La expansión de nanoestructurada Los sustratos usando la técnica de la puntada para Nanotopographical modulación del comportamiento de la célula

El objetivo general de este procedimiento es producir un área amplia de sustrato nanoestructurado a partir de moldes nanoestructurados pequeños, utilizando una técnica de cosido sencilla, económica y versátil. Este método puede ayudar a estudiar la modulación de la fenotipo y función celulares por la nanotopografía del sustrato a niveles celulares y moleculares, como la expresión de proteínas de adhesión focal. La principal ventaja de esta técnica es que es sencilla y rentable.

Para comenzar, prepare el molde de silicio silanizado en el prepolímero de PDMS, como se describe en el protocolo escrito. Coloque el molde de silicio silanizado en una placa de Petri de 60 milímetros. Vierta el prepolímero de PDMS sobre el molde de silicio en la placa de Petri.

Coloque la placa de Petri en un desecador de plástico y desgasifique durante aproximadamente 10 minutos, hasta que desaparezcan todas las burbujas. Transfiera la placa de Petri a una placa calefactora y cure el prepolímero de PDMS a 70 grados Celsius durante cuatro horas. Retire cuidadosamente el molde de PDMS del molde de silicio utilizando pinzas.

Determine la orientación de los nanopatrones anisotrópicos de PDMS, como las rejillas nanométricas, bajo un microscopio óptico, y márquela en la parte posterior de los moldes de PDMS con un rotulador. Limpie el sustrato de silicio con etanol en una campana extractora y luego séquelo con aire comprimido. Recorte las áreas sin patrón de cada molde de PDMS con una cuchilla.

Los moldes de PDMS deben alinearse lo más cerca posible, pero sin tocar el molde circundante, para minimizar el área sin patrón y evitar que la deformación del nanopatrón ocurra cuando se aplique la fuerza del compresor. Coloque el molde de PDMS recortado con la cara del nanopatrón hacia abajo sobre el lado reflectante del sustrato de silicio, y luego alinee los demás moldes cerca, pero sin tocar los moldes circundantes. Es fundamental intentar curar el PDMS en la capa basal, ya que el PDMS no curado podría fluir a través del espacio entre los múltiples moldes y dañar los nanopatrones.

Sin embargo, el PDMS completamente curado no puede unir varios moldes entre sí. Para preparar una capa adhesiva de PDMS, vierta un gramo de prepolímero de PDMS desgasificado sobre un portaobjetos limpio para formar una capa de 0,5 milímetros de espesor. Incube la capa de PDMS a 100 grados Celsius sobre una placa calefactora durante tres a cinco minutos.

Utilice una aguja para tocar la capa y asegúrese de que la capa esté parcialmente, pero no completamente, curada. Coloque la capa de PDMS en la parte posterior de los moldes de PDMS alineados, invierta rápidamente este conjunto y transfiéralo a la placa calefactora. Aplique una fuerza compresiva utilizando un bloque metálico en la parte superior del conjunto para garantizar un buen contacto entre la capa adhesiva de PDMS y la parte posterior de los moldes de PDMS.

Curar la capa adhesiva de PDMS a 100 grados Celsius durante una hora. Apague la placa calefactora, retire el bloque metálico y desprenda el molde de PDMS con una sola costura del sustrato de silicio. Para nanoimprimir el molde de PDMS cosido en la placa de PS, coloque la placa de PS en un espaciador de aluminio colocado sobre una oblea de silicio de tres pulgadas.

Caliente la placa de PS en una placa calefactora a 250 grados Celsius durante 30 minutos. Luego, coloque el molde de PDMS ensamblado, con los nanopatrones hacia abajo, sobre la placa de PS fundida. A continuación, coloque una placa de aluminio sobre la lámina de vidrio del molde de PDMS ensamblado.

Aplique una presión compresiva utilizando bloques de metal sobre la placa de aluminio y espere tres minutos. Levante y reemplace el bloque de metal de la placa de aluminio, y aumente la presión compresiva a 25 kilopascales. Luego, repita este paso aumentando la presión a 50 kilopascales.

Mantenga la temperatura de la placa calefactora entre 240 y 250 grados Celsius bajo una presión constante de 50 kilopascales durante 15 minutos. Apague la placa calefactora y enfríe todo el montaje. Retire los bloques de metal después de que la temperatura esté por debajo de 50 grados Celsius y desprenda cuidadosamente el molde de PDMS cosido de la placa de PS.

Para nanoimprimir el molde de PDMS sobre una película delgada de PS, coloque el molde de PDMS ensamblado con la cara de nanotopografía hacia abajo sobre la película delgada de PS, que debe estar colocada sobre una placa calefactora. Aplique una presión compresiva de 12 kilopascales sobre el molde de PDMS utilizando bloques metálicos sobre la lámina de vidrio del molde de PDMS. Eleve la temperatura de la placa calefactora hasta 180 grados Celsius y manténgala durante 15 minutos.

Apague la placa calefactora y enfríe todo el montaje. Retire los bloques metálicos después de que la temperatura descienda por debajo de 50 grados Celsius y desprenda cuidadosamente el molde de PDMS cosido de la película de PS. Utilizando un punzón circular de acero hueco, corte los sustratos de PDMS con nanopatrones en discos para adaptarlos a la configuración de una placa de múltiples pocillos específica.

Luego, use pinzas para colocar los discos de PDMS en los pocillos de la placa de múltiples pocillos. Esterilice los sustratos de PDMS utilizando etanol al 70 % durante 30 minutos. Posteriormente, aspire el etanol y exponga a luz UV durante 30 minutos.

Lave los sustratos de PDMS con solución salina tamponada con fosfato estéril 1X tres veces. A continuación, recubra los sustratos de PDMS con proteína de matriz extracelular durante 30 minutos a temperatura ambiente. Enjuague los sustratos de PDMS tres veces con PBS estéril, cada enjuague durante cinco minutos.

Suspenda las células humanas de cáncer de pulmón A549 en medio de Eagle modificado por Dulbecco con 10% de suero bovino fetal y cuente las células utilizando un hemocitómetro. Siembre las células a una densidad de siembra de 2.000 células por centímetro cuadrado sobre los sustratos de PDMS. Incube las células a 37 grados Celsius en una atmósfera humedecida que contenga 5% de dióxido de carbono durante un día y obsérvelas posteriormente.

El nanopatrón generado en la placa de PS y en la película delgada se muestra aquí. Las flechas indican el levantamiento del polímero en los intersticios de los moldes de PDMS unidos. Estas imágenes de SEM demuestran que los sustratos de trabajo de PDMS se transfieren fielmente desde el nanopatrón escrito por litografía de haz de electrones mediante la aplicación de la técnica de empalme.

Se muestran aquí imágenes representativas de microscopía electrónica de barrido (SEM) de células A549 cultivadas sobre nanorejillas y nanopilares. Las células presentan una morfología alineada sobre las nanorejillas, mientras que se extienden de forma aleatoria sobre los nanopilares. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar un sustrato nanopatrón de gran área mediante la unión de múltiples moldes nanopatrón pequeños y definidos.

No olvide que trabajar con tolueno y paraformaldehído puede ser extremadamente peligroso, y siempre use equipo de protección personal adecuado al realizar los procedimientos.