Visualización de estructura del tejido adiposo blanco 3D utilizando tinción de Whole-mount

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología adiposa, como cómo las interacciones intercelulares y la fisiología del tejido adiposo cambian en diferentes condiciones metabólicas como el ayuno y la obesidad. La principal ventaja de esta técnica es que conserva de forma óptima la estructura 3D adiposa original y evita largos pasos de procesamiento que suelen ser necesarios para la inmunohistoquímica convencional. Aunque este método puede proporcionar información sobre la estructura del tejido adiposo, también se puede aplicar a otros sistemas de órganos, como el sistema nervioso, mediante la tinción de montaje completo del cerebro.

Generalmente, individuos nuevos en este método lucharán debido a las dificultades para obtener sitios de tejido de la propiedad, encontrar el período de fijación adecuado, y las concentraciones óptimas de anticuerpos. Una vez completada la disección, transfiera el plato que contiene las muestras de tejido en 1%paraformaldehído del hielo a temperatura ambiente durante una hora. Luego transfiera los tejidos a una placa de cultivo celular de 12 o 24 pozos para un lavado más rápido.

Es importante recordar que el procedimiento de tinción de montaje completo debe comenzar inmediatamente después de la disección y que no hay puntos de pausa entre cada paso. Lave los tejidos con PBS-0.3T en una coctelera inclinada a 22 grados con una velocidad entre 20 y 25 inclinaciones por minuto a temperatura ambiente durante cinco minutos. Repita este lavado dos veces más.

Después de esto, añadir aproximadamente 0,5 a un mililitro de tampón de bloqueo que contiene 5%suero animal. Incubar la placa en una coctelera utilizando las condiciones anteriores durante una hora. Aspirar la solución de bloqueo y añadir mililitros de anticuerpos primarios diluidos en PBS-0.3T con 1%de suero animal a cada pozo.

Incubar la placa durante la noche en una coctelera a cuatro grados Centígrados con una inclinación de 22 grados y una velocidad de 20 a 25 inclinaciones por minuto. Al día siguiente, utilice PBS-0.3T para lavar los tejidos a temperatura ambiente durante cinco minutos. Repita este lavado dos veces más.

A continuación, agregue entre 0,5 y un mililitro de soluciones de anticuerpos secundarios adecuadas y diluidas a cada pozo. Envuelva la placa en papel de aluminio e incubarlo en una coctelera a temperatura ambiente durante una hora. Después de esto, lave la placa dos veces con PBS-0.3T a temperatura ambiente durante cinco minutos por lavado.

Si se necesita la visualización de gotas líquidas durante la mancha de lípidos neutros, lave dos veces con 1 pbS PBS con cada lavado que dure cinco minutos. Añadir la mancha de lípidos neutros diluido en PBS, e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Para comenzar la toma de imágenes, utilice fórceps para poner el tejido plano sobre un resbalón de cubierta de vidrio de 24 por 60 milímetros.

Si se desea la tinción de núcleos con DAPI, agregue de una a dos gotas de un medio de montaje que contenga DAPI para sumergir completamente el tejido y evitar que se seque. A continuación, coloque la diapositiva en un sistema de microscopio láser confocal invertido. Para obtener imágenes de tejido teñido de montaje completo en múltiples planos focales, realice pilas Z de 100 a 150 micrómetros en profundidad con un tamaño de paso de cuatro a seis micrómetros con el aumento deseado.

En este estudio, la tinción de montaje integral se utiliza para preservar la arquitectura del tejido adiposo. A diferencia de los métodos que implican múltiples pasos de procesamiento y sección, lo que puede conducir a la desfiguración de la morfología del tejido adiposo, el método de tinción de montaje completo puede preservar la morfología de los adipocitos, asegurando la precisión al interpretar los resultados. La sobrefija del tejido adiposo conduce a la fluorescencia inducida por reparadores, que puede ser indicada por regiones idénticas superpuestas, como en las señales tirosina hidroxilasa y PECAM-1 que se ven aquí.

Sin embargo, las muestras de manchas de montaje integral correctamente fijadas muestran señales separadas y distintas, lo que indica que estas señales no son autofluorescencia. La imagen de tejido adiposo teñido de montaje integral permite la cuantificación de cambios morfológicos en diferentes condiciones experimentales. En particular, el tejido adiposo es altamente vascularizado, lo que es importante en la mediación de la homeostasis metabólica sobre los cambios rápidos en el nivel de energía.

Por ejemplo, los ratones C57 negros 6J, que se someten a 24 horas de ayuno, muestran un tamaño de adipocitos significativamente más pequeño, lo que indica lipólisis, y una tendencia en la densidad elevada de los vasos sanguíneos en comparación con ratones alimentados continuamente. La limpieza de los tejidos adiposos con iDISCO+permite que los tejidos adiposos se vuelvan ópticamente transparentes. El inmunoetiquetado del tejido adiposo que ha pasado por la limpieza de tejidos muestra una arborización neuronal mucho más densa en comparación con la observada en la tinción de montaje integral sin limpiar tejido en la misma ampliación.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar no sobrefijar las muestras durante más de una hora a temperatura ambiente en PFA, de lo contrario, esto aumentará la autofluorescencia de fondo. Sin embargo, este período de fijación puede prolongarse si las muestras se fijan en cuatro grados centígrados. Siguiendo este procedimiento, otros métodos como la cuantificación usando ImageJ, se pueden realizar con el fin de responder a preguntas adicionales, como cómo la arquitectura celular, como los sitios de adipocitos y la densidad de los vasos sanguíneos, cambian en respuesta a diversas condiciones fisiológicas.