Sistema proteína verde fluorescente para visualizar efectores entregado de las bacterias durante una infección

Enfoques basados en proteína fluorescentes para monitorear efectores secretados por las bacterias en las células del huésped son desafiantes. Esto es debido a la incompatibilidad entre proteínas fluorescentes y el sistema de secreción tipo III. Aquí, un optimizado superfolder GFP sistema se utiliza para la visualización de efectores secretados por las bacterias en la célula de la planta huésped.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la interacción planta-microbio, como por ejemplo, cómo las bacterias patógenas pueden alterar la condición óptima de sus células vegetales huésped mediante el uso de proteínas llamadas efectores secretadas en las células vegetales. La principal ventaja de esta técnica es que la proteína efectora bacteriana se expresa en la célula bacteriana utilizando su sistema de expresión nativo y luego se entrega a la célula vegetal a través del sistema de secreción bacteriana tipo III. Para comenzar este procedimiento, prepare las plantas Nicotiana benthamiana y Arabidopsis thaliana como se describe en el protocolo de texto.

A continuación, utilice la electroporación estándar para transformar el gen portador y efector del plásmido fusionado con la etiqueta sfGFP11 en la cepa CUCPB5500 de tomate patóvar Pseudomonas syringae. El punto de tiempo óptimo y el nivel de expresión, o reconstituir sfGFP, realmente depende de su proteína efectora. Recomendamos optimizar las condiciones de inoculación u observación.

Extienda suavemente las células bacterianas transformadas sobre la superficie de las placas de agar B de King's. A continuación, incubar las placas a 28 grados centígrados durante dos días. Después de esto, inocule una colonia bacteriana en un medio líquido King's B con un antibiótico apropiado para el vector.

Incubar durante la noche a 28 grados centígrados con agitación a 200 rpm. Al día siguiente, agregue glicerol esterilizado en autoclave al medio inoculado hasta una concentración final del 50%Almacene a menos 80 grados centígrados. Para comenzar, transforme el plásmido en células de la cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens como se describe en el protocolo de texto.

Cultive las células en medio LB Agar suplementado a 28 grados centígrados durante dos días. Usando una sola colonia del medio LB Agar, inocule 5 mililitros de medio LB líquido suplementado. Luego, haga crecer las células durante la noche a 28 grados centígrados agitando a 200 rpm.

Después de esto, centrifugar a 3000 G durante 10 minutos para recolectar las células. Vierta el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 1 mililitro de tampón de infiltración recién hecho. Usando un espectrofotómetro, determine la cantidad de células de Agrobacterium midiendo el valor de densidad óptica a una absorbancia de 600 nanómetros.

A continuación, utilice un tampón de infiltración para ajustar el OD 600 de las células bacterianas a 0,5. Deje el cultivo en una mecedora suave a temperatura ambiente durante una a cinco horas. Para infiltrar las hojas, use la punta de la pipeta de 10 microlitros para hacer un agujero en el centro de cada hoja.

Use una jeringa sin aguja de 1 mililitro para inyectar cuidadosamente 500 microlitros de la suspensión de Agrobacterium en el lado adaxial de la hoja. Limpie la suspensión bacteriana restante de las hojas y marque el límite de la región infiltrada. Mantenga las plantas infiltradas en una cámara de crecimiento a 25 grados centígrados y 60% de humedad durante dos días.

Escurre la cepa de Pseudomonas transformada del caldo de glicerol en el medio de agar King's B con el antibiótico adecuado. Incubar a 28 grados centígrados durante dos días. Inocular un asa de células de Pseudomonas en medio líquido de manitol glutamato.

Incubar el cultivo durante la noche a 28 grados centígrados con agitación a 200 rpm. Después de esto, centrifugar a 3000 G durante 10 minutos para recolectar las células. Vierta el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en una solución de cloruro de magnesio de 10 milimolares.

A continuación, ajuste la densidad óptica a 0,02 para las hojas de Nicotiana benthamiana y a 0,002 para las hojas de Arabidopsis. En el caso de las hojas de Nicotiana benthamiana, infiltre la suspensión de Pseudomonas en la misma zona en la que se infiltró la Agrobacterium dos días antes. Para la Arabidopsis transgénica, infiltre la suspensión de Pseudomonas en dos hojas de cuatro semanas de edad que crecieron en un día corto.

Finalmente, corte un disco de hojas para las hojas inoculadas con Pseudomonas. En puntos de tiempo específicos después de la infiltración de Pseudomonas, use un sistema de escaneo láser confocal para obtener imágenes de dos discos de hojas de dos centímetros cuadrados de una sola planta. Observe las células alejadas del orificio de infiltración para evitar las células muertas muertas por heridas.

Los efectores translocados de las bacterias están presentes solo en cantidades muy pequeñas. Por lo tanto, puede aumentar la potencia del láser y obtener una emisión de fluorescencia para detectar una señal fluorescente. Sin embargo, no domine demasiado para evitar capturar la señal falsa de la autofluorescencia de las células vegetales.

En este estudio, se utiliza un enfoque basado en proteínas fluorescentes para monitorear los efectores secretados por las bacterias en las células huésped. Aquí se muestra un escaneo láser confocal de una hoja de Nicotiana benthamiana tres horas después de la infección. Las células que expresan sfGFP optimizado solo con AvrB no muestran ninguna señal fluorescente.

Sin embargo, las señales de GFP se observan desde las células infectadas que contienen AvrB, sfGFP11. Esto verifica que el complejo AvrB sfGFP11 se reconstituye con sfGFP optimizado en el citosol y luego se transloca a la membrana plasmática. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener los materiales vegetales sanos y preparar el cultivo de bacterias frescas para las células activas.

Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos, como el análisis de sangre con resina, para comprender la falsa modificación de la traducción de las proteínas efectoras de las bacterias en las células vegetales durante las respuestas inmunitarias de las plantas. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo visualizar la administración de efectores de tipo III en células vegetales infectadas. Los materiales vegetales y los cultivos de bacterias deben desecharse siguiendo los criterios de su laboratorio para residuos biopeligrosos y no olvide usar su EPP.