Caracterización funcional de carboxilesterasas en casa resistente al insecticida moscas, Musca Domestica

Este método puede ayudar a las preguntas clave en el campo de la toxicología de insectos, tales como, ¿si todos los genes de desintoxicación metabólica están involucrados en la resistencia a los insecticidas? La principal ventaja de esta técnica es que permite producir mayores escalas de proteínas, y caracterizar la función de estas proteínas en el metabolismo de insecticidas in vitro. Demostrando los procedimientos, estará Xuechun Feng, un estudiante de posgrado en mi laboratorio.

La investigación doctoral de Xuechen se centra en la caracterización de la función de la carboxiesterasa en la resistencia al parásito de la mosca doméstica, Musca domestica. Para empezar, mezcle un microlitro de ADN plasmático de entrada GFP con cinco microlitros de un ADN lineal de término C disponible comercialmente en tubos de PCR de 250 microlitros. A continuación, añada dos microlitros de mezcla de recombinación lambda disponible en el mercado a cada uno de los tubos de PCR.

Mezcle suavemente los tubos e incube a 25 grados centígrados durante la noche. Siembre dos mililitros de cultivo celular de insectos SF9 en fase logarítmica de crecimiento uniforme en los pocillos de una placa de cultivo celular. A continuación, deje que las células se adhieran durante al menos tres horas a temperatura ambiente, en la campana.

Con un microscopio de fase invertida a 250x, compruebe la fijación de la célula. Luego, retire el medio de cultivo celular y reemplácelo con dos mililitros del medio para insectos de Grace. Después de esto, prepare las soluciones de mezcla de transfección A y B de acuerdo con el protocolo de texto.

A continuación, mezcle suavemente las mezclas de transfección A y B golpeando los tubos. Incubar la mezcla a temperatura ambiente, en la campana, durante 35 minutos. A continuación, agregue la mezcla gota a gota, sobre las celdas sembradas.

Selle los pocillos con cinta adhesiva e incube las celdas a 27 grados centígrados, durante la noche. Reemplace los dos mililitros del medio para insectos de Grace, con dos mililitros de medio de crecimiento completo. A continuación, añada 100 micromoles de Ganciclovir, a cada pocillo.

Selle los pocillos con cinta adhesiva e incube las celdas a 27 grados centígrados durante 72 horas. 72 horas después de la infección, recoja el medio de cada pocillo y transfiéralo a tubos de centrífuga de 1,5 mililitros. A continuación, centrifugar los tubos a 1500 veces G, durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.

Agregue un mililitro de medio de crecimiento completo al pocillo y use un microscopio con luz fluorescente para observar los signos de infección de las células en la etapa de amplificación de baculovirus P1. Transfiera el sobrenadante a nuevos tubos de centrífuga de 1,5 mililitros y guárdelos a cuatro grados centígrados, en condiciones de oscuridad. Después de esto, siembre dos mililitros de cultivo celular de insectos SF9 en fase de crecimiento logarítmico, de manera uniforme, en los pocillos de una placa de cultivo celular.

Deje que las celdas se adhieran durante al menos tres horas a temperatura ambiente, en la campana. Inocular cinco microlitros de caldo del virus P1 en los pocillos sembrados con células, luego agregue 100 micromoles de Ganciclovir a cada pocillo. Selle los pocillos e incube las células durante 72 horas a 27 grados centígrados.

En primer lugar, se cultivaron cinco mililitros de células SF9 de insectos de crecimiento en fase logarítmica, con medio de crecimiento completo, en matraces T25 no tratados. A continuación, añadir 25 microlitros de solución madre del virus P1 para infectar el cultivo celular, durante 48 horas, agitando suavemente, a 27 grados centígrados. Con acetonitrilo, prepare diluciones en serie de 100 milimoles de permetrina.

Luego, siembre 200 microlitros de cultivo celular infectado suplementado con 300 microlitros de medio de crecimiento completo, en una placa de 24 pocillos. Asegurándose de que la permetrina se disuelva completamente en el acetonitrilo y se administre uniformemente en cada pocillo de la placa. Después de agregar la permetrina, agite suavemente el plato para mezclar completamente la permetrina en el medio.

Después de esto, selle la placa con cinta adhesiva e incube la placa a 27 grados centígrados, durante 48 horas, en condiciones oscuras. Retire el medio de cultivo celular de la placa sin alterar la capa celular inferior adherida. Agregue 200 microlitros del reactivo MMT a cada pocillo.

Luego, incube la placa a 37 grados centígrados durante cuatro horas, hasta que se formen precipitantes de formazano de color púrpura oscuro en cada pocillo. Agregue 500 microlitros de DMSO a cada pocillo, para disolver completamente los precipitantes. Luego transfiera 200 microlitros de la solución disuelta, a cada pocillo de una placa de 96 pocillos.

La disolución completa del precipitado en DMSO es crucial para la precisión de los resultados. Después de agregar el DMSO a las muestras en la placa, las muestras se lavarán con la pipeta, varias veces, hasta que el precipitado se haya disuelto por completo. Por último, utilice un lector de microplacas para medir los valores de absorbancia de la placa a 540 nanómetros.

En la etapa P1, la tasa de infección es baja. En la etapa P2, la tasa de infección mejoró significativamente. En la etapa de infección por P3, casi todas las células mostraron síntomas de desprendimiento de la placa de cultivo celular, aumentos del diámetro celular, así como el cese del crecimiento celular.

Sobre la base de los valores de absorbancia detectados, las células que expresan Md alfa E7 mostraron una viabilidad significativamente mayor, en comparación con las células CAT de control. Al realizar este procedimiento, es importante prevenir la contaminación celular en todos los pasos, limpiando la superficie de los materiales, como botellas y tubos, con etanol al 70 por ciento antes de realizar los experimentos con celdas. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el modelado de homología y el análisis oscuro, para responder preguntas adicionales, como las interacciones entre la proteína carboxilo esterasa y el ligando de permetrina.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en toxicología de insectos exploraran la caracterización funcional de los genes y mecanismos en la resistencia a los insecticidas de los insectos. No olvide que trabajar con insecticida puede ser muy dañino, y siempre se deben tomar precauciones, como guantes y batas de laboratorio, mientras se realizan estos procedimientos.