Análisis de microbiota utilizando PCR de dos pasos y secuenciación genética de rRNA 16S de próxima generación

El perfilado del microbioma es el primer paso hacia la definición del papel del microbioma en la salud y la enfermedad. Aquí, estamos describiendo un procedimiento simple para aislar el ADN bacteriano de alta calidad de la biblioteca de preparación de muestras fecales, realizar ARN 16SR y un análisis de datos de secuenciación y microbioma meta genómico. Este protocolo ayudará a los investigadores nuevos en el campo del microbioma, así como a los investigadores que trabajan en el campo del microbioma en el establecimiento de la tubería del microbioma en su laboratorio. Este protocolo puede ampliarse para el perfilado del microbioma a partir de otros especímenes biológicos como muestras nasales, orales o cutáneas de sujetos animales y humanos. La recolección de cuentas es el paso más importante, ya que todos los pasos aguas abajo dependen de ADN de alta calidad. El sellado adecuado de la placa de conservación es importante, ya que el sellado incompleto podría conducir a la opresión del producto amplificado, lo que resulta en datos de secuenciación de baja calidad. Para empezar, esteriliza las cajas divisoras con 70%etanol. Coloque los ratones en cajas divisoras esterilizadas y déjales defecar normalmente hasta por una hora. Utilice fórceps estériles para recoger los gránulos fecales en un tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitros preetiquetado vacío. Encierre el tubo de forma segura. Esterilice los fórceps con 70% de etanol, seguido de una toallita desechable germicida, después de recoger las fecales de cada ratón. Pesar 200 miligramos de pellets fecales en un tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitros, con cuentas de vidrio de 0,1 mililitros, y colocar el tubo de cuenta en un homogeneizador de batido de cuentas y homogeneizar las muestras durante 45 segundos a temperatura ambiente, a una velocidad de 4,5 metros por segundo. Extraiga ADN según las instrucciones del fabricante del kit y eluda el ADN en un tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitros. Después de aislar el ADN, cuantifique el ADN aislado cargando 1 microlitro del ADN en un fluorómetro. Configuración 16S amplificación del gen de ARN ribosomal PCR1 en una placa PCR de 96 pozos, utilizando un volumen de reacción de 25 microlitros. Usando una pipeta multicanal, agregue 40 nano gramos de ADN, 13,5 micro litros de mezcla de enzimas polimerasas de alta fidelidad 2X, que contienen tampón, más DNP en imprimación delantera e inversa. Selle la placa PCR correctamente de la parte superior a la inferior a lo largo de los cuatro bordes. Y centrifugar a 1000 veces G a 20