La visualización de las respuestas inducidas por toxinas bacterianas mediante microscopía de fluorescencia de células en vivo

El objetivo de este procedimiento es visualizar las respuestas de las células inmunitarias a las toxinas bacterianas. En primer lugar, la toxina se expresa y purifica a partir de las células de oro BL 21. Una vez que se confirman la actividad y la concentración de la toxina, la toxina se libera a las células inmunitarias.

Mediante un microinyector y microscopía de células vivas de alta velocidad. El análisis de las imágenes resultantes revela la cinética en tiempo real de las respuestas de las células inmunitarias a la toxina. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología, como el mecanismo de activación del inflamasoma.

Aunque este método puede proporcionar información sobre las respuestas de las células inmunitarias mediadas por toxinas, también se puede aplicar a otros estímulos, incluidos los tractores quimiotácticos. La idea de este método fue cuando estudiamos la interacción de las bacterias con las células inmunitarias cultivadas y observamos interacciones muy variables entre las bacterias y las células inmunitarias. Comience la purificación de la lisina O o SLO con un cultivo de células de oro BL 21 que contengan PAG tres SLO.

Su plásmido creció hasta un OD de aproximadamente 0,6. Para inducir la expresión de proteínas, añadir cinco mililitros de 20% de OS al cultivo y agitar a 2 25 RPM a temperatura ambiente durante tres horas. A continuación, transfiera las bacterias a una botella centrífuga de 500 mililitros.

A continuación, centrifugar el cultivo a 12.000 veces G durante 12 minutos a cuatro grados centígrados después de la decantación del centrifugado. El supinato almacena el pellet a menos 80 grados centígrados durante la noche o más si es necesario. Para purificar el SLO expresado, agregue 10 mililitros de tampón de lavado complementado con Triton X 100 lisozima y fluoruro de fenilmetilsulfurilo a la pipeta de pellets congelados hacia arriba y hacia abajo durante unos 15 minutos.

Para Resus, suspenda el pellet manteniendo la muestra en hielo. Transfiera el pellet resuspendido a un tubo de polipropileno de fondo redondo Oak Ridge de 50 mililitros. Sonicar el lisado usando una sonda sonicate al 40%de salida cinco veces durante 30 segundos cada una a intervalos de 30 segundos con 30 segundos en hielo entre ellas.

A continuación, haga girar el lisado de sonicato a 39.000 veces G durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Después del centrifugado, agregue el supinato bacteriano a un mililitro de níquel NTA aros lavado. Incubar el níquel NTA aros y lisar juntos durante 2,5 horas a cuatro grados centígrados con una suave agitación después de la incubación.

Granule las cuentas girándolas a 400 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Tenga en cuenta que todos los lavados y eluciones posteriores se realizan con estos ajustes de centrifugación y se indica lo contrario. Después de la centrifugación.

Combine 30 microlitros del supinato con 10 microlitros de tampón de muestra SDS cuatro veces en un tubo de microcentrífuga y guárdelo en hielo para el análisis de pureza. A continuación, deseche el resto del agente supino y lave las perlas cuatro veces con tampón de lavado para piojos. Y una vez que interese el tampón de sal se centrifuga entre cada lavado A partir de este momento, asegúrese de mantener la muestra en hielo en todo momento.

La SLO es una proteína muy sensible a la redox y perderá rápidamente su actividad si se calienta hasta los 37 grados centígrados, aunque sea por un corto período de tiempo. Para eluir la proteína SLO, agregue un mililitro de tampón de elución y cinco microlitros de un DTT molar a las perlas, incube en hielo durante 10 minutos. A continuación, centrifugar y recoger el supinato en un tubo de fuga etiquetado con el número eluciano.

Repita este proceso tres veces, luego para agotar la endotoxina de la proteína SLO, agregue 200 microlitros de perlas agrícolas conjugadas de mezcla de polietileno lavado, tampón de sal res suspendida a la muestra y agite a cuatro grados centígrados durante 30 minutos. A continuación, gire a 10.000 veces G durante un minuto a cuatro grados centígrados. Después del centrifugado, recoja el sobrenadante en tubos de microcentrífuga nuevos etiquetados.

Combine 30 microlitros de cada elución con 10 microlitros, cuatro veces el tampón de muestra SDS. Para el análisis de páginas SDS, almacene las soluciones de SLO en hielo. Determine las concentraciones de proteínas y la actividad hemolítica si son satisfactorias, extraiga la endrina en cinco a 10 microlitros quats, luego congele en hielo seco y almacene a menos 80 grados Celsius.

A continuación, determine la lisis específica. Reese. Suspenda las celdas que se van a probar en dos momentos. Centre las seis celdas por mililitro en el tampón RB con 20 microgramos por mililitro.

Yoduro de propidio. Aquí se prueban las células T 27 A. Agregue 100 microlitros de celdas a cada pocillo de una placa inferior en V de 96 pocillos en tubos de microcentrífuga separados.

Diluir en serie SLO hasta dos veces la concentración final en el tampón rb. Luego agregue 100 microlitros de toxina o 100 microlitros de tampón RB a las células e incube durante cinco minutos a 37 grados centígrados. Las concentraciones finales típicas oscilan entre 2000 unidades por mililitro y 31,25 unidades por mililitro.

Ejecute celdas en un citómetro de flujo y recopile datos con filtros para fi, cetrina o pe. Un desplazamiento de un logaritmo representa células permeables transitoriamente, mientras que un desplazamiento de tres logaritmos indica células muertas. Calcule la lisis específica de las células restando el porcentaje de células muertas en el control del experimento usando la ecuación que se muestra aquí un día antes de la placa del experimento, dos veces centre los cinco macrófagos en el vidrio recubierto de colágeno.

Platos inferiores de 35 milímetros. El microscopio utilizado para la administración de toxinas debe estar equipado con una etapa invertida, una etapa calentada, los cubos de filtro de emisión de excitación apropiados y, si está disponible, una lente Berty. La parte más difícil de este procedimiento es llevar la aguja intacta hasta las células.

Para garantizar el éxito, utilizamos una lente Bertrand, que normalmente se utiliza para la alineación y visualizar la aguja a medida que la llevamos a través de los planos focales. El microscopio debe estar conectado a un microinyector y debe ser controlado por una computadora con suficiente memoria para recopilar y almacenar datos, encender el microscopio y el microinyector y permitir que el tiempo de la etapa calentada se caliente a 37 grados Celsius mientras espera que la etapa se caliente. Etiquete las células durante 30 minutos con tinte a 37 grados centígrados.

Dependiendo del ensayo, el etiquetado se puede realizar con cinco microlitros, cuatro o 2:00 AM en un mililitro, HBSS o dos microlitros de calcio am en un mililitro de medio completo, aquí se utilizan cuatro o dos. Retire el medio celular y lave las células una vez con PBS. Aspire el PBS y reemplácelo con un mililitro de RPMI suplementado con dos milimolares de cloruro de calcio.

Monta la antena en el microscopio, enfoca las células con campo claro y, a continuación, ajústalas para enfocarlas ligeramente por encima de ellas. A continuación, combine un microlitro de toxina SLO cuatro microlitros, 10 miligramos por mililitro, DEXTRA 5 55 y seis microlitros de agua. A continuación, centrifuga a 20.000 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.

El dextrano se utiliza para verificar que la punta del femto no esté obstruida con G. Use un microcargador para cargar dos microlitros de toxina diluida en la punta femto desde la parte trasera. Cargue la punta femto en el microinyector.

Luego, ajuste el ángulo del inyector para que la punta se asiente sobre el centro de las celdas con espacio para moverse en todas las direcciones, borre la configuración anterior para el límite Z, que limita qué tan bajo puede ir la punta del microinyector. Configure el microinyector para inyectar durante 0,5 segundos a 120 PSI con una contrapresión de 20 PSI. Luego baje la punta hasta que ingrese al medio.

Usando la lente Bertrand. Centre la punta y siga la punta a medida que se baja más cerca de las celdas. Una vez que la aguja se desenfoque, vuelva a la óptica normal.

La sombra de la aguja debe ser evidente en el campo. Enfoque por encima de las células y baje la aguja hasta que quede enfocada. A continuación, enfoque las células y acerque con cuidado la aguja adyacente a una célula.

Después de establecer el límite Z para la inyección, comience a obtener imágenes e inyectar la toxina. A continuación, levante la aguja y pase a una nueva región de células. Inyecte toxina adicional y continúe con las imágenes después de la inyección.

Mueva la aguja a la posición inicial para evitar cualquier fuga no deseada de toxinas de la aguja utilizando el método descrito en este video, de 10 a siete a 10 a ocho unidades por mililitro. El SLO se obtiene normalmente con una concentración de proteínas de cuatro miligramos por mililitro. Este gel de página de SDS muestra muestras bacterianas antes y después de la inducción de toxinas después de la purificación, y cada una de las tres tinciones de azul de kamasi de Ellucians revela que el SLO inducido se purificó con éxito.

SLO es la banda a 69 kilodaltons para determinar la cantidad de toxina necesaria para la lisis de las células T, 27, A o D, dos. Las células fueron desafiadas con varias concentraciones de SLO durante cinco minutos a 37 grados Celsius en presencia de yoduro de propidio y se examinaron mediante citometría de flujo. La lisis específica se determinó como se muestra aquí.

250 unidades por mililitro. SLO proporciona un 50% de lisis de las dos células T 27 A y D. Una dosis sublítica de 10% de lisis de la toxina sería de 62,5 unidades por mililitro.

Estos valores son importantes para la actividad de la toxina de referencia para evaluar la muerte celular después de la exposición a la toxina. Los fibroblastos dérmicos humanos se incubaron con homodímero de calcio y aterio utilizando un kit de muertos vivos de Life Technologies. Después de la exposición localizada a la toxina bacteriana, la antroplisina O.In esta imagen, el calcio se muestra en verde y el bromuro de aterio en las regiones rojas cercanas al microbioma, muestran la muerte celular caracterizada por la pérdida de calcio y la absorción del homodímero, mientras que las regiones más alejadas de la punta no mostrarán daños.

La micro administración de la toxina también permite el examen de eventos en tiempo real, como el flujo de calcio. Estos dcs humanos cargados con 4:02 AM fueron expuestos a SLO a una velocidad de flujo constante con un cambio simultáneo de imágenes en vivo de verde a azul. El pseudocolor indica un aumento en los niveles de calcio citosólico.

El SLO induce un rápido aumento del calcio citosólico, que se propaga a través de la región de la placa debido a la entrega localizada. Sin embargo, solo las células cercanas a la punta del microinyector se encuentran y reaccionan la toxina. Esto demuestra tanto la reacción de una célula a la toxina como el área espacialmente restringida de entrega de toxina para resolver eventos en la dimensión zdi.

La microadministración se combinó con microscopía confocal 3D de alta velocidad. Este conjunto de imágenes muestra células dendríticas después de la inyección de toxina. Se preincubaron con anti CD 11 C conjugado a un PC que se muestra en verde para marcar la membrana plasmática.

Como se puede ver aquí, las microvesículas se liberan después de la administración de toxinas. Como parte del proceso de reparación celular, las moléculas de toxina se concentran en las ampollas, que se desprenden para eliminar la toxina. Una vez dominada, la microscopía se puede realizar en 45 minutos.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener la toxina fría antes de mezclarla con las células y probar la actividad hemolítica. Bien. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir la cinética en tiempo real de las respuestas de las células inmunitarias a las toxinas bacterianas utilizando microscopía de células vivas.