3 보완 방법을 사용 하 여 태 반 대상 약물 전달의 안전과 효율성의 종합 평가

이 방법은 모체와 태아에게 전달되는 나노 입자에 적재된 약물의 효과와 안전성에 대한 나노 의학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 태반에 전달되는 약물의 양을 정확하게 생화학적으로 측정할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 태반에 대한 약물 전달의 정확한 표적을 보장하는 것이 중요하기 때문에 태반 매개 임신 합병증 치료로 확장됩니다.

배아 발달에 대한 고주파 초음파 평가는 숙달하기 위해 인내심과 경험이 필요하기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 나노입자 정맥 주사의 경우, 꼬리 정맥이 열팽창된 Embryonic Day 14.5 임신 마우스를 구속기로 옮기고 알코올 면봉으로 꼬리를 청소합니다. 그런 다음 28게이지 인슐린 주사기의 바늘 끝을 확장된 꼬리 정맥에 삽입하고 나노 입자를 꼬리 정맥으로 전달하기 위해 균일한 압력으로 플런저를 5-10초 동안 천천히 누릅니다.

주사 30분 후, 마취된 임산부 마우스를 누운 자세로 생체 내 형광 이미징 시스템의 이미징 챔버에 놓습니다. 인도시아닌 녹색 형광 신호를 이미징하기 위한 2D 형광 및 적절한 사진 매개변수를 선택하고 자동 노출과 여기 및 방출 파장을 각각 710 및 820 나노미터로 설정합니다. 그런 다음 동물을 이미지화하고 임신한 쥐를 우리로 되돌립니다.

주사 후 48시간 후에 Graefe 겸자, Graefe 조직 겸자 및 해부 가위를 사용하여 태아와 태반을 수집하고 수확된 조직을 전체 동물에 대해 방금 설명한 것처럼 이미지화합니다. 배아 발달에 대한 고주파 초음파 평가를 위해 나노 입자 주입 후 24시간 후에 마취된 임산부 댐을 섭씨 37-42도의 예열 초음파 이미징 플랫폼에 누운 자세로 고정하고 40메가헤르츠 변환기를 기계 암에 놓습니다. 그런 다음 변환기 위치를 조정하여 초점 영역 내의 관심 영역과 함께 태아와 태반의 세로 이미지를 얻습니다.

B-모드 이미징 및 분석을 위해 B-모드를 선택하고 태아와 태반이 보일 때까지 트랜스듀서를 복부 위로 내립니다. Scan/Freeze를 클릭하여 이미징을 시작 및 중지하고, Cine Store를 클릭하여 시네 루프를 저장하고, Frame Store를 클릭하여 프레임 이미지를 저장합니다. 그런 다음 측정을 클릭하여 재태낭 길이, 태아 크라운 엉덩이 길이, 양두정 직경, 복부 둘레, 태반 직경 및 태반 두께를 분석합니다.

맥파 도플러 이미징 및 분석을 위해 동일한 스캔 프로젝션을 사용하여 먼저 Color를 클릭한 다음 Pulse Wave를 선택하고 샘플링 볼륨 상자를 제대 동맥 중앙에 배치합니다. Scan/Freeze를 클릭하여 이미징을 시작하고 Cine Store를 클릭하여 제대 동맥 이미지를 수집합니다. 그런 다음 Measure(측정)를 클릭하여 제대 동맥 최고 속도를 계산합니다.

컬러 도플러 모드 이미징 및 분석의 경우 동일한 스캔 프로젝션을 사용하여 색상을 클릭하고 변환기 위치를 조정하여 시연된 대로 태아 심장 이미지를 얻습니다. 그런 다음 측정을 클릭하여 저장된 cine image loop의 태아 심박수를 계산합니다. 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석을 위해 먼저 Embryonic Day 14.5 임신한 마우스에 시연된 바와 같이 1회 용량의 나노 입자를 주입합니다.

24시간 후, 임신한 동물의 심장에 얼음처럼 차가운 0.9%식염수 50ml를 10분 동안 관류하여 결합되지 않은 나노 입자를 제거하고 태아와 태반을 채취하여 영하 80도의 보관을 합니다. 분석 당일, 각 200밀리그램 조직 샘플에 새로 준비된 균질화 용액 500마이크로리터를 추가하고 해리당 30초 동안 최고 속도로 샘플을 두 번 균질화합니다. 두 번째 균질화 후 샘플을 원심분리하고 0.45마이크로미터 주사기 필터를 통해 상등액을 HPLC 바이알로 여과합니다.

주입을 위해 샘플 바이알을 자동 시료 주입기 트레이에 넣고 HPLC 탈기 장치를 켜서 시스템에서 공기를 제거합니다. 다음으로, 기준선 노이즈를 줄이기 위해 30분 동안 흐름을 켜서 컬럼을 이동상과 평형을 이루고 컬럼의 온도를 섭씨 25도로 설정합니다. 그런 다음 30분 이내에 분당 1밀리리터의 유속으로 20마이크로리터 시료를 주입하고 Run Method를 클릭하여 분석을 시작합니다.

실행이 완료되면 수동으로 이동상을 HPLC 등급 아세토니트릴로 변경하고 약 15분 동안 아세토니트릴을 실행하여 시스템을 보호합니다. 생체 내 이미징은 태반 콘드로이틴 설페이트 결합 형광 접합 나노 입자 주입 후 30 분 후 자궁 조직에서 강력한 인도 시아닌 녹색 신호를 보여주는 반면, 결합되지 않은 나노 입자는 주로 간과 비장 영역에 국한됩니다. 주입 후 48시간이 지나면 태반 콘드로이틴 황산염 결합 나노입자 주입 동물의 태반에서 형광 신호가 관찰되며 태아 내에서는 신호가 감지되지 않습니다.

태반 콘드로이틴 황산염 결합 형광 접합 나노입자 주입 동물의 고주파 초음파 모니터링은 주요 태아 및 태반 발달 지표의 현저한 감소를 보여줍니다. 흥미롭게도, 메토트렉세이트 결합 나노입자를 사용한 처리는 태아 및 태반 발달을 약간 손상시키는데, 이는 나노입자가 향상된 투과성 및 보유 효과를 통해 태반으로의 메토트렉세이트 전달을 개선할 수 있음을 나타냅니다. HPLC에 의한 메토트렉세이트 농도 측정은 메토트렉세이트에 결합된 나노입자 주입 마우스의 태반 내 머무름 시간이 7분임을 나타냅니다.

주사 후 24시간이 지난 후, 메토트렉세이트 결합 나노입자 주입 그룹의 태반 메토트렉세이트 수치는 태반 콘드로이틴 황산염 및 메토트렉세이트 결합 나노입자 그룹에서 측정된 수치보다 현저히 낮았으며, 후자의 태아에서는 메토트렉세이트가 검출되지 않았습니다. 메토트렉세이트는 태반 콘드로이틴 설페이트와 메토트렉세이트 결합 나노입자 주입 후 48시간 후에도 태반에서 여전히 검출될 수 있으며, 이는 태반 콘드로이틴 황산염 및 메토트렉세이트 결합 나노입자가 태반을 통과할 수 없음을 입증하여 태아에 대한 잠재적인 부작용을 최소화합니다. 이 절차를 시도하는 동안, 태반은 배아 9 1/2일쯤에 형성되기 시작한다는 것을 기억하는 것이 중요하며, 따라서 생체 내 이미징 실험은 배아 10 1/2일 또는 그 이후에 수행하는 것이 더 좋습니다.

이 절차에 따라 면역형광 염색 및 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 태반 내 나노 입자의 국소화에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 생식 의학 분야의 연구자가 임신 합병증에서 태반 표적 치료의 가능성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.