Name: Sistema proteína verde fluorescente para visualizar efectores entregado de las bacterias durante una infección (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Aprende a visualizar efectores bacterianos en células vegetales mediante un sistema GFP superfolder optimizado. Este protocolo utiliza Nicotiana benthamiana y Arabidopsis thaliana para estudiar interacciones planta-patógeno.

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Esta investigación fue apoyada por el programa de investigación de ciencia básica a través de la nacional investigación Fundación de Corea (NRF) financiado por el Ministerio de ciencia, TIC y planificación futura (NRF-2018R1A2A1A05019892) para DC y por una beca del centro de crianza de planta Molecular ( PMBC) del siguiente generación Biogreen 21 programa de la dirección de Desarrollo Rural (PJ013201) a EP Agradecemos al centro de proyección de imagen del Centro Nacional de instrumentación para la gestión ambiental proporcionar un microscopio confocal para el rodaje.

Nota: Todas las medidas se realizan a temperatura ambiente, salvo estipulación en contrario.
1. preparación de materiales de planta (4 semanas)
<ol><li>Preparación de las plantas de N. benthamiana<ol>
<li>Sembrar 2 semillas de N. benthamiana de la superficie del suelo de cada maceta, cubrir la bandeja con una cúpula de plástico y permiten las semillas a germinar en un 25 ° C, 60% cámara de humedad con un ciclo de fotoperiodo de 16/8-h luz/oscuridad.</li>
		<li>Después de dos semanas, seleccionar y desechar la semilla más pequeña en cada maceta y continúan creciendo las plantas en las mismas condiciones de crecimiento como se aplica para la germinación en el paso 1.1.1. Añadir 1 L de agua por bandeja cada dos días. Nota: Las condiciones de crecimiento para las plantas pueden variar entre laboratorios. Por lo tanto, seguir el protocolo riego regular para hacer crecer la planta en condiciones sanas.</li>
		<li>En una semana, las plantas de transferencia a una nueva bandeja y organizar con suficiente espacio para seguir creciendo. Seguir creciendo las plantas en las condiciones descritas en el paso 1.1.1 hasta que están listos para ser infiltrado en 4 semanas de edad. Nota: El crecimiento de las plantas puede diferir dependiendo de las condiciones de crecimiento a través de laboratorios. Por lo general, encontramos que 4 semanas de edad las plantas de N. benthamiana llevan unas seis hojas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de las plantas transgénicas de a. thaliana<ol>
<li>Consulte la Tabla de materiales y ordenar las semillas transgénicas de Arabidopsis .</li>
		<li>Remoje las semillas de Arabidopsis transgénicas ~ 50-100 en 1 mL de agua destilada y almacenarlos a 4 ° C por 3 días en la oscuridad para sincronizar el inicio de la germinación.</li>
		<li>Sembrar semillas de ~ 2-3 en la superficie del suelo de una planta de charolas y cubrir la bandeja con una cúpula de plástico. Permitir que las semillas a germinar a 23 ° C, 60% de humedad con un ciclo de fotoperiodo de 10/14-h luz/oscuridad. Nota: Las semillas deben ser homozigotos. Sin embargo, se recomienda reconfirmar la presencia del transgen en el lote. En este caso, esterilizar las semillas por lavado con etanol al 70% por 2 min, 50% cloro (cerca de 2% de hipoclorito) conteniendo 0.05% Tritón X-100 para 5 minutos seguir lavando 5 - 6 veces con agua bidestilada estéril (ddH2O). Después de la esterilización, estratificar a 4 ° C por 3 días y placa en los medios de germinación de planta que contiene 25 μg/L de higromicina B para seleccionar las plantas transgénicas.</li>
		<li>Después de una semana, dejar sólo una planta por enchufe y seguir creciendo plantas bajo las mismas condiciones de crecimiento utilizadas para paso 1.2.3. Nota: Las plantas de cuatro semanas de edad fueron utilizadas para la infección de p. syringae . Plantas de agua cada día para mantener las plantas sanas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparación de cultivo de Pseudomonas (~ 1 semana)
<ol><li>Construcción del plásmido para la transformación de Pseudomonas<ol>
<li>Consulte la Tabla de materiales y la vector(s) deseada del efector T3SS-basado sistema vector25de la orden.</li>
		<li>Introduzca el gen efector de interés en el vector de la entrega de efector mediante recombinación específica del sitio clonación25. Nota: Al medirse la localización subcelular de la proteína efectora de larga duración, poner el gen integral en pBK-GW-1-2 o pBG-GW-1-2. También es posible elegir pBK-GW-1-4 o pBG-GW-1-4 que contiene 2 x sfGFP11 para aumentar la señal de fluorescencia. En el caso de un generador de efectos parcial que carecen de péptido señal, usar pBK-GW-2-2 o pBK-GW-2-4. Consulte Park et al. , para obtener información detallada acerca de vectores de entrega efectoras25.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transformar el plásmido lleva un generador de efectos fundido a la etiqueta sfGFP11 a p. syringae pv. Tomate (Pst) CUCPB5500 mediante electroporación estándar29. Nota: Otras cepas de Pseudomonas pueden utilizarse si es necesario. El sistema de etiqueta de sfGFP11 se construye para una amplia gama de vectores30 y la expresión génica de la efectora está reglamentada por el promotor de AvrRpm1, que es comparable con, por ejemplo, Pseudomonas fluorescens (EthAn)31.</li>
	<li>Las células bacterianas transformadas se separó suavemente sobre la superficie de las placas de agar del rey con B que contiene 100 rifampicina μg/mL y 25 kanamicina μg/mL o 25 μg/mL gentamicina. Incubar a 28 ° C durante 2 días.</li>
	<li>Inocular una colonia en medio líquido de la B del rey con los antibióticos apropiados para el vector utilizado y crecen las células durante la noche a 28 ° C con agitación a 200 rpm.</li>
	<li>Hacer un caldo glicerol. Añadir glicerol esterilizado a una concentración final de 50% y conservar a-80 ° C.</li>
</ol>3. transitoria expresión de sfGFP1-10 orientada a organeloOPT en N. benthamiana (4 días)
<ol><li>Preparación de cultivo de Agrobacterium<ol>
<li>Pedido el vector(s) deseado del organelo blanco sfGFP1 10OPT plasmid(s) (consulte la Tabla de materiales).</li>
		<li>Transformar el plasmid(s) en la cepa de Agrobacterium tumefaciens GV3101 células32. Crecen las células en medio de agar Luria-Bertani (LB) suplementado con 50 de μg/mL kanamicina y 50 rifampicina μg/mL a 28 ° C durante 2 días.</li>
		<li>De una sola Colonia en el medio de agar LB, inocular las células en 5 mL de medio LB líquido suplementado con 50 de μg/mL kanamicina y 50 rifampicina μg/mL. Crecen las células durante la noche a 28 ° C con agitación a 200 rpm.</li>
		<li>Cosecha de las células por centrifugación a 3.000 x g durante 10 minutos retirar el medio sobrenadante y resuspender el precipitado en 1 mL de recién hecho buffer de infiltración.</li>
		<li>Medir la cantidad de Agrobacterium obteniendo el valor de densidad óptica (OD) a una absorbancia de 600 nm (Abs 600 nm). Ajustar el OD600 de las bacterias a 0.5 con tampón de infiltración. Nota: 1 mL de la suspensión es suficiente para infiltrarse en dos puntos.</li>
		<li>Dejar la cultura a temperatura ambiente en un rockero suave de 1-5 h antes de la infiltración.</li>
		<li>Hágale un agujero en el centro de las hojas a ser infiltrado con la punta 10 μl. Utilice una jeringa sin aguja 1 mL para infiltrarse en las suspensiones de Agrobacterium . Cuidadosamente y lentamente inyecte unos 500 μl de las suspensiones preparadas a partir de paso 3.1.5 en el lado adaxial de la hoja a través de la jeringa. Repetir la infiltración en al menos tres diferentes plantas para repeticiones experimentales. Nota: Por razones de salud y seguridad, debe usar protección ocular durante la infiltración.</li>
		<li>Limpie el restante de la suspensión bacteriana en las hojas y marcar los límites de la región infiltrada.</li>
		<li>Mantener las plantas infiltradas en las mismas condiciones de crecimiento utilizadas para paso 1.1.1 para 2 días.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. la inoculación de Pseudomonas (4 días)
<ol><li>Estría la cepa de Pseudomonas transformada del stock de glicerol en el paso 2.5 de B agar los medios de comunicación King con los antibióticos apropiados a 28 ° C durante 2 días. Nota: La salud de Pseudomonas es muy crítica. Si las colonias no se forman bien, las células de la raya otra vez o propagar las células en medio líquido del rey antes de proceder.</li>
	<li>Inocular un asa llena de células de Pseudomonas en medio líquido manitol-glutamato (MG) a 28 ° C con agitación a 200 rpm para pasar la noche.</li>
	<li>Cosecha de las células por centrifugación a 3.000 x g durante 10 minutos retirar los medios sobrenadante, Resuspender el precipitado en 10 mM de MgCl2y ajuste OD600 a 0.02 (1 x 107 cfu/mL) para hojas de N. benthamiana y 0.002 (1 x 106 UFC/mL) de hojas de Arabidopsis .
</li>
	<li>Para el N. benthamiana, infiltrarse en la suspensión de Pseudomonas en el área de las hojas donde el Agrobacterium llevando 10 sfGFP1OPT construcción fue infiltrado 2 días antes (como en el paso 3.1.7). Para el sfGFP1-10OPT transgénicas de Arabidopsis, infiltrar la suspensión de Pseudomonas en hojas de crecido día cortas 4 semanas de edad de dos. Nota: para repeticiones experimentales se necesitan al menos tres plantas.</li>
</ol>5. observación de sfGFP señal a través de Microscopía Confocal (1 día)
<ol><li>Cortar los discos de hoja de Pseudomonas-inocular hojas. En momentos específicos después de la infiltración de Pseudomonas, imagen de dos discos de hoja de 2 cm2 de la planta utilizando un láser de barrido confocal sistema con 40 X / 1.2 objetivo de inmersión de agua NA C-Apochromat o 63 X / 0.8 NA C-Apochromat inmersión de aceite objetivo. Para evitar que las células muertas por heridas, observar las células del orificio de la infiltración.</li>
	<li>Comenzar la observación con un ajuste de baja potencia del laser de argón de 488 nm. Aumentar la potencia del láser para detectar sfGFP. Nota: Utilizamos generalmente 2-15% de la intensidad del láser para detectar la señal de fluorescencia. Sin embargo, la energía del laser y el ajuste de la detección deben ajustarse basándose en el sistema del usuario microscopia. Aquí, los filtros de emisión se establecieron en 520-550 nm. Las células muertas a menudo emiten auto fluorescencia bajo la excitación de 488 nm láser. Por lo tanto, como un control negativo, el mismo efector sin la etiqueta de sfGFP11 debe ser infiltrado y observado en las mismas condiciones de observación. Además, la excitación láser de alta puede inducir la autofluorescencia de la clorofila. Por lo tanto, regular la intensidad de láser utilizando las células de la planta de control para no inducir la autofluorescencia de la clorofila.<ol>
<li>Para una contratinción de la pared celular, infiltrarse en yoduro de propidio (PI) del 20 mM en el disco de hojas en 5-10 minutos antes de la observación.</li>
		<li>Para el núcleo de tinción, sumerja los discos de hoja de paraformaldehído al 0.1% por 5 min seguido por lavado con agua. Entonces, infiltrar 10 mM PI dentro del disco de hoja en 5-10 min antes de observación microscópica. Repetir los experimentos al menos tres veces. Nota: Este paso no es crítico pero útil para definir la localización de efector en la membrana del plasma o el núcleo. Si los efectores de interés demostraron su localización en un orgánulo específico, utilice un marcador para el orgánulo dado para confirmar la localización de la unidad de efectos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Nimchuk, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+fatty+acylation+drives+plasma+membrane+targeting+and+enhances+function+of+several+type+III+effector+proteins+from+Pseudomonas+syringae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic fatty acylation drives plasma membrane targeting and enhances function of several type III effector proteins from Pseudomonas syringae.</a> Cell. 101 (4), 353-363 (2000).</li>
<li>Gao, Z., Chung, E. H., Eitas, T. K., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+intracellular+innate+immune+receptor+Resistance+to+Pseudomonas+syringae+pv.+maculicola+1+%28RPM1%29+is+activated+at%2C+and+functions+on%2C+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Plant intracellular innate immune receptor Resistance to Pseudomonas syringae pv. maculicola 1 (RPM1) is activated at, and functions on, the plasma membrane.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (18), 7619-7624 (2011).</li>
<li>Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+scalable+strategy+for+high-throughput+GFP+tagging+of+endogenous+human+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (25), E3501-E3508 (2016).</li>
<li>Li, X., Yang, Q., Tu, H., Lim, Z., Pan, S. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+Agrobacterium-delivered+VirE2+in+recipient+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of Agrobacterium-delivered VirE2 in recipient cells.</a> Plant J. 77 (3), 487-495 (2014).</li>
<li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+approaches+to+investigate+effector+translocation+into+host+cells+in+the+Ustilago+maydis%2Fmaize+pathosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Experimental approaches to investigate effector translocation into host cells in the Ustilago maydis/maize pathosystem.</a> Eur J Cell Biol. 94 (7-9), 349-358 (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de interés divulgar.

El protocolo aquí descrito se utiliza para monitorear la localización exacta de las proteínas efectoras inyectadas por el T3SS bacteriana en la célula de planta huésped a la infección. Anteriormente, el sistema GFP de split fue utilizado como una herramienta para el estudio de la localización subcelular de las proteínas mamíferas23,36 salmonelas T3E localización y Agrobacterium VirE2 entrega a través de la T4SS en la planta células<sup class="xr...

Las plantas son organismos sésiles que encuentran numerosos patógenos invasores como bacterias, hongos, virus, insectos y nematodos en todo su ciclo de vida. Entre los fitopatógenos, las bacterias patógenas Gram negativas como Pseudomonas spp. y Ralstonia spp., infecta sus plantas hospederas ingresando a través de heridas o aberturas naturales como las estomas y los hidatodos1. Colonizar con éxito plantas huésped, patógenos bacterianos han evolucionado para desarrollar una variedad de factores de virulencia2. Cuando las bacterias invaden una planta del anfitrión, inyectan una serie de proteínas de virulencia — conocidas como efectores, directamente en las células de la planta para promover su patogenicidad. Estos efectores suprimen o modulan la inmunidad innata de la planta y manipulan los procesos celulares del anfitrión para dar lugar a supervivencia bacteriana3.
Bacterias patógenas principalmente usan un T3SS para proporcionar proteínas efectoras directamente a host células4. El T3SS se asemeja a una jeringa molecular con un canal de aguja-como conectar desde una estructura de la proteína del andamio en el interior y el exteriores membranas bacterianas para el sitio de la inyección del anfitrión célula5. Este mecanismo de secreción de T3SS mediada por efectores (T3E) está bien conservado en varios patógenos bacterianos Gram negativos de la planta como humano. Uno de los patógenos de plantas representativas, la p. syringae pv. Tomate DC3000 CCDH mutante, que tiene típicamente una T3SS defectuoso, ha restringido el crecimiento de las plantas probablemente debido a la incapacidad de este mutante para suprimir completamente la planta inmunidad (mediante la inyección de proteínas efectoras)6. Sobre desplazamiento en las células hospedadoras, efectores dirigidos a diversas proteínas del huésped que son importantes para el sistema de célula de host, incluyendo respuestas de defensa de la planta, transcripción genética, muerte celular, proteasoma, tráfico de vesículas y hormona vías7 , 8 , 9 , 10. por lo tanto, el seguimiento de la localización celular de las proteínas efectoras de las células hospedadoras es un objetivo atractivo para comprender sus funciones con respecto a la modulación de la inmunidad de la planta.
La mayoría de los estudios de localización de la T3Es ha empleado Agrobacterium-mediada por sobreexpresión de una proteína grande de la fluorescencia en el host planta9. Sin embargo, el método de expresión heteróloga de genes que se introducen en otras especies se ha demostrado para ser mal localizado o en ocasiones no funcional11,12,13. Además, varios estudios revelaron que efectores bacterianas sufren modificación para apuntar correctamente en el host células14,15,16,17. Por lo tanto, transitorio expresó efectores en el citosol de la planta las células no pueden ser funcionalmente o cuantitativamente idénticas a los efectores que son entregados por el T3SS al patógeno infección18. Por otra parte, la fusión de grandes etiquetas fluorescentes a proteínas efectoras puede interrumpir la efectora adecuada entrega y visualización18,19. Por lo tanto, estos enfoques para analizar la función T3E no pueden reflejar plenamente la localización nativa de los efectores secretados de T3SS.
Una proteína fluorescente verde (GFP) se compone de un cadena de 11 β-barril que encierra un filamento central que incluye un cromóforo20. Waldo et al. informó un sistema split-GFP novela que consta de un pequeño componente (GFP β strand 11; GFP11) y un gran fragmento complementario (GFP β el filamento 1-10; GFP1-10)21. Los fragmentos no es fluorescente por sí mismos pero es fluorescente sobre su autoasociación cuando ambos fragmentos están muy cerca entre sí. Para la optimización de la eficiencia de proteína plegable robustas plegables variantes de la GFP, es decir, sfGFP y sfGFPOPT, posteriormente fueron desarrollados para el split GFP sistema20,21,22. Recientemente, solo aminoácido mutado variantes de sfGFP1-10OPT- sfYFP1-10OPT y sfCFP1-10OPT- que puede reconstituir con un fragmento de sfGFP11 y mostrar fluorescencia de color amarillo y cian, respectivamente, fueron generados23 . Por otra parte, sfCherry, un derivado de mCherry, puede ser dividida en fragmentos de 10 sfCherry1 y sfCherry11 de la misma manera que sfGFP23.
Este sistema ha sido adaptado para etiquetar y rastrear los efectores T3SS en células HeLa durante la infección con los efectores de Salmonella24. Sin embargo, que fue previamente no optimizado para el sistema planta-bacteriano patógeno. Recientemente, hemos optimizado el sistema GFP de split basado en el sfGFP1-10 mejoradoOPT para monitorear la localización subcelular de la T3Es entregada de p. syringae en plantas células25. Para facilitar los estudios de localización de T3Es a diferentes compartimentos subcelulares en las células de la planta, un conjunto de transgénicas de Arabidopsis thaliana se generaron plantas para expresar sfGFP1-10OPT en los distintos compartimientos subcelulares 25. Además, la plásmidos llevan una variedad de organelas-destinados a la sfGFP1-10OPT Agrobacterium-sobreexpresión transitoria mediada y los vectores con etiquetas sfGFP11 para la entrega de la base de T3SS efectoras se generaron también. Las semillas de varias líneas transgénicas de Arabidopsis y la plásmidos expresar T3Es de interés pueden obtenerse de fuentes mencionadas en la Tabla de materiales26,27.
En el siguiente protocolo, describimos un sistema optimizado para monitorear la dinámica de los efectores por las bacterias en las células hospedadoras mediante el sistema de sfGFP de split. La infección de plantas que expresan sfGFP1-10OPT con transgénicos Pseudomonas llevando el plásmido recombinante sfGFP11 resulta en una entrega del efector tagged sfGFP11 de Pseudomonas en la célula huésped. En consecuencia, estas proteínas se reconstituyen y translocan a la compartment(s) objetivo de efectores específicos. La Pseudomonas syringae pv. tomate CUCPB5500 cepa en la que 18 efectores se eliminan, se utilizó debido a que esta cepa mostró baja o no la muerte celular en a. thaliana y N. benthamianas28. Sin embargo, todos los materiales y pasos que se describen aquí pueden ser reemplazados o modificados para adaptar el sistema de sfGFP División de investigación de otras cuestiones biológicas o de optimización en las condiciones de laboratorio dado.

<table><tbody><tr><td><líneas transgénicas de strong>Arabidopsis</td><td></td><td></td><td>Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Monitoreo espacio-temporal de efectores de Pseudomonas syringae a través de la secreción de tipo III utilizando fragmentos de proteínas fluorescentes divididos. Célula vegetal. 29 (7), 1571-1584 (2017)</td></tr><tr><td>CYTO-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69831</td><td></td></tr><tr><td>NU-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69832</td><td></td></tr><tr><td>PT-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69833</td><td></td></tr><tr><td>MT-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69834</td><td></td></tr><tr><td>PX-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69835</td><td></td></tr><tr><td>ER-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69836</td><td></td></tr><tr><td>GO-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69837</td><td></td></tr><tr><td>PM-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69838</td><td></td></tr><tr><td>Organelle-targeted sfGFP1-10OPT plásmido</td><td></td><td></td><td>Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Monitoreo espacio-temporal de efectores de Pseudomonas syringae a través de la secreción de tipo III utilizando fragmentos de proteínas fluorescentes divididos. Célula vegetal. 29 (7), 1571-1584 (2017)</td></tr><tr><td>CYTO-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97387</td><td></td></tr><tr><td>NU-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97388</td><td></td></tr><tr><td>PT-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97389</td><td></td></tr><tr><td>MT-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97390</td><td></td></tr><tr><td>PX-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97391</td><td></td></tr><tr><td>ER-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97392</td><td></td></tr><tr><td>GO-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97393</td><td></td></tr><tr><td>PM-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97394</td><td></td></tr><tr><td>ER-sfCherry1-10</td><td>Addgene</td><td>97403</td><td></td></tr><tr><td>ER-sfYFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97404</td><td></td></tr><tr><td>CYTO-sfCFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97405</td><td></td></tr><tr><td>sfGFP11 vector compatible compatible para el sistema de administración de efectores basado en T3SS</td><td>Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Monitoreo espacio-temporal de efectores de Pseudomonas syringae a través de la secreción de tipo III utilizando fragmentos de proteínas fluorescentes divididos. Célula vegetal. 29 (7), 1571-1584 (2017)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pBK-GW-1-2</td><td>Addgene</td><td>98250</td><td>pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistente a la kanamicina (25 ug/ml)</td></tr><tr><td>pBK-GW-1-4</td><td>Addgene</td><td>98251</td><td>pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistente a Kanamicina (25 ug/ml)</td></tr><tr><td>pBK-GW-2-2</td><td>Addgene</td><td>98252</td><td>pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistente a la kanamicina (25 ug/ml)</td></tr><tr><td>pBK-GW-2-4</td><td>Addgene</td><td>98253</td><td>pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistente a la kanamicina (25 ug/ml)</td></tr><tr><td>pBG-GW-1-2</td><td>Addgene</td><td>98254</td><td>pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistente a la gentamicina (25 ug/ml)</td></tr><tr><td>pBG-GW-1-4</td><td>Addgene</td><td>98255</td><td>pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistente a la gentamicina (25 ug/ml)</td></tr><tr><td>pBG-GW-2-2</td><td>Addgene</td><td>98256</td><td>pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistente a la gentamicina (25 ug/ml)</td></tr><tr><td>pBG-GW-2-4</td><td>Addgene</td><td>98257</td><td>pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistente a la gentamicina (25 ug/ml)</td></tr><tr><td><cepas bacterianas fuertes></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agrobacterium tumefaciens GV3101</td><td></td><td></td><td>Csaba Koncz y Jeff Schell, El promotor del gen 5 de TL-DNA controla la expresión específica del tejido de los genes quiméricos transportados por un nuevo tipo de vector binario Agrobacterium. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Resistente a gentamicina (50 ug/ml) y rifampicina (50 ug/ml)</td></tr><tr><td>Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500</td><td></td><td></td><td>Kvitko, B. H. et al. Las deleciones en el repertorio de los genes efectores de secreción de Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 tipo III revelan superposición funcional entre los efectores. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Resistente a la rifampicina (100 ug/ml)</td></tr><tr><td><fuerte>Componentes de los medios</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Medios de germinación de plantas</fuerte></td><td></td><td></td><td>Añadir 2.165g/L Murashige & Skoog en polvo, 10 g/L de sacarosa en agua. Ajustar a pH 5,8 y añadir 2,2 g/L de fitagel. Autocalve.</td></tr><tr><td>Murashige & Medio Skoog que incluye vitaminas</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M0222</td><td>Almacenar a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0809</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>LB media</fuerte></td><td></td><td></td><td>Añadir 10 g/L de triptona, 5 g/L de extracto de levadura, 10 g/L de NaCl al agua. Para medios sólidos, agregue 15 g / L de microagar. Autoclave.&nbsp; Deje que la solución se enfríe a 55 ° C, y agregue antibiótico si es necesario.</td></tr><tr><td>Triptona</td><td>BD Bioscience</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>BD Bioscience</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0520</td><td></td></tr><tr><td>Micro agar</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M1002</td><td></td></tr><tr><td>King's B media</td><td></td><td></td><td>10 g/L de peptona proteasa #2, 1,5 g/L de K2HPO4, 15 g/L de agar a agua. Autoclave. Enfriar hasta 55 &deg; C y añadir al medio 15 ml/L de glicerol estéril, 5 ml/L de MgSO4. Agregue antibióticos si es necesario.</td></tr><tr><td>Proteose peptona</td><td>BD Bioscience</td><td>212120</td><td></td></tr><tr><td>Anhidro K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1551128 USP</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>G1345</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Bioscience</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td><medio líquido fuerte>Manitol-Glutamato (MG) </fuerte></td><td></td><td></td><td>Añadir 10 g/L de manitol, 2 g/L de ácido L-glutámico, 0,5 g/L de KH2PO4, 0,2 g/L de NaCl y 0,2 g/L de MgSO4 al agua. Ajustar al pH 7</td></tr><tr><td>Manitol</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M0803</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-glutámico</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>G0707</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NIST200B</td><td></td></tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td> de infiltración <td>10 mM MES (ácido 2-(N-morfolino)-etano sulfónico), 10 mM MgCl2, 150 &micro; M acetosiriringa. pH 5,6; Prepare un tampón nuevo antes de usar.</td></tr><tr><td>MES</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M1503</td><td>Preparar 100 mM (pH 5,6) de caldo en agua. Filtro esterilizante.</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>Prepare 100 mM de caldo en agua. Autoclave.</td></tr><tr><td>Acetosiriringa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406</td><td>Prepare 150 mM de stock en DMSO.</td></tr><tr><td>Microscopio confocal equipos/materiales</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>710 sistema confocal de escaneo láser</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio observador Z1 microscopio invertido</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yoduro de propidio</td><td>ThermoFisher</td><td>P1304MP</td><td></td></tr></tbody></table>

sistema proteína verde fluorescente para visualizar efectores entregado de las bacterias durante una infección

Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection

Las bacterias, uno de los más importantes agentes causantes de varias enfermedades de planta, secretan una serie de proteínas efectoras dentro de la célula de la planta de host para subvertir el sistema de inmunológico de la planta. Durante la infección los efectores citoplásmicos se entregan al citosol anfitrión vía un tipo sistema de la secreción de III (T3SS). Después de la entrega en la célula de la planta, el effector(s) apunta a la compartment(s) específicos para modular los procesos de la célula huésped para la supervivencia y replicación del patógeno. Aunque ha habido algunas investigaciones sobre la localización subcelular de proteínas efectoras de las células hospedadoras para entender la función de patogenicidad mediante el uso de proteínas fluorescentes, investigación de la dinámica de efectores inyectados directamente de las bacterias ha sido un desafío debido a la incompatibilidad entre el T3SS y proteínas fluorescentes.
Aquí, describimos nuestro método reciente de un sistema de la proteína verde fluorescente de superfolder de split optimizado (sfGFPOPT) para visualizar la localización de efectores entregados vía el T3SS bacteriana de la célula huésped. El sfGFP11 (11 ath β-filamento de sfGFP)-etiquetado efectoras secretadas a través del T3SS se pueden montar con un orgánulo específico dirigido 10 sfGFP1OPT (1-10th β-filamento de sfGFP) líder para la emisión de fluorescencia en el sitio. Este protocolo proporciona un procedimiento para visualizar la señal de fluorescencia sfGFP reconstituido con una proteína efectora de Pseudomonas syringae en un orgánulo especial en las plantas de Arabidopsis y Nicotiana benthamiana .

La estructura del β-barril de GFP se compone de once β filamentos y puede dividirse en dos fragmentos, el filamento delth del 1-10 (GFP1-10OPT) y el filamento de la 11th (GFP11). Aunque ninguno de los dos fragmentos fluorescentes por sí mismos, uno mismo-montado sfGFP puede emitir la fluorescencia cuando los dos fragmentos en proximidad cercana (figura 1A). En este sistema, sfGFP1-10OPT-expresando Arabidopsis</e...

Enfoques basados en proteína fluorescentes para monitorear efectores secretados por las bacterias en las células del huésped son desafiantes. Esto es debido a la incompatibilidad entre proteínas fluorescentes y el sistema de secreción tipo III. Aquí, un optimizado superfolder GFP sistema se utiliza para la visualización de efectores secretados por las bacterias en la célula de la planta huésped.

Sistema proteína verde fluorescente para visualizar efectores entregado de las bacterias durante una infección

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la interacción planta-microbio, como por ejemplo, cómo las bacterias patógenas pueden alterar la condición óptima de sus células vegetales huésped mediante el uso de proteínas llamadas efectores secretadas en las células vegetales. La principal ventaja de esta técnica es que la proteína efectora bacteriana se expresa en la célula bacteriana utilizando su sistema de expresión nativo y luego se entrega a la célula vegetal a través del sistema de secreción bacteriana tipo III. Para comenzar este procedimiento, prepare las plantas Nicotiana benthamiana y Arabidopsis thaliana como se describe en el protocolo de texto.A continuación, utilice la electroporación estándar para transformar el gen portador y efector del plásmido fusionado con la etiqueta sfGFP11 en la cepa CUCPB5500 de tomate patóvar Pseudomonas syringae. El punto de tiempo óptimo y el nivel de expresión, o reconstituir sfGFP, realmente depende de su proteína efectora. Recomendamos optimizar las condiciones de inoculación u observación.Extienda suavemente las células bacterianas transformadas sobre la superficie de las placas de agar B de King's. A continuación, incubar las placas a 28 grados centígrados durante dos días. Después de esto, inocule una colonia bacteriana en un medio líquido King's B con un antibiótico apropiado para el vector.Incubar durante la noche a 28 grados centígrados con agitación a 200 rpm. Al día siguiente, agregue glicerol esterilizado en autoclave al medio inoculado hasta una concentración final del 50%Almacene a menos 80 grados centígrados. Para comenzar, transforme el plásmido en células de la cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens como se describe en el protocolo de texto.Cultive las células en medio LB Agar suplementado a 28 grados centígrados durante dos días. Usando una sola colonia del medio LB Agar, inocule 5 mililitros de medio LB líquido suplementado. Luego, haga crecer las células durante la noche a 28 grados centígrados agitando a 200 rpm.Después de esto, centrifugar a 3000 G durante 10 minutos para recolectar las células. Vierta el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 1 mililitro de tampón de infiltración recién hecho. Usando un espectrofotómetro, determine la cantidad de células de Agrobacterium midiendo el valor de densidad óptica a una absorbancia de 600 nanómetros.A continuación, utilice un tampón de infiltración para ajustar el OD 600 de las células bacterianas a 0,5. Deje el cultivo en una mecedora suave a temperatura ambiente durante una a cinco horas. Para infiltrar las hojas, use la punta de la pipeta de 10 microlitros para hacer un agujero en el centro de cada hoja.Use una jeringa sin aguja de 1 mililitro para inyectar cuidadosamente 500 microlitros de la suspensión de Agrobacterium en el lado adaxial de la hoja. Limpie la suspensión bacteriana restante de las hojas y marque el límite de la región infiltrada. Mantenga las plantas infiltradas en una cámara de crecimiento a 25 grados centígrados y 60% de humedad durante dos días.Escurre la cepa de Pseudomonas transformada del caldo de glicerol en el medio de agar King's B con el antibiótico adecuado. Incubar a 28 grados centígrados durante dos días. Inocular un asa de células de Pseudomonas en medio líquido de manitol glutamato.Incubar el cultivo durante la noche a 28 grados centígrados con agitación a 200 rpm. Después de esto, centrifugar a 3000 G durante 10 minutos para recolectar las células. Vierta el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en una solución de cloruro de magnesio de 10 milimolares.A continuación, ajuste la densidad óptica a 0,02 para las hojas de Nicotiana benthamiana y a 0,002 para las hojas de Arabidopsis. En el caso de las hojas de Nicotiana benthamiana, infiltre la suspensión de Pseudomonas en la misma zona en la que se infiltró la Agrobacterium dos días antes. Para la Arabidopsis transgénica, infiltre la suspensión de Pseudomonas en dos hojas de cuatro semanas de edad que crecieron en un día corto.Finalmente, corte un disco de hojas para las hojas inoculadas con Pseudomonas. En puntos de tiempo específicos después de la infiltración de Pseudomonas, use un sistema de escaneo láser confocal para obtener imágenes de dos discos de hojas de dos centímetros cuadrados de una sola planta. Observe las células alejadas del orificio de infiltración para evitar las células muertas muertas por heridas.Los efectores translocados de las bacterias están presentes solo en cantidades muy pequeñas. Por lo tanto, puede aumentar la potencia del láser y obtener una emisión de fluorescencia para detectar una señal fluorescente. Sin embargo, no domine demasiado para evitar capturar la señal falsa de la autofluorescencia de las células vegetales.En este estudio, se utiliza un enfoque basado en proteínas fluorescentes para monitorear los efectores secretados por las bacterias en las células huésped. Aquí se muestra un escaneo láser confocal de una hoja de Nicotiana benthamiana tres horas después de la infección. Las células que expresan sfGFP optimizado solo con AvrB no muestran ninguna señal fluorescente.Sin embargo, las señales de GFP se observan desde las células infectadas que contienen AvrB, sfGFP11. Esto verifica que el complejo AvrB sfGFP11 se reconstituye con sfGFP optimizado en el citosol y luego se transloca a la membrana plasmática. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener los materiales vegetales sanos y preparar el cultivo de bacterias frescas para las células activas.Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos, como el análisis de sangre con resina, para comprender la falsa modificación de la traducción de las proteínas efectoras de las bacterias en las células vegetales durante las respuestas inmunitarias de las plantas. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo visualizar la administración de efectores de tipo III en células vegetales infectadas. Los materiales vegetales y los cultivos de bacterias deben desecharse siguiendo los criterios de su laboratorio para residuos biopeligrosos y no olvide usar su EPP.

split-green-fluorescent-protein-system-to-visualize-effectors

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Fuente: Lee, H. et. al., Sistema de proteínas fluorescentes verdes divididas para visualizar efectores entregados por bacterias durante la infección. J. Vis. Exp. (2018)Este video demuestra un método para monitorear la infección bacteriana y la administración de proteínas efectoras en células vegetales utilizando la complementación de proteína fluorescente verde de supercarpeta dividida (sfGFP) combinada con microscopía confocal. El enfoque permite una visualización precisa de la translocación...

Monitoreo de infecciones bacterianas y administración de proteínas efectoras en células vegetales

Este artículo describe métodos para la síntesis y marcaje fluorescente de nanopartículas (NPs). Los NPs se aplicaron en los experimentos de pulso-caza para etiquetar el sistema de endo-lisosomal de las células eucariotas. La manipulación del sistema de endo-lisosomal por las actividades del patógeno intracelular Salmonella enterica fueron seguidos por imágenes de células vivas y cuantificada.

Aplicación de nanopartículas fluorescentes para estudiar Remodelación del Sistema Endo-lisosomal por bacterias intracelulares

La electroporación se utilizó para insertar proteínas efectoras de virulencia bacteriana purificadas directamente en células eucariotas vivas. La localización de proteínas se monitorizó mediante microscopía de inmunofluorescencia confocal. Este método permite estudiar el tráfico, la función y las interacciones proteína-proteína utilizando proteínas exógenas activas, evitando la necesidad de expresión heteróloga en células eucariotas.

La electroporación de efectores bacterianos funcionales en células de mamífero

La translocación del efector a las células huésped a través de un sistema de secreción de tipo III es una estrategia de virulencia común entre las bacterias gramnegativas. Se aplicó un ensayo basado en fusión de efectores betalactamasas para el análisis cuantitativo de la translocación. En las células infectadas por Yersinia, la conversión de un indicador FRET por la betalactamasa se controla mediante microscopía de barrido láser.

Análisis de<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Efector translocación en las células huésped Usando beta-lactamasa Efector fusiones

La investigación de las interacciones entre los patógenos bacterianos y sus anfitriones es un área importante de la investigación biológica. A continuación, describimos las técnicas necesarias para medir la translocación efector por Coxiella burnetii durante siRNA silenciamiento de genes utilizando sustrato Blam.

La aplicación de fluorescencia la transferencia de energía de resonancia (FRET) para examinar la eficiencia de efector por translocación<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Durante siRNA silenciamiento

Aquí, presentamos un protocolo para evaluar la fagocitosis de macrófagos peritoneales de ratón usando la fluorescencia verde mayor expresando proteínas de Escherichia coli.

Utilizando mayor expresión de proteína de fluorescencia verde Escherichia Coli evaluar fagocitosis de macrófagos peritoneales de ratón

Se describe aquí es un método para el análisis de expresión génica bacteriana en los tejidos animales a nivel celular. Este método proporciona un recurso para el estudio de la diversidad fenotípica que ocurre dentro de una población bacteriana en respuesta al ambiente de tejido durante una infección.

Un método basado en la fluorescencia para el estudio de regulación de los genes bacterianos en los tejidos infectados

La imagen de células bacterianas es un enfoque de biología de sistemas emergentes centrado en la definición de procesos estáticos y dinámicos que dictan la función de grandes máquinas macromoleculares. Aquí, la integración de imágenes cuantitativas de células vivas y tomografía crioelectrónica se utiliza para estudiar la arquitectura y las funciones del sistema de secreción de legionela pneumophila tipo IV.

Aplicación de imágenes de células vivas y tomografía crioelectrónica para resolver las características espaciotemporales del sistema de secreción de puntos de legionela pneumofilia/Icm

Este protocolo de imágenes celulares de células bacterianas vivas permite visualizar las interacciones entre múltiples especies bacterianas a nivel de una sola célula a lo largo del tiempo. Las imágenes de lapso de tiempo permiten la observación de cada especie bacteriana en monocultivo o cocultura para interrogar las interacciones entre especies en comunidades bacterianas multiespecies, incluida la motilidad celular individual y la viabilidad.

Visualización cinética de interacciones bacterianas entre especies de una sola célula

Este artículo proporciona un protocolo sencillo y claro para etiquetar los efectores secretados por Salmonella utilizando el sitio específico de expansión del código genético (GCE) e imágenes de la localización subcelular de proteínas secretadas en células HeLa utilizando microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa (dSTORM)...

Imágenes de superresolución de proteínas secretadas por bacterias mediante la expansión del código genético

Aquí, describimos un procedimiento que permite la detección de bacterias patógenas en todo el órgano durante la infección y la cuantificación de las actividades de los reporteros fluorescentes.

Tomografía tridimensional de órgano entero de alta resolución de infecciones microbianas

Aprende a visualizar efectores bacterianos en células vegetales mediante un sistema GFP superfolder optimizado. Este protocolo utiliza Nicotiana benthamiana y Arabidopsis thaliana para estudiar interacciones planta-patógeno.

Sistema proteína verde fluorescente para visualizar efectores entregado de las bacterias durante una infección

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