteriana. Sin embargo, esta técnica está limitada por el pequeño tamaño y barra de forma de bacterias, que puede hacer difícil debido a los límites de resolución de los microscopios de luz convencionales y la orientación variable de las bacterias en la diapositiva15la proyección de imagen.
El objetivo del método presentado es mejorar la visualización de los patrones de localización de péptido fluorescente etiquetado usando microscopia confocal. Visualización se ha mejorado el pequeños, finos, barra-formado Gram-negativos Escherichia coli (e. coli) y gram-positivas Bacillus megaterium (B. megaterium) bacterias en formas de agrandamiento, esféricas conocido como Esferoplastos (para las cepas Gram negativas) y protoplastos (para cepas Gram-positivas)16,17,18,19,20,21. Esferoplastos y protoplastos son más fáciles de imagen debido a su mayor tamaño y su forma simétrica, lo que hace irrelevante para la proyección de imagen de la orientación de una bacteria sobre un portaobjetos. Además, presentamos un enfoque sistemático para analizar cuantitativamente datos de microscopia confocal para caracterizar amperios como cualquier membrana de localización o translocación. Aplicación de estos métodos resulta más fácil distinguir marcada fluorescencia patrones de localización de péptido. Los protocolos aquí presentados pueden utilizarse para evaluar la localización de una variedad de agentes activos de membrana distintos amplificadores, incluyendo péptidos de penetración celular.
Una clara ventaja de esta técnica es que proporciona penetraciones en el mecanismo de acción de amp a nivel unicelular, que puede revelar la heterogeneidad celular de la célula15, frente a otros ensayos de fluorescencia se utiliza comúnmente para identificar la mecanismos de acción de amperios, que sólo proporcionan a granel estimaciones9,22,23,24,25. El uso de Esferoplastos y protoplastos para evaluar la entrada de amplificador celular es útil particular26 porque son más fisiológico relevantes15 que otros modelos utilizados para evaluar la entrada de la célula, como lípido vesículas24.

<table><tbody><tr><td>Hidrocloruro de Trizma (Tris HCl)</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Base de Trizma (Tris OH)</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Lisozima</td><td>Sigma</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>Desoxirribonucleasa I</td><td>Sigma</td><td>D4527</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético</td><td>Sigma 106361</td><td></td><td>utilizó Sigma 106361 en el desarrollo del protocolo original; 106361 descontinuado con ED2SS como reemplazo</td></tr><tr><td>Hidrato de cefalexina</td><td>Sigma</td><td>C4895</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760</td><td></td></tr><tr><td>BBL Caldo de soja tripticasa</td><td>Fisher Scientific</td><td>B11768</td><td></td></tr><tr><td>BF2 P11A FITC</td><td>NeoScientific</td><td>Pedido</td><td></td>a medida</tr><tr><td>di-8-ANEPPS</td><td>Biotium</td><td>61012</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>34869</td><td>Usado Sigma D8779 en el desarrollo del protocolo original; D8779 descontinuado con 34869 como reemplazo</td></tr><tr><td>Ácido maleico</td><td>Sigma</td><td>M0375</td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc 25 mm Filtro de jeringa con 0.2 &mu; m HT Tuffryn Membrane</td><td>Pall Corporation</td><td>4192</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal de barrido láser</td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS SP5 II</td><td>Para la adquisición de imágenes</td></tr><tr><td>Leica Application Suite, fluorescencia avanzada</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Para el procesamiento de imágenes</td></tr></tbody></table>

producción y visualización de esferoplastos bacterianos y protoplastos para caracterizar la localización de péptido antimicrobiano

Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization

Comúnmente, el uso de microscopia confocal como un método para determinar patrones de localización de péptidos dentro de las bacterias es inhibido por los límites de resolución de los microscopios de luz convencionales. Como la resolución de un microscopio dado no puede ser fácilmente mejorada, presentamos protocolos para transformar la pequeña barra-formado Gram-negativos Escherichia coli (e. coli) y gram-positivas Bacillus megaterium (B. megaterium) en formas esféricas más grandes, fácilmente reflejadas llaman esferoplastos o protoplastos. Esta transformación permite observadores a rápidamente y claramente determinar si péptidos se alojan en la membrana bacteriana (es decir, localización de membrana) o cruzan la membrana para entrar en la célula (es decir, translocación). Con este enfoque, también presentamos un método sistemático para caracterizar péptidos como membrana de localización o translocación. Si bien este método puede utilizarse para una variedad de péptidos activos de membrana y cepas bacterianas, demostramos la utilidad de este protocolo mediante la observación de la interacción de Buforin II P11A (BF2 P11A), un péptido antimicrobiano (AMP), con e. coli Esferoplastos y protoplastos B. megaterium .

Por ampliación de bacterias y haciéndolos esférico, fácilmente podemos distinguir péptidos localización a la membrana bacteriana o translocan fácilmente a través de la membrana bacteriana. Los límites de resolución de los microscopios de luz convencionales hacen difícil para distinguir si el péptido señal se presenta de la membrana o espacio intracelular de las bacterias normales porque aparecerán las señales localizadas en la membrana se superponen a la espacio intracelular (<strong clas...

Aquí presentamos un protocolo para producir Gram-negativos Escherichia coli (e. coli) Esferoplastos y gram-positivas Bacillus megaterium (B. megaterium) protoplastos claramente visualizar y caracterizar rápidamente interacciones de péptido-bacterias. Esto proporciona un método sistemático para definir la localización de la membrana translocación de péptidos.

Producción y visualización de Esferoplastos bacterianos y protoplastos para caracterizar la localización de péptido antimicrobiano

The use of confocal microscopy as a method to assess peptide localization patterns within bacteria is commonly inhibited by the resolution limits of ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los péptidos antimicrobianos sobre si los péptidos se localizan o translocalizan a través de la membrana celular. El uso de esferoplastos y protoplastos permite la visualización y el análisis de la localización de péptidos en un sistema modelo fisiológicamente relevante sin los desafíos de resolución que se encuentran con las imágenes de células bacterianas. Aunque este método puede proporcionar información sobre los péptidos antimicrobianos, también se puede aplicar a otros agentes activos de membrana, como los péptidos que penetran en las células.Los esferoplastos Gram-negativos de E. coli y los Protoplastos Gram-positivos de B. megaterium deben prepararse en una cabina de seguridad biológica o en una campana de flujo laminar utilizando una técnica estéril adecuada. Si se desea, las cepas bacterianas pueden contener un plásmido resistente a los antibióticos, y los esferoplastos y protoplastos se pueden preparar en una mesa de laboratorio abierta. En este vídeo, los esferoplastos y protoplastos se preparan en una mesa de laboratorio abierta utilizando cepas bacterianas resistentes a los antibióticos.Para establece

production-visualization-bacterial-spheroplasts-protoplasts-to

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Investigación

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Biología

Los métodos para purificar el colesterol unión toxina estreptolisina O de...

La visualización de las respuestas inducidas por toxinas bacterianas mediante microscopía de fluorescencia de células en vivo

Fuente: Figueroa, D. M., et.al. Producción y visualización de esferoplastos y protoplastos bacterianos para caracterizar la localización de péptidos antimicrobianos. J. Vis. Exp. (2018)Este video demuestra la producción de esferoplastos de Escherichia coli inhibiendo primero la división celular para inducir la filamentación, seguida de la digestión enzimática de la pared celular. El proceso incluye la adición controlada de un agente quelante, DNasa y un estabilizador osmótico para garantizar la...

Preparación de esferoplastos de E. coli

Fuente: Figueroa, D. M., et al. Producción y visualización de esferoplastos y protoplastos bacterianos para caracterizar la localización de péptidos antimicrobianos. J. Vis. Exp. (2018)Este video muestra un procedimiento paso a paso para generar protoplastos a partir de la bacteria grampositiva Bacillus megaterium.

Generación de protoplastos a partir de la bacteria grampositiva Bacillus megaterium

Fuente: Bratton, B. P., et al., Imagen tridimensional de células bacterianas para representaciones celulares precisas y localización precisa de proteínas. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demuestra el método para adquirir y analizar imágenes de fluorescencia tridimensionales de células bacterianas para estudiar la organización de proteínas a nivel de célula única.

Visualización de la distribución de proteínas bacterianas en tres dimensiones mediante imagen de fluorescencia

Fuente: Figueroa, D. et al. Producción y visualización de esferoplastos y protoplastos bacterianos para caracterizar la localización de péptidos antimicrobianos. J. Vis. Exp. (2018).Este vídeo muestra la preparación de esferoplastos a partir de bacterias gramnegativas en forma de varilla. Las bacterias se cultivan en presencia de un antibiótico para formar filamentos alargados. Estos se lavan con una solución hipertónica y se tratan con un tampón de lisis para eliminar la pared celular externa.

Generación de esferoplastos a partir de bacterias gramnegativas

El protocolo presenta la Escherichia coli-basado presión selectiva incorporación de aminoácidos no-canónico (ncAAs) el lactococcal péptidos antimicrobianos nisina. Sus propiedades pueden cambiarse durante la expresión recombinante mediante sustitución con ncAAs deseado en medios de crecimiento definido. Cambios resultantes en la bioactividad se asignan por ensayos de inhibición de crecimiento y microscopía de fluorescencia.

Péptidos antimicrobianos producidos por presión selectiva incorporación de aminoácidos no-canónico

Enfoques basados en proteína fluorescentes para monitorear efectores secretados por las bacterias en las células del huésped son desafiantes. Esto es debido a la incompatibilidad entre proteínas fluorescentes y el sistema de secreción tipo III. Aquí, un optimizado superfolder GFP sistema se utiliza para la visualización de efectores secretados por las bacterias en la célula de la planta huésped.

Sistema proteína verde fluorescente para visualizar efectores entregado de las bacterias durante una infección

Los antibióticos etiquetados fluorescentemente son herramientas poderosas que se pueden utilizar para estudiar múltiples aspectos de la resistencia a los antimicrobianos. Este artículo describe la preparación de antibióticos etiquetados fluorescentemente y su aplicación para estudiar la resistencia a los antibióticos en bacterias. Las sondas se pueden utilizar para estudiar mecanismos de resistencia bacteriana (por ejemplo, eflujo) por espectrofotometría, citometría de flujo y microscopía.

Visualización de la resistencia bacteriana mediante sondas fluorescentes antibióticas

El presente protocolo describe un método detallado para la producción bacteriana de proteínas recombinantes, incluidas proteínas típicamente insolubles o que contienen enlaces disulfuro, empaquetadas dentro de vesículas extracelulares unidas a la membrana. Esto tiene el potencial de aplicarse a áreas versátiles de la investigación científica, incluida la biotecnología aplicada y la medicina.

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Aquí, describimos un procedimiento que permite la detección de bacterias patógenas en todo el órgano durante la infección y la cuantificación de las actividades de los reporteros fluorescentes.

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Este protocolo describe un método para producir y evaluar la actividad antimicrobiana y la citotoxicidad del péptido catiónico Mel4 y el mímico del péptido RK758. Al integrar síntesis química, expresión recombinante y ensayos funcionales estandarizados, proporciona un flujo de trabajo optimizado para la producción y prueba de péptidos y mimetizadores de pequeñas moléculas.

Producción y pruebas de péptidos antimicrobianos y sus imitadores

Aprende a producir esferoplastos de E. coli y protoplastos de B. megaterium para visualizar la localización de péptidos antimicrobianos. Este método permite estudiar interacciones péptido-bacteria con mayor resolución.

Producción y visualización de Esferoplastos bacterianos y protoplastos para caracterizar la localización de péptido antimicrobiano (Video) | JoVE Journal

Producción y visualización de Esferoplastos bacterianos y protoplastos para caracterizar la localización de péptido antimicrobiano

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