La expansión de nanoestructurada Los sustratos usando la técnica de la puntada para Nanotopographical modulación del comportamiento de la célula

El objetivo general de este procedimiento es producir una gran área de sustrato nanoestampado a partir de pequeños moldes nanopatrones mediante el uso de una técnica de puntada simple y asequible pero versátil. Este método puede ayudar a estudiar la modulación de la nanotopografía del sustrato del fenotipo y la función celular a nivel celular y molecular, como la expresión de proteínas de adhesión focal. La principal ventaja de esta técnica es que es sencilla y rentable.

Para comenzar, prepare el molde de silicio silanizado en el prepolímero PDMS, como se describe en el protocolo de texto. Coloque el molde de silicona silanizada en una placa de Petri de 60 milímetros. Vierta el prepolímero PDMS en el molde de silicona en la placa de Petri.

Coloque la placa de Petri en un desecador de plástico y desgasifique durante unos 10 minutos, hasta que desaparezcan todas las burbujas. Transfiera la placa de Petri a una placa caliente y cure el prepolímero PDMS a 70 grados centígrados durante cuatro horas. Despegue con cuidado el molde de PDMS del molde de silicona con unas pinzas.

Determine la orientación de los nanopatrones anisotrópicos de PDMS, como las nanorrejillas, bajo un microscopio óptico y márquelo en la parte posterior de los moldes de PDMS con un rotulador. Limpie el sustrato de silicona con etanol en una campana extractora y luego séquelo con aire comprimido. Recorte las áreas sin patrón de cada molde de PDMS con una cuchilla.

Los moldes de PDMS deben estar alineados lo más cerca posible, pero sin tocar el molde circundante, para minimizar el área sin patrón y evitar tocar la deformación del nanopatrón cuando se aplica la fuerza del compresor. Coloque el molde de PDMS recortado con el nanopatrón boca abajo en el lado del espejo del sustrato de silicona y, a continuación, alinee otros moldes cerca de los moldes circundantes, pero sin tocarlos. Es fundamental tratar de curar el PDMS en la capa basal porque el PDMS no curado puede fluir a través del espacio entre los múltiples moldes y dañar los nanopatrones.

Sin embargo, el PDMS completamente curado no puede unir los múltiples moldes entre sí. Para preparar una capa adhesiva de PDMS, echa un gramo de prepolímero de PDMS desgasificado en un portaobjetos de vidrio limpio para formar una capa de 0,5 milímetros de grosor. Hornee la capa de PDMS a 100 grados centígrados en un plato caliente durante tres a cinco minutos.

Use una aguja para tocar la capa y asegúrese de que la capa esté parcialmente curada pero no completamente. Coloque la capa de PDMS en la parte posterior de los moldes de PDMS alineados, invierta rápidamente este ensamblaje y transfiéralo a la placa calefactora. Aplique una fuerza de compresión utilizando un bloque de metal en la parte superior del conjunto para garantizar un buen contacto entre la capa adhesiva de PDMS y la parte posterior de los moldes de PDMS.

Cura la capa adhesiva de PDMS a 100 grados centígrados durante una hora. Apague la placa calefactora, retire el bloque de metal y retire el molde de PDMS de una sola costura del sustrato de silicona. Para nanoimprimir el molde de PDMS cosido en la placa PS, coloque la placa PS en un espaciador de aluminio colocado en una oblea de silicona de tres pulgadas.

Caliente la placa PS en una placa caliente a 250 grados centígrados durante 30 minutos. A continuación, coloque el molde de PDMS cosido, con los nanopatrones boca abajo, sobre la placa de PS fundida. A continuación, coloque una placa de aluminio en el portaobjetos de vidrio del molde PDMS cosido.

Aplique una presión de compresión mediante el uso de bloques de metal en la placa de aluminio y espere tres minutos. Levante y reemplace el bloque de metal de la placa de aluminio y aumente la presión de compresión a 25 kilopascales. Luego, repita este paso con la presión aumentada a 50 kilopascales.

Mantenga la temperatura de la placa calefactora entre 240 y 250 grados centígrados bajo una presión constante de 50 kilopascales durante 15 minutos. Apague la placa calefactora y enfríe toda la configuración. Retire los bloques de metal después de que la temperatura sea inferior a 50 grados centígrados y retire con cuidado el molde de PDMS cosido de la placa PS.

Para nanoimprimir el molde de PDMS en una película delgada de PS, coloque el molde de PDMS cosido con nanotopografía boca abajo sobre la película delgada de PS, que se coloca en una placa caliente. Aplique una presión de compresión de 12 kilopascales en el molde de PDMS utilizando bloques de metal en el portaobjetos de vidrio del molde de PDMS. Aumente la temperatura de la placa calefactora a 180 grados centígrados y manténgala durante 15 minutos.

Apague la placa calefactora y enfríe toda la configuración. Retire los bloques de metal después de que la temperatura baje por debajo de los 50 grados centígrados y retire con cuidado el molde de PDMS cosido de la película PS. Con un punzón de arco de acero hueco, corte los sustratos de PDMS nanopatrones en discos para adaptarse a la configuración de una placa específica de pocillos múltiples.

Luego, use pinzas para colocar los discos PDMS en los pocillos de la placa de pocillos múltiples. Esterilice los sustratos de PDMS utilizando etanol al 70% durante 30 minutos. A continuación, aspire el etanol y siga exponiéndolo a los rayos UV durante 30 minutos.

Lave los sustratos de PDMS con solución salina estéril tamponada con fosfato 1X tres veces. A continuación, recubra los sustratos de PDMS con proteína de matriz extracelular durante 30 minutos a temperatura ambiente. Enjuague los sustratos de PDMS tres veces con PBS estéril, cada una durante cinco minutos.

Suspenda las células de cáncer de pulmón humano A549 en el medio Eagle modificado de Dulbecco con un 10% de suero bovino fetal y cuente las células con un hemocitómetro. Separe las células a una densidad de siembra de 2.000 células por centímetro cuadrado en los sustratos de PDMS. Cultive las células a 37 grados centígrados en una atmósfera humidificada que contenga un 5% de dióxido de carbono durante un día y obsérvelas después.

Aquí se muestra el nanopatrón generado en la placa PS y la película delgada. Las flechas indican la elevación del polímero en los intersticios de los moldes PDMS cosidos. Estas imágenes SEM demuestran que los sustratos de trabajo con PDMS se transfieren fielmente desde el nanopatrón escrito por litografía por haz de electrones mediante la aplicación de la técnica de sutura.

Aquí se muestran imágenes SEM representativas de células A549 cultivadas en nanogredes y nanopilares. Las células muestran una morfología celular alineada en las nanorrejillas, mientras que las células se extienden aleatoriamente en los nanopilares. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar una gran área de sustrato con nanopatrones mediante la costura de múltiples moldes con nanopatrones pequeños y definidos.

No olvide que trabajar con tolueno y paraformaldehído puede ser extremadamente peligroso, y siempre use el equipo de protección personal adecuado mientras realiza los procedimientos.