Name: Visualización de estructura del tejido adiposo blanco 3D utilizando tinción de Whole-mount (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-17T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: Aprende la técnica de inmunotinción whole-mount para visualizar la arquitectura tridimensional del tejido adiposo blanco. Este método preserva la morfología celular y permite estudiar interacciones en condiciones metabólicas como el ayuno y la obesidad.

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Este trabajo fue financiado por subvenciones de las ciencias naturales y Consejo de investigación Ingeniería (NSERC) de Canadá, piloto y beca de estudio de viabilidad de Banting y Best Diabetes centro (BBDC), el fondo inicial de SickKids a H-K. S., médica centro de programa de investigación (2015R1A5A2009124) a través de la nacional investigación Fundación de Corea (NRF) financiado por el Ministerio de ciencia, TIC y futuro planea J r

Todos los protocolos experimentales de animales fueron aprobados por el Comité de cuidado Animal del centro para Phenogenomics (TCP) se ajustó a las normas del Consejo Canadiense sobre el cuidado Animal. Ratones fueron mantenidos en ciclos de luz/oscuridad de 12-h y con libre acceso a agua y alimentos. 7 meses viejos ratones machos C57BL/6J se utilizaron en el experimento de tinción montaje en conjunto.
Nota: Las secciones 1 y 2 están en orden cronológico, con la sección 3 es un paso opcional justo después de la sección 1. Sección 4 puede realizarse para analizar la densidad de tamaño y los vasos sanguíneos de adipocitos después de la terminación de la sección 2.
1. materiales preparación y aislamiento de tejido
<ol><li>Preparar el fresco 1% paraformaldehido (PFA) diluida en 1 x de tampón fosfato salino (PBS) para la fijación del tejido. Preparar los 0,3% surfactante no iónico diluido en PBS 1 x (en lo sucesivo como PBS-0.3T) para el tejido subsecuente pasos de lavado. Nota: Para cada tejido, preparar aproximadamente 1,5 mL de 1% PFA para garantizar una inmersión completa. Volumen de fijación puede aumentarse o disminuirse dependiendo del tamaño del tejido. Atención: Este paso es peligroso, como PFA es corrosivo y tóxico. Use equipo de protección personal (p. ej., guantes de nitrilo, bata de laboratorio, calzado, gafas de seguridad) y la manija en una campana de humos.</li>
	<li>Eutanasia de animales siguiendo un procedimiento aprobado (p. ej., dislocación cervical o asfixia dióxido de carbono). Sin demora, disecar el tejido adiposo deseado depósitos (p. ej., tejido adiposo blanco inguinal o perigonadal blanco el tejido adiposo)18.</li>
	<li>Con tijeras de disección, cortar el tejido en un 100 x 15 mm2 caja de Petri en trozos de aproximadamente 0,5 – 1 cm de tamaño y sumergirlos en tubos de microcentrífuga con 1% PFA. Mantener en hielo.</li>
</ol>2. whole-mount tinción de tejido adiposo blanco
<ol><li>Una vez completada la disección, mover las muestras de tejido en 1% PFA del hielo a temperatura (RT) por 1 h y luego se transfieren los tejidos a una placa de cultivo celular 12 o 24 pocillos para el lavado más rápido.</li>
	<li>Lavar los tejidos con PBS-0.3T, 3 veces durante 5 minutos cada uno en RT en un agitador inclinado a 22 º, con inclinaciones de 20 a 25 por minuto como la velocidad. Nota: Utilice esta inclinación y la velocidad para todos los pasos posteriores que implican el uso de una coctelera. Nota: Si utiliza una línea de ratón multicolor reportero como mT/mG y adicional anticuerpos no es necesario, el tejido está listo para microscopía tras el paso 2.2.</li>
	<li>Agregar 0,5 a 1 mL de tampón de bloqueo (5% de suero animal diluido en PBS-0.3T). Poner la placa en la coctelera e incubar durante 1 h en RT</li>
	<li>Aspire la solución de bloqueo y añadir anticuerpos primarios diluidos en PBS-0.3T con 1% de suero de animales.</li>
	<li>Coloque el plato en un agitador a 4 ° C durante la noche.</li>
	<li>Al día siguiente, lavar los tejidos con PBS-0.3T 3 veces durante 5 minutos cada uno en RT</li>
	<li>Uso de anticuerpos secundarios apropiados diluidos en PBS-0.3T. Añadir 0,5 – 1 soluciones de anticuerpo secundario de mL en cada pocillo. Envolver la placa en papel de aluminio e incubar en un agitador durante 1 hora a TA. Nota: Diluir el anticuerpo secundario en la oscuridad para evitar el fotoblanqueo.</li>
	<li>Después de la incubación del anticuerpo secundario, lavar con PBS-0.3T dos veces durante 5 minutos, cada uno en RT. las muestras de la imagen si no se desea una tinción de lípidos neutros. Si la visualización de las gotitas de lípidos es necesaria utilizando el lípido neutral mancha, lavado con PBS 1 x (sin tensioactivo no iónico) dos veces, 5 minutos cada uno.</li>
	<li>Tras los pasos de lavado, incubar con la mancha de lípido neutral diluida con 1:1500 factor de dilución en PBS 1 x durante 30 min en RT Los tejidos están ahora preparados para microscopía. Para la proyección de imagen de futuro, los tejidos pueden almacenarse en esta solución a 4 ° C. Nota: Calidad de imagen disminuye con el tiempo; por lo tanto, la mejor época para la proyección de imagen es dentro de 1 o 2 días.</li>
	<li>Utilizando pinzas, coloque el tejido en un cubreobjetos de vidrio 24 x 60 mm² y colóquelo en un sistema del microscopio láser confocal invertido.</li>
	<li>Si la coloración de los núcleos con DAPI se desea, agregar 1-2 gotas de medio de montaje con DAPI para sumergir el tejido completamente y evitar que se resequen.</li>
	<li>Para obtener imágenes de montaje todo manchado de los tejidos en varios planos focales, realizar Z-pilas de 100 – 150 μm en profundidad con 4 – 6 μm tamaño de paso en el aumento deseado.</li>
</ol>3. tejido claro e inmunomarcación utilizando iDISCO +
Nota: Este protocolo se basa en los procedimientos anteriormente publicados en9,10,19.
<ol><li>Fijación y tratamiento previo de metanol<ol>
<li>Incubar los tejidos en el 4% PFA diluido en PBS 1 x a 4° C durante la noche en tubos de microcentrífuga de 2 mL. Nota: Deje los tejidos en los tubos de 2 mL para los siguientes tratamientos hasta la proyección de imagen.</li>
		<li>Al día siguiente, lavar los tejidos en PBS 1 x tres veces, durante 1 hora en un agitador a TA. Nota: Este paso puede ser un punto de pausa para dejar la muestra durante la noche en RT o 4 ° C.</li>
		<li>Deshidratar los tejidos en RT en 20%, 40%, 60% y 80% metanol, posteriormente, durante 1 hora. Deshidratar en metanol al 100% a temperatura ambiente durante 1 hora, luego transferir los tejidos frescos 100% metanol e incubar a 4 ° C durante 1 hora. Nota: Metanol diluido en agua destilada. Durante la incubación de metanol, no hay necesidad para poner las muestras en un agitador como se sumergen las muestras de tejido. Atención: Este paso es peligroso, como el metanol es tóxico. Es altamente inflamable en llamas. Usar equipo de protección personal (p. ej., guantes de nitrilo, bata, gafas de seguridad) y el mango en una campana de humos. Almacenar el metanol de encendido y en un gabinete de seguridad inflamable.</li>
		<li>Blanquear los tejidos con 5% de peróxido de hidrógeno (H2O2; 1 volumen de 30% H2O2 diluido en 5 volúmenes de metanol 100%) durante la noche a 4 ° C. PRECAUCIÓN: el peróxido de hidrógeno 30% es muy peligroso en la piel y contacto con los ojos. Usar equipo de protección personal (p. ej., guantes de nitrilo, bata, gafas de seguridad) y el mango en una campana de humos.</li>
		<li>Rehidratar los tejidos en RT en 80%, 60%, 40% y 20% de metanol y 1 x PBS, posteriormente, durante 1 hora.</li>
		<li>Lavado con surfactante no iónico 0,2% diluido en 1 x PBS dos veces, durante 1 hora en un agitador a TA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inmunomarcación Nota: Llenar los tubos de 2 mL que contiene el tejido de la parte superior del tubo con la solución utilizada en cada paso para evitar la oxidación de tejido como inmunomarcación comienza, hasta que claro se ha completado.<ol>
<li>Permeabilizar los tejidos por los de incubación en una solución de 1 x PBS, surfactante no iónico 0,2%, 20% de dimetilsulfóxido (DMSO) y glicina de 0.3 M a 37 ° C en un agitador orbital mesa incubado durante 2 días. Nota: El tiempo de incubación máximo para paso de permeabilización de 37 ° C es de 2 días.</li>
		<li>Bloquear los tejidos en una solución de 1 x PBS, surfactante no iónico 0,2%, 10% DMSO, suero burro 5% y 1% Fc bloque a 37 ° C en un agitador orbital mesa incubado durante 2 días. Nota: El tiempo de incubación máximo para el paso de bloqueo es de 2 días.</li>
		<li>Incubar los tejidos en anticuerpos primarios de interés en una solución de PBS 1 x, 0.2% polisorbato 20, 10 μg/mL heparina, DMSO 5% y 5% de suero de burro a 37 ° C en un agitador orbital mesa incubado durante 4 días.</li>
		<li>Lave con 1 x PBS, 0.2% polisorbato 20 y 10 de μg/mL heparina, en un agitador a temperatura ambiente cinco veces, cada uno por 1 h. Nota: Este paso puede ser un punto de pausa para dejar las muestras durante la noche en RT</li>
		<li>Incubar anticuerpo secundario en una solución de PBS 1 x, 0.2% polisorbato 20, de los tejidos 10 μg/mL heparina y 5% de suero de burro a 37 ° C en un agitador orbital mesa durante 4 días. Nota: De paso 3.2.5, todas las muestras necesitan ser envueltos con papel de aluminio para evitar el fotoblanqueo de anticuerpo secundario.</li>
		<li>Lavar los tejidos en una solución de 1 x PBS, 0.2% polisorbato 20 y 10 heparina μg/mL en un agitador en RT cinco veces, por 2 h. Nota: Este paso puede ser un punto de pausa para dejar las muestras durante la noche a TA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tejido de tejido adiposo blanco y la proyección de imagen de volumen<ol>
<li>Deshidratar los tejidos contenidos en tubos de 2 mL por incubación en 20%, 40%, 60% y 80% metanol, posteriormente, cada uno durante 1 hora a TA. Entonces, deshidratan las muestras en metanol al 100% dos veces a TA. Nota: Este paso puede ser un punto de pausa para dejar sus muestras en metanol al 100% durante la noche a TA.</li>
		<li>Incubar los tejidos con una mezcla de 2 volúmenes de DCM a 1 volumen de metanol durante 3 horas a temperatura ambiente en un agitador. Nota: DCM es volátil. Asegúrese de que los tubos están sellados herméticamente para evitar la evaporación. Atención: Este paso es peligroso. DCM es tóxico por inhalación. La exposición prolongada puede causar quemaduras químicas. Use equipo de protección personal (p. ej., guantes de nitrilo, bata de laboratorio, calzado, gafas de seguridad). Utilizar una campana de humos.</li>
		<li>Incubar dos veces, los tejidos en DCM de 100% durante 15 min en un agitador a TA.</li>
		<li>Incubar a 100% DBE en RT hasta la proyección de imagen y para el almacenamiento de la muestra. Antes de la proyección de imagen, invertir los tubos varias veces para mezclar las soluciones. Nota: Llene completamente los tubos con DBE para evitar la oxidación, que puede resultar en tejido claro. No agite los tubos durante la incubación de DBE. Atención: Este paso es peligroso. DBE es tóxico. Puede causar irritación a los ojos y la piel. Usar equipo de protección personal (p. ej., guantes de nitrilo, bata, gafas de seguridad) y el mango en una campana de humos.</li>
		<li>Imagen de la muestra de todo tejido con un microscopio de luz que coincida con el índice de refracción de DBE solvente orgánico. Realizar apilamiento Z aumento deseado y el tamaño de paso para el tejido entero.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ejemplos de análisis de datos de Whole-mount mancharon tejido imágenes con ImageJ
Nota: Vea https://imageJ.nih.gov/ij/download.html para instrucciones de descarga e instalación.
<ol><li>Cuantificación de la densidad de vasos sanguíneos ( figura 2de lacomplementaria )<ol>
<li>Importar las imágenes guardadas del solo canal con inmunotinción de vasos sanguíneos en ImageJ. Nota: Las imágenes de cuantificación deben ser coherentes en términos de procedimiento de tinción y la condición de adquisición de imagen. Deben utilizarse reactivos idénticos. El tiempo de exposición, intensidad y la ampliación también deberían ser equivalente en la proyección de imagen de proceso20.</li>
		<li>Convertir el color de la imagen en blanco y negro para la cuantificación de densidad de los vasos sanguíneos. Para ello, en la pestaña "Imagen" , seleccione el comando de "Ajuste" , entonces la opción de "umbral de Color" . En el "umbral de Color" Mostrar cuadro, seleccione "Fondo oscuro"20 y seleccione "B & W" bajo el "umbral de Color".</li>
		<li>Para medir el porcentaje de área de la señal de los vasos sanguíneos contra el fondo, seleccione la pestaña de "Analizar" , luego el comando "analizar partículas" . En la pantalla de "partículas analizadas", seleccione las opciones "Borrar resultados" y "Resumir" . Haga clic en "Aceptar".</li>
		<li>Copie y pegue el valor de la zona de porcentaje en la ficha Resumen en una hoja de cálculo para el análisis. El porcentaje de área indicará la densidad de los vasos sanguíneos. Repita los pasos 4.3.1–4.3.4 para cada imagen individual.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cuantificación del adipocito tamaño21 (suplementario figura 3)<ol>
<li>Importar las imágenes guardadas de los adipocitos en ImageJ.</li>
		<li>Para establecer la escala de la imagen, mida la longitud de la escala en pixeles trazando una línea a la escala con una distancia conocida en la imagen usando la herramienta de selección lineal. En la pestaña de "Analizar" , seleccione el comando "Set Scale" . La distancia de la línea que trazó ante se calcularán automáticamente en píxeles.</li>
		<li>Aparece el cuadro de pantalla "establecer escala" . Entrar en la unidad de longitud y distancia conocida. Seleccionar "Global" para aplicar la escala para todas las imágenes importadas y haga clic en "Aceptar".</li>
		<li>Para elegir el área como el método de medición, en la pestaña de "Analizar" Seleccione el comando de "establecer medidas" . Aparecerá una lista de opciones diferentes para las mediciones. Seleccione la opción de "Zona" y haga clic en "Aceptar".</li>
		<li>Con la herramienta Selección a mano alzada, trazar el perímetro de cada adipocito de interés. En la pestaña de "Analizar" , seleccione el comando "Medida (Ctrl + M)" , y aparecerá en el área de los adipocitos. Repita este procedimiento para otros adipocitos en la imagen. Nota: Para garantizar mediciones precisas, utilizar varias imágenes para la cuantificación.</li>
		<li>Copie y pegue las mediciones de área en una hoja de cálculo para mayor análisis de los datos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aunque las técnicas convencionales como la histología y criosección ofrecen beneficios para la observación de la estructura intracelular, conjunto Monte coloración proporciona una perspectiva diferente en la investigación de tejido adiposo, que permite la visualización en 3D de celular arquitectura del tejido mínimamente procesada.
Con el fin de realizar con éxito el montaje conjunto de tinción, las siguientes sugerencias deben tomarse en consideración. Depósitos de tejido adiposo diferentes p...

Tejido adiposo es un órgano esencial para el almacenamiento de energía y se caracteriza por remodelación dinámica y expansión casi ilimitada1. Además de homeostasis de energía, el tejido adiposo también juega un papel esencial en la secreción de la hormona de más de 50 adipokines para modular la función metabólica de todo el cuerpo2. El tejido adiposo tiene una arquitectura diversa que consta de diversos tipos celulares como adipocitos maduros, fibroblastos, células endoteliales, células inmunes y adipocito progenitoras células3. Estudios recientes han demostrado que la obesidad y otra disfunción metabólica pueden alterar significativamente la función del tejido adiposo y su microambiente, que incluye pero no se limita a la ampliación de los adipocitos, infiltración de células inflamatorias (por ejemplo, los macrófagos) y disfunción vascular3.
Técnicas morfológicas convencionales como la histología y cryosectioning demuestran varias limitaciones en el estudio de Biología adiposo como pasos largos procesos químicos, que puede conducir a tejido estructura y contracción distorsión3, 4. Además, estas técnicas 2D son insuficientes para observar las interacciones intercelulares ejercidas por diversos tipos celulares, como las secciones obtenidas se limitan a regiones más pequeñas del tejido entero3. Métodos en comparación con convencional de imágenes fluorescentes, todo montaje coloración no requiere de otras medidas invasivas, como inclusión, seccionamiento y deshidratación; por lo tanto, esto evita el problema de disminuir la especificidad del anticuerpo. Como tal, es un método sencillo y eficaz para la proyección de imagen el tejido adiposo, con mejor preservación de la morfología de los adipocitos y de estructura de tejido adiposo total5. Por lo tanto, todo montaje de tinción como una técnica rápida y barata de la inmunomarcación fue establecida para preservar tejido adiposo arquitectura 3D1,6,7,8.
Sin embargo, a pesar de la preservación de la morfología del tejido adiposo con el uso de tinción montaje en conjunto, esta técnica es todavía incapaz de visualizar estructuras internas, debajo de la superficie lipídica de los tejidos. Varios recientes estudios9,10 han creado tejido claro técnicas combinadas con inmunomarcación conjunto montaje1,6 para permitir la visualización completa en 3D dentro del tejido adiposo. En particular, redes neuronales y vasculatura densas fueron visualizadas en reciente estudios9,10,11,12 con la proyección de imagen de volumen 3D. De hecho, estudiando la plasticidad neural y vascular del tejido adiposo en diferentes condiciones fisiológicas es esencial para el estudio de su biología. Proyección de imagen tridimensional de inmunomarcación compatible de claro de tejido de órganos despejó de solvente (iDISCO +) es un proceso compuesto por tratamiento previo de metanol, inmunomarcación y claro de opacidad tejido con reactivos químicos orgánicos diclorometano (DCM ) y dibencilo éter (DBE)13,14. Haciendo que el tejido adiposo totalmente transparente, puede obtenerse una representación más precisa de la anatomía dentro de los tejidos como vasos sanguíneos y fibras nerviosas9,10. IDISCO + tiene ventajas en que es compatible con varios anticuerpos y Reporteros fluorescentes11,14, y se ha demostrado éxito en múltiples órganos y embryoes hasta14. Sin embargo, su principal limitación es un tiempo de incubación, en el que 18 a 20 días se necesitan para completar todo el experimento.
Otra aplicación importante de montaje conjunto de tinción es la visualización del destino celular en combinación con un sistema de rastreo de linaje. Seguimiento del linaje es el etiquetado de un gen/marcador específico en una celda que puede transmitirse a todas las células de la hija y se conserva largo tiempo15. Como tal, es una poderosa herramienta que puede utilizarse para determinar el destino de la progenie de una célula15. Desde la década de 1990, sistema Cre-LoxP recombinante se ha convertido en un poderoso enfoque para seguimiento del linaje en la vida de los organismos15. Cuando una línea de ratón que expresa Cre, una enzima recombinase de ADN, se cruza con otra línea de ratón expresan un reportero que es adyacente a una secuencia loxP-parada-loxP, la proteína reportera es expresado15.
Para la tinción de todo montaje, el uso de fluorescentes reporteros multicoloras es adecuado para la proyección de imagen del tejido adiposo porque permite la interferencia mínima con actividades intracelulares del adipocito16. Sin embargo, reporteros tradicionales típicamente manchan el citoplasma, lo que es difícil rastrear el linaje de los adipocitos blancos, que tienen un limitado contenido citoplásmico17. Para superar este problema, el uso del marcador de membrana membrana tdTomato fluorescente eGFP (mT/mG) reporter es una herramienta ideal. Orientada a la membrana tdTomato se expresa en Cre-negativo células18. Sobre supresión de Cre, un interruptor para la expresión de eGFP orientada a la membrana se produce, lo que este reportero adecuado para rastrear el linaje del adipocito progenitores17,18 (Complementario de la figura 1).
El propósito de este trabajo es proporcionar un protocolo detallado para montaje en conjunto tinción y mostrar cómo se puede combinar con otras técnicas para estudiar el desarrollo y la fisiología del tejido adiposo. Dos ejemplos de aplicaciones descritas en este protocolo son su uso con líneas de ratón reportero 1) multicolor para identificar los distintos orígenes de los adipocitos y 2) tejido claro para visualizar más la arborización neuronal en el tejido adiposo blanco (WAT).

<table><tbody><tr><td>LipidTox</td><td>Life Technologies</td><td>H34477</td><td></td></tr><tr><td>PECAM-1 anticuerpo primario</td><td>Millipore</td><td>MAB1398Z(CH)</td><td></td></tr><tr><td>TH (tirosina hidroxilasa) anticuerpo primario</td><td>Millipore</td><td>AB152, AB1542</td><td></td></tr><tr><td>Tinción DAPI</td><td>BD Pharmingen</td><td>564907</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal Nikon A1R</td><td>Microscopio confocal</td> <td>Nikon</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicroscopio I</td><td>LaVision BioTec</td><td></td><td>Microscopio fluorescente con imagen de hoja de luz</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Anticuerpos secundarios</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td></td><td>Longitudes de onda 488, 594 y 647 utilizadas</td></tr><tr><td>Rata purificada Anti-Ratón CD16/CD32</td><td>BioSciences</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270997</td><td></td></tr><tr><td>Dibencil-éter</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33630</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Chemical</td><td>A452-1</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrógeno al 30%</td><td>BIO BASIC CANADA INC</td><td>HC4060</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>J7126</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Lectin kit I, fluoresceína etiquetado</td><td>VECTOR LABORATORIES</td><td>FLK-2100</td><td></td></tr><tr><td>F4/80</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA497GA</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Medio de montaje rígido con DAPI</td><td>VECTOR LABORATORIES</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído (PFA)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampón de fosfato solución salina (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suero animal (cabra, burro)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualización de estructura del tejido adiposo blanco 3d utilizando tinción de whole-mount

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Tejido adiposo es un órgano metabólico importante con alta plasticidad y responde a estímulos ambientales y estado nutricional. Como tal, han desarrollado varias técnicas para estudiar la morfología y la biología del tejido adiposo. Sin embargo, métodos de visualización convencionales se limitan a estudiar el tejido en secciones 2D, pudiendo capturar la arquitectura 3D del órgano entero. Aquí presentamos el conjunto de montaje coloración, un método de inmunohistoquímica que conserva intacto el tejido adiposo morfología con pasos de proceso mínima. Por lo tanto, se mantienen las estructuras de los adipocitos y otros componentes celulares sin distorsión, lograr la visualización 3D más representativa del tejido. Además, Monte toda la coloración se puede combinar con métodos de rastreo de linaje para determinar las decisiones de destino celular. Sin embargo, esta técnica tiene algunas limitaciones para proporcionar información precisa con respecto a partes más profundas del tejido adiposo. Para superar esta limitación, todo Monte tinción más combinables con técnicas para eliminar la opacidad del tejido y permitir la visualización completa de la anatomía de todo el tejido adiposo mediante microscopía fluorescente luz-hoja de limpieza del tejido. Por lo tanto, una mayor resolución y una representación más precisa de las estructuras de tejido adiposo pueden ser capturados con la combinación de estas técnicas.

Debido a la fragilidad del tejido adiposo, métodos que implican varios pasos de procesamiento y seccionamiento pueden llevar a la desfiguración de tejido adiposo morfología3 (figura 1A). Sin embargo, el conjunto montaje coloración puede conservar la morfología de los adipocitos, garantizar la precisa interpretación de los resultados (figura 1B).
Fijación excesiva de tejido adiposo lleva a autofluorescence fijad...

El objetivo del presente estudio es demostrar la técnica de inmunotinción y visualización de conjunto de montaje como un método ideal para la proyección de imagen 3D del componente celular y arquitectura de tejido adiposo.

Visualización de estructura del tejido adiposo blanco 3D utilizando tinción de Whole-mount

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología adiposa, como cómo las interacciones intercelulares y la fisiología del tejido adiposo cambian en diferentes condiciones metabólicas como el ayuno y la obesidad. La principal ventaja de esta técnica es que conserva de forma óptima la estructura 3D adiposa original y evita largos pasos de procesamiento que suelen ser necesarios para la inmunohistoquímica convencional. Aunque este método puede proporcionar información sobre la estructura del tejido adiposo, también se puede aplicar a otros sistemas de órganos, como el sistema nervioso, mediante la tinción de montaje completo del cerebro.Generalmente, individuos nuevos en este método lucharán debido a las dificultades para obtener sitios de tejido de la propiedad, encontrar el período de fijación adecuado, y las concentraciones óptimas de anticuerpos. Una vez completada la disección, transfiera el plato que contiene las muestras de tejido en 1%paraformaldehído del hielo a temperatura ambiente durante una hora. Luego transfiera los tejidos a una placa de cultivo celular de 12 o 24 pozos para un lavado más rápido.Es importante recordar que el procedimiento de tinción de montaje completo debe comenzar inmediatamente después de la disección y que no hay puntos de pausa entre cada paso. Lave los tejidos con PBS-0.3T en una coctelera inclinada a 22 grados con una velocidad entre 20 y 25 inclinaciones por minuto a temperatura ambiente durante cinco minutos. Repita este lavado dos veces más.Después de esto, añadir aproximadamente 0,5 a un mililitro de tampón de bloqueo que contiene 5%suero animal. Incubar la placa en una coctelera utilizando las condiciones anteriores durante una hora. Aspirar la solución de bloqueo y añadir mililitros de anticuerpos primarios diluidos en PBS-0.3T con 1%de suero animal a cada pozo.Incubar la placa durante la noche en una coctelera a cuatro grados Centígrados con una inclinación de 22 grados y una velocidad de 20 a 25 inclinaciones por minuto. Al día siguiente, utilice PBS-0.3T para lavar los tejidos a temperatura ambiente durante cinco minutos. Repita este lavado dos veces más.A continuación, agregue entre 0,5 y un mililitro de soluciones de anticuerpos secundarios adecuadas y diluidas a cada pozo. Envuelva la placa en papel de aluminio e incubarlo en una coctelera a temperatura ambiente durante una hora. Después de esto, lave la placa dos veces con PBS-0.3T a temperatura ambiente durante cinco minutos por lavado.Si se necesita la visualización de gotas líquidas durante la mancha de lípidos neutros, lave dos veces con 1 pbS PBS con cada lavado que dure cinco minutos. Añadir la mancha de lípidos neutros diluido en PBS, e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Para comenzar la toma de imágenes, utilice fórceps para poner el tejido plano sobre un resbalón de cubierta de vidrio de 24 por 60 milímetros.Si se desea la tinción de núcleos con DAPI, agregue de una a dos gotas de un medio de montaje que contenga DAPI para sumergir completamente el tejido y evitar que se seque. A continuación, coloque la diapositiva en un sistema de microscopio láser confocal invertido. Para obtener imágenes de tejido teñido de montaje completo en múltiples planos focales, realice pilas Z de 100 a 150 micrómetros en profundidad con un tamaño de paso de cuatro a seis micrómetros con el aumento deseado.En este estudio, la tinción de montaje integral se utiliza para preservar la arquitectura del tejido adiposo. A diferencia de los métodos que implican múltiples pasos de procesamiento y sección, lo que puede conducir a la desfiguración de la morfología del tejido adiposo, el método de tinción de montaje completo puede preservar la morfología de los adipocitos, asegurando la precisión al interpretar los resultados. La sobrefija del tejido adiposo conduce a la fluorescencia inducida por reparadores, que puede ser indicada por regiones idénticas superpuestas, como en las señales tirosina hidroxilasa y PECAM-1 que se ven aquí.Sin embargo, las muestras de manchas de montaje integral correctamente fijadas muestran señales separadas y distintas, lo que indica que estas señales no son autofluorescencia. La imagen de tejido adiposo teñido de montaje integral permite la cuantificación de cambios morfológicos en diferentes condiciones experimentales. En particular, el tejido adiposo es altamente vascularizado, lo que es importante en la mediación de la homeostasis metabólica sobre los cambios rápidos en el nivel de energía.Por ejemplo, los ratones C57 negros 6J, que se someten a 24 horas de ayuno, muestran un tamaño de adipocitos significativamente más pequeño, lo que indica lipólisis, y una tendencia en la densidad elevada de los vasos sanguíneos en comparación con ratones alimentados continuamente. La limpieza de los tejidos adiposos con iDISCO+permite que los tejidos adiposos se vuelvan ópticamente transparentes. El inmunoetiquetado del tejido adiposo que ha pasado por la limpieza de tejidos muestra una arborización neuronal mucho más densa en comparación con la observada en la tinción de montaje integral sin limpiar tejido en la misma ampliación.Al intentar este procedimiento, es importante recordar no sobrefijar las muestras durante más de una hora a temperatura ambiente en PFA, de lo contrario, esto aumentará la autofluorescencia de fondo. Sin embargo, este período de fijación puede prolongarse si las muestras se fijan en cuatro grados centígrados. Siguiendo este procedimiento, otros métodos como la cuantificación usando ImageJ, se pueden realizar con el fin de responder a preguntas adicionales, como cómo la arquitectura celular, como los sitios de adipocitos y la densidad de los vasos sanguíneos, cambian en respuesta a diversas condiciones fisiológicas.

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Para obtener imágenes de alta resolución de células marcadas con fluorescencia dentro de tejidos grandes, idealmente, las muestras biológicas deben ser visualizadas sin seccionar. 3DISCO es un procedimiento sencillo de limpieza de tejidos basado en la incubación secuencial con disolventes orgánicos. Al aclararse, los órganos se vuelven transparentes, lo que permite un escaneo láser de extremo a extremo del espécimen.

Borrado de imágenes Sistemas Biológicos intactos a nivel celular por 3DISCO

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Este trabajo presenta un nuevo protocolo de procesamiento e imagen para el análisis transversal transversal de tejido tridimensional denso que permite la plena explotación de las modalidades de imagen confocal. Este protocolo preserva la antigenicidad y representa un sistema robusto para analizar la histología de la piel y potencialmente otros tipos de tejidos.

Montaje entero horizontal: un nuevo protocolo de procesamiento e imágenes para tejidos gruesos y tridimensionales Secciones transversales de la piel

Debido al contenido alto de lípidos, tejido adiposo ha estado desafiando a visualizar utilizando métodos histológicos tradicionales. Adipo-Clear es un tejido de limpieza técnica que permite etiquetado robusta y alta resolución volumétrica fluorescente la proyección de imagen del tejido adiposo. Aquí, describimos los métodos para la preparación de la muestra, tratamiento previo, tinción, limpieza y montaje para la proyección de imagen.

Adipo-claro: Un tejido claro método de proyección de imagen tridimensional del tejido adiposo

Formación de vasos sanguíneos y la inervación simpática juegan papeles fundamentales en la remodelación del tejido adiposo. Sin embargo, quedan cuestiones técnicas en visualizar y medir cuantitativamente el tejido adiposo. Aquí presentamos un protocolo para etiquetar correctamente y comparar cuantitativamente la densidad de los vasos sanguíneos y fibras nerviosas en diferentes tejidos adiposos.

Co de tinción de los vasos sanguíneos y fibras nerviosas en el tejido adiposo

Aquí, describimos un método de limpieza simple, barato y rápido para resolver la estructura 3D del tejido adiposo blanco humano y de ratón utilizando una combinación de marcadores para visualizar vasculatura, núcleos, células inmunitarias, neuronas y proteínas de la capa de gotas de lípidos mediante imágenes fluorescentes.

Explorar la estructura del tejido adiposo mediante la limpieza de metilsalicilatos y las imágenes 3D

Imágenes funcionales y cuantificación de depósitos adiposos termogénicos en ratones utilizando un enfoque basado en imágenes micro-PET / MR.

Visualización y cuantificación de tejidos adiposos marrones y beige en ratones utilizando [18F]FDG Micro-PET/MR Imaging

El reemplazo del tejido muscular sano con grasa intramuscular es una característica prominente de las enfermedades y afecciones humanas. Este protocolo describe cómo visualizar, visualizar y cuantificar la grasa intramuscular, lo que permite el estudio riguroso de los mecanismos subyacentes a la formación de grasa intramuscular.

Una guía para examinar la formación de grasa intramuscular y su origen celular en el músculo esquelético

Los preadipocitos se aíslan de la fracción vascular estromal del tejido adiposo marrón interescapular de ratones recién nacidos y se diferencian en células que acumulan gotas de lípidos, expresan marcadores moleculares y muestran la morfología mitocondrial de los adipocitos marrones maduros. Estas células se analizan posteriormente mediante inmunofluorescencia y microscopía electrónica de transmisión.

Diferenciación e imagen de adipocitos marrones de la fracción vascular estromal de tejido adiposo interescapular de ratones recién nacidos

Aquí, describimos un protocolo para aislar, cultivar y fenotipar células endoteliales microvasculares a partir de tejido adiposo subcutáneo humano (hSATMVECs). Además, describimos un modelo experimental de diafonía entre hSATMVEC y adipocitos.

Estudio de la diafonía entre células endoteliales adiposas y adipocitos en el tejido adiposo subcutáneo humano

Aprende la técnica de inmunotinción whole-mount para visualizar la arquitectura tridimensional del tejido adiposo blanco. Este método preserva la morfología celular y permite estudiar interacciones en condiciones metabólicas como el ayuno y la obesidad.

Visualización de estructura del tejido adiposo blanco 3D utilizando tinción de Whole-mount

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