Visualización de la distribución de proteínas bacterianas en tres dimensiones mediante imagen de fluorescencia

Comienza con una lámina sellada que contiene células bacterianas etiquetadas con un marcador fluorescente rojo citoplasmático y un marcador fluorescente verde específico de proteína.

Observa la lámina bajo un microscopio de fluorescencia.

Localiza un campo que contenga células bacterianas bien aisladas y céntrate en el centro de una célula representativa.

Establezca el primer canal de fluorescencia y adquiera una imagen de pila z en parámetros específicos para capturar la forma tridimensional de la célula representativa y sus celdas cercanas.

Luego, cambia al segundo canal de fluorescencia y adquiere otra imagen z-stack de las mismas celdas con los mismos parámetros.

Captura la distribución de proteínas bacterianas dentro de las células.

Recorta células individuales de cada pila z para aislarlas y poder analizarlas en una sola célula.

Alinea estas imágenes para visualizar la distribución de proteínas bacterianas en relación con la forma celular, permitiendo un análisis preciso durante las interacciones huésped-patógeno.

Inmediatamente después de sellar la cubierta, coloque la lámina sobre un escenario de microscopio y, tras cinco minutos de equilibrio térmico, utilice las ruedas de enfoque del microscopio para enfocar el centro de una celda. En el software de microscopio asociado bajo Adquisición ND, marque la casilla Z para adquirir una pila Z y haga clic en el botón Home para establecer el centro de la celda como punto de partida. Ajusta el tamaño del paso a 0,1 micrómetros y el alcance a cuatro micrómetros, y asegúrate de que el dispositivo Z esté configurado en la etapa piezo.

Es fundamental que haya un desenfoque suficiente tanto en la parte superior como en la inferior de la celda para que la celda sea casi indistinguible del fondo. Configura los canales fluorescentes bajo la ventana lambda en la configuración de las moléculas fluorescentes que se están a imaginar, y confirma que el orden del experimento está configurado en lambda para que se obtenga una pila Z completa en cada canal de color antes de cambiar. Luego, haz clic en Ejecutar ahora para comenzar la adquisición de la imagen.

Cuando todas las imágenes hayan sido adquiridas, abre los archivos en un programa de análisis de imágenes adecuado. Dibuja una casilla alrededor de una celda individual y duplica esa celda dos veces, una para cada canal, asegurándote de que la casilla de duplicar hiperpila esté marcada, y cambia el canal a uno o dos. Una vez que ambas pilas estén disponibles, selecciona Imágenes, Pilas, Herramientas y Concatenar para combinar las imágenes.