Name: La identificación de patógenos bacterianos raras por 16S rRNA gen secuenciación y MALDI-TOF MS (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 34 s
Description: Aprende a identificar patógenos bacterianos raros mediante espectrometría de masas MALDI-TOF y secuenciación del gen 16S rRNA. Este método rápido y rentable mejora el diagnóstico microbiológico clínico.

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Los autores desean agradecer al Prof. Enno Jacobs por su continuo apoyo.

1. Extracción de ADN bacteriano <ol><li> Preparación de la solución PBS <ol><li> Pesar 1,65 g de Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O, 0,22 g de NaH 2 PO 4 x 2 H 2 O y 8,80 g de NaCl en un matraz y llenar con agua destilada hasta un volumen final de 1.000 ml. Ajustar el pH a 7,4. Para uso final filtrar la solución a través de una prueba de bacterias (0,22 m) de filtro. </li></ol></li><li> Las bacterias Extracción de ADN de bacterias Gram-negativas <ol><li> Streak el material del paciente en un medio de cultivo apropiado (por ejemplo, Columbia agar sangre), identificar y aislar los patógenos potenciales. </li><li> Preparar cultivo puro y llevar a cabo la tinción de Gram para determinar morfotipo y para confirmar la pureza y de la cultura 49. </li><li> Elija una sola colonia bacteriana y transferirlo con un 1 l de un solo uso asa de siembra en un tubo de reacción de 2,0 ml estéril que contiene 1 ml de solución de PBS. </li><li> Incubar esta suspensión en una thermomixer a 95 ° C durante 10 minutos. Después de la incubación, dejar que el extracto bacteriano (que contiene el ADN disuelto) enfriar a temperatura ambiente y, o bien utilizarla directamente para la amplificación o almacenar a -20 ° C para su uso posterior (Figura 1a). </li></ol></li><li> Las bacterias Extracción de ADN de bacterias Gram-positivas <ol><li> Streak el material del paciente en un medio de cultivo apropiado (por ejemplo, Columbia agar sangre), identificar y aislar los patógenos potenciales. Realizar tinción de Gram con el fin de confirmar morfotipo de la cultura. </li><li> Preparar cultivo puro y llevar a cabo la tinción de Gram para determinar morfotipo y para confirmar la pureza del cultivo. </li><li> Elija una sola colonia bacteriana con un asa de siembra estéril y 1 l suspenderlo en 500 l de PBS solución en un tubo de 2,0 ml de reacción. </li><li> Añadir 500 l de vidrio-cuentas y transferir el tubo a un homogeneizador oscilante, que funciona a la frecuencia máxima y la amplitud (50 Hz), por 5 min. Utilizar perlas de vidrio de 1,0 mm de diámetropara interrumpir las paredes celulares bacterianas. </li><li> Incubar este tubo durante 10 min a 95 ° C y se enfría a temperatura ambiente. El uso del extracto, ya sea directamente para la reacción de PCR o almacenar a -20 ° C para su uso posterior. </li></ol></li></ol> 2. 16S rDNA PCR <ol><li> Preparación de Cebadores de amplificación <ol><li> Utilice la TPU1 cebadores (5&#39;-GTT AGA TGA TCM CTC TGG AG-3 &#39;[M = A / C]) como cebador directo y RTU4 (5&#39;-TAC CAG ATC GGT TGT TAA TCC T-3&#39;) como cebador inverso 25. Preparar una solución de imprimación de valores con DNasa y RNasa libre de agua, que tiene una concentración de 100 pmol / l (100 mM) y diluir aún más a una solución de trabajo a las 10 pmol / l. Guarde el archivo de imprimación y la solución de trabajo a -20 ° C o utilizar directamente. </li></ol></li><li> Preparación de la mezcla de reacción PCR <ol><li> Pipeta de 1 l de cada cebador, 1 l dNTP-mix (100 mM), 2,5 l de extracto de ADN, 5 l de 10x tampón de PCR (que contiene Mg 25 mMCl 2), 0,25 l de Taq-polimerasa (5 unidades / l) y 39,25 l DNasa y RNasa libre de agua de PCR en un tubo de reacción l estéril 200. </li></ol></li><li> Protocolo de PCR <ol><li> Iniciar el programa de PCR construido de la siguiente manera: En primer lugar, una etapa de incubación inicial a 95 ° C durante 5 min, que es necesario para activar la Taq-polimerasa. En segundo lugar, 35 ciclos de amplificación, que contiene un 1 min. paso de desnaturalización a 95 ° C, a 1 min. paso de reasociación del cebador a 50 ° C, y una etapa de extensión del cebador 1,5 min a 72 ° C. En tercer lugar, una extensión final de 10 min a 72 ° C. Por último, la reacción de PCR se enfría a 4 ° C. NOTA: Staphylococcus aureus y H 2 O sirven como control positivo y negativo (Figura 1b). </li><li> Se coloca el tubo que contiene la mezcla de reacción de PCR en el termociclador e iniciar el programa. </li></ol></li><li> La purificación del producto de PCR NOTA: Con el fin de purificar el producto de la PCR, ya sea varios protocolosSe pueden usar enzimático basado o con una matriz de adsorción de sílice. La PCR de un solo paso de limpieza utilizado aquí utiliza dos reacciones enzimáticas hidrolíticas. Mientras exonucleasa I (Exo I) elimina ADN de cadena sencilla, la fosfatasa alcalina de gamba (SAP) hidroliza dNTPs no incorporados. El segundo procedimiento se basa en una técnica de adsorción de la membrana de sílice con una sal de alta unión rápida - lavar - ciclo de elución baja en sal. <ol><li> Añadir 1,5 l de una mezcla enzimática que contiene tanto Exo I y SAP para 25 l producto de PCR, mezclar bien y transferir a un termociclador aplicando un protocolo simple de los primeros 15 min a 37 ° C seguido de 15 min a 80 ° C. Almacenar el producto de PCR purificado, ya sea a -20 ° C o usarlo directamente como objetivo para el etiquetado de PCR. </li></ol></li></ol> 3. ADN en gel de agarosa La electroforesis <ol><li> Preparación del tampón de electroforesis (TBE-buffer) <ol><li> Valorar 54,0 g de base TRIS (mM 445), 27,5 g (445 mM) de ácido bórico y 20 ml de una M EDTA 0,5 (10mM) solución a pH 8,0 con NaOH en un matraz y llenarlo con agua destilada hasta un volumen total de 1.000 ml. Luego se diluye este buffer 5x 1:10 con agua destilada (TBE 0,5x) para la electroforesis. </li></ol></li><li> Preparación del tampón de carga <ol><li> Mezclar 250 mg de azul de bromofenol, 250 mg FF xileno cianol y 15 g de polisucrosa (Tabla de Materiales) en un matraz. Luego llenarlo con tampón TBE 0,5x a un volumen total de 100 ml. Alícuota del colorante de carga de porciones de 1 ml y se almacena a -20 ° C para su posterior uso. </li></ol></li><li> Reparto del gel de agarosa <ol><li> Pesar 6 g de electroforesis de agarosa estándar de 300 ml de tampón TBE 0,5x (ver sección 3.1.1) en un matraz, para preparar un 2% (w / v) en gel de agarosa. A continuación, poner la mezcla de agarosa en un horno de microondas, calentar punto cerca de ebullición hasta que la agarosa se disuelve completamente y la solución aparece clara. </li><li> Deje que los agarosa fundida se enfríe lo suficiente y añadir 10 l de un 1% (w / v) de bromuro de etidio Stock Solución. Verter la solución en un molde y colocar un peine de gel (permitiendo 30 pozos) en el reparto. Retire el peine cuando el gel está completamente solidificado y poner el gel en la cámara de electroforesis que contiene tampón TBE 0,5x. NOTA: El bromuro de etidio es tóxico y mutagénico. Por lo tanto, debe manejarse con precaución. Es aconsejable el uso de guantes de nitrilo. Hay manchas de ácidos nucleicos intercalante alternativos que se pueden utilizar como una alternativa no tóxica. </li></ol></li><li> En gel de agarosa La electroforesis de los productos de PCR NOTA: Con el fin de verificar el tamaño correcto de los amplicones de PCR y para estimar la concentración de ADN del producto de PCR purificado se separa en un gel de agarosa. <ol><li> Pipetear 2 l de tampón de carga en un tubo de reacción de PCR y añadir 8 l de producto de PCR. Pipetear esta mezcla en los pocillos del gel. Añadir 8 l de un marcador de tamaño de peso molecular (escalera de ADN) en un pocillo separado para estimar el tamaño del producto de PCR. </li><li> Aplicaruna tensión constante a 10 V / cm y detener la electroforesis tan pronto como el marcador de azul de bromofenol ha alcanzado aproximadamente ¾ de la longitud total del gel. Visualizar los fragmentos de PCR separadas utilizando un transiluminador de UV (longitud de onda de 302 nm) y documentarlos mediante un sistema de gel-documentación. Estimar la cantidad de ADN por comparación visual con la escalera de ADN. Utilice aproximadamente 10 ng como objetivo para el etiquetado de PCR. </li></ol></li></ol> 4. La secuenciación de Sanger <ol><li> Ciclo de Secuenciación PCR NOTA: Realice el etiquetado PCR en una reacción de 10 l usando un kit comercial (Tabla de Materiales). <ol><li> Añadir 2 l de mezcla maestra de reacción 5x, 2 l de la preparación de ADN, 1,5 l de TPU1 o RTU4 solución de trabajo (10 pmol / l) y 4,5 l de DNasa y RNasa libre de agua. </li><li> Ponga esta mezcla de reacción de secuenciación en un termociclador de PCR y ejecutar otro. En total, 25 ciclos de proceso que consiste en una etapa de desnaturalización (96 ° C,10 seg), una etapa de recocido (45 a 60 ° C, 5 segundos) y un paso de extensión (60 ° C, 2 min). Finalmente, se enfría la reacción a 4 ° C. </li></ol></li><li> Purificación de la reacción de secuenciación <ol><li> Se purifica la mezcla de reacción de marcaje utilizando columnas de centrifugación comerciales de purificación de PCR (Tabla de Materiales). </li><li> Carga de 10 l de la reacción de secuenciación en la matriz de filtración en gel pre-hidratado y realizar una etapa de centrifugación a 750 xg durante 3 min. NOTA: Por el uso de este procedimiento tintes terminadores no incorporados son retenidas en la matriz de gel. </li><li> A continuación, secar el eluato acuoso en un concentrador de vacío. Centrifugar a 2500 xg durante 20 a 30 min a 40 ° C para completar la sequedad. </li><li> Añadir 10 l de formamida desionizada altamente continuación desnaturalice a 90 ° C durante 2 min y se enfría la mezcla en hielo. Pipeta de 10 l de las muestras desnaturalizadas en una placa de 96 l. Almacenar el producto de PCR secado y limpiado a -20 ° C si el análisis espara ser llevado a cabo en un momento posterior. </li></ol></li><li> 16S rRNA gene secuenciación y análisis de la secuencia de ADN NOTA: Realizar análisis de la secuencia en un secuenciador automatizado (Tabla de Materiales). El secuenciador se usa aquí es un sistema de electroforesis capilar basado en la fluorescencia automatizado que analiza 4 muestras simultáneamente (matriz de 50 cm 4-capilar) con un polímero líquido 67 (Figura 1c). <ol><li> Coloque la placa de microtitulación en el secuenciador. Escribir una hoja de muestra (placa de registro) como se establece en 2, guardarlo y comenzar la secuencia de arranque / análisis siguiendo los pasos dados en 1. NOTA: Duración de una secuencia de ejecución es de 2 horas y proporciona datos de 800 a 1.000 pb. </li><li> Abra el software de análisis de secuenciación (Tabla de Materiales). Los datos de secuencia se dan como un archivo de texto (.seq) y un archivo que contiene el electroferograma incluyendo valores de calidad (QV) (.ab1). NOTA: Base de llamada es automáticamente porformado por el software de análisis de secuenciación y el electroferograma subyacente se comprueba visualmente (por ejemplo, la altura del pico, la separación de pico) antes de la secuencia se utiliza para otras aplicaciones. </li><li> Comparar el archivo de secuencia de ADN almacenada para el algoritmo BLAST nr base de datos NCBI utilizando (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide). </li></ol></li></ol> 5. MALDI-TOF MS NOTA: El espectrómetro de masas utiliza un 337 nm N 2 de láser y es operado por un software específico de control (Tabla de Materiales). Los espectros se registraron en el modo lineal y un intervalo de masas entre 2.000 a 20.000 Da está cubierto. Interpretación de los datos y la asignación de las puntuaciones de las muestras se lleva a cabo en tiempo real mediante un software de análisis (Tabla de Materiales) (Figura 1d). <ol><li> Preparación de las bacterias por MALDI-TOF MS análisis <ol><li> Cultivar las bacterias de interés (por ejemplo, Myroides odoratimimus) en Colagar sangre Umbia que contiene sangre de caballo 5% a 37 ° C durante 18 a 24 horas, dependiendo de la cepa bacteriana (Figura 2a). Realizar tinción de Gram para verificar el morfotipo del organismo bajo investigación, así como la pureza de la cultura. </li><li> Utilice un palillo de madera para la transferencia de una sola colonia bacteriana a un pocillo de una diana de acero de 96 pocillos (Figura 2b y 2c). Punto 1 l de ácido fórmico al 70% en la parte superior del organismo se secó al aire en la diana de acero y dejar secar durante aproximadamente 2-3 minutos. </li><li> Entonces, superponer el punto con una solución de matriz de 1 l, que contiene 50 mg / ml CHCA (α-ciano-4-hidroxicinámico) en un disolvente orgánico (50% de acetonitrilo, ácido trifluoroacético 2,5%, 47,5% H 2 O). NOTA: El método de superposición de ácido (en el método de preparación de la placa) se puede utilizar para mejorar la calidad de los espectros de masas. Se ha demostrado que para las bacterias Gram-positivas tales como un &quot;ataque ácido&quot; aumenta la puntuación de VAlues de los espectros medidos 45. NOTA: Como alternativa, un sistema de preparación automática de muestras (Tabla de Materiales) se puede usar en el que los puntos de contacto libre de 1 l 70% de solución de ácido fórmico y, después de un primer ciclo de secado, la solución de matriz de 1 l se aplican en el frotis bacteriano. Las muestras se secan a continuación en condiciones estandarizadas a 60% de humedad relativa y están listos para usar para el análisis. </li><li> Deje que el frotis con matriz superpuesta de secado al aire de nuevo durante unos 5 minutos en una campana. Este frotis bacteriana con la matriz aplicada es ahora estable durante muchas horas. NOTA: frotis bacteriana sin matriz puede no ser estable debido a la degradación de proteínas. </li></ol></li><li> Realizar el análisis MS MALDI-TOF <ol><li> Introducción de muestras <ol><li> Abra el software de control de nuestros MMIS Materiales (Tabla). </li><li> Airear el puerto de carga de muestra del espectrómetro de masas pulsando el botón IN / OUT del instrumento. </li><li> Abra la puerta de carga después de un clic e introduzca la placa diana MALDI-TOF MS con la mancha bacteriana seca más la matriz. </li><li> Cerrar el puerto y evacuar de nuevo. Observar al vacío y cuando llega a 4,5 x 10 -6 mbar iniciar la medición. </li></ol></li><li> Análisis de las muestras <ol><li> Abra el software de análisis de nuestros MMIS (Tabla de Materiales) y haga clic en el menú &quot;Archivo&quot;. Seleccione &quot;Nueva clasificación&quot; y un nuevo &quot;asistente de clasificación en tiempo real MALDI Biotyper&quot; ventana se abre. Escriba el nombre del proyecto, por ejemplo &quot;Proyecto_1 medición Myroides, en el campo&quot; Nombre del proyecto &quot;y pulse el botón&quot; Nuevo &quot;. Bajo el nuevo cuadro de diálogo llamado&quot; Nuevo proyecto &quot;nombre del proyecto de verificación y proceder pulsando el botón&quot; OK &quot;. </li><li> En el &quot;asistente de clasificación Biotyper MALDI tiempo real&quot; observar la ventana de &quot;colocación de analitos&quot; abierta. Seleccione posiciones de destino (por ejemplo, A1, A2, A3 ...), haga click cualquier posición seleccionada (indicado por un cuadrado azul) y seleccionar &quot;Añadir muestras&quot;. En la vista de tabla de tipo abierto automáticamente en nombre de la muestra, identificación de la muestra y, opcionalmente, un comentario. Haga clic en el botón &quot;Siguiente&quot; para continuar. </li><li> En el &quot;asistente de clasificación Biotyper MALDI tiempo real&quot; observar la ventana &quot;Selección de métodos MALDI Biotyper&quot; abierta. Seleccione &quot;Bruker Taxonomía&quot; de &quot;proyectos de tamaño mediano de los árboles de la taxonomía&quot; y haga clic en &quot;Siguiente&quot; para continuar. </li><li> En el &quot;asistente de clasificación Biotyper MALDI tiempo real&quot; observar la ventana &quot;Resumen del proyecto&quot; abierto. Compruebe las entradas insertadas dadas anteriormente para el proyecto actual clasificación. Comience la clasificación ejecutar pulsando el botón &quot;Finalizar&quot; (Figura 2d - f). La medición se inicia automáticamente cuando se alcanza el vacío apropiado. </li><li> Siga la carrera de clasificación hasta que la medida se ha realizado correctamente. Ver la tabla de resultados en tque &quot;MALDI Biotyper Realtime Myroides Proyecto de Clasificación de medición Proyecto_1&quot; abrir el menú &quot;Ver&quot; y haga clic en &quot;Resultados&quot;. </li><li> Ver las &quot;Bruker MALDI Daltonics Biotyper Clasificación Resultados&quot; como archivo HTML en el navegador web por defecto. Imprimir y guardar los resultados. </li></ol></li><li> Medir una norma de prueba diariamente antes de análisis de la muestra para calibrar el instrumento y realizar instrumento semanal de validación (instrumento de auto-test). NOTA: Durante la medición MALDI-TOF espectros se analizó en tiempo real por el software de análisis (Tabla de Materiales). Una lista de las diez especies con sus respectivos puntajes se da y se introduce en el sistema de información de laboratorio (LIS) para la presentación de informes. </li><li> Evaluar críticamente los resultados de MALDI-TOF MS (ver resultados representativos) y, en su caso, se incluyen otras pruebas, tales como perfiles de susceptibilidad a los antibióticos y biochemical- o secuenciación del gen 16S rRNA y, si es necesario, para la tinción de Gramla asignación de una especie bacteriana al informe microbiológico. </li></ol></li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Tanto MALDI-TOF MS y la secuenciación de genes 16S rRNA ofrecen la posibilidad de identificar un gran número de diferentes bacterias. MALDI-TOF MS es un método rápido y barato, que es fácil de manejar y de grandes bases de datos de espectros de masa bacteriana están disponibles. Por esta razón, MALDI-TOF MS es un método eficaz y fiable rápida, el costo de llevar a cabo estudios de cribado se centraron en patógenos bacterianos raras 17,20,39,51. En un estudio prospectivo comparando MALDI-TOF MS con otros métod...

Identificación segura de patógenos raras en el diagnóstico de rutina se ve obstaculizada por el hecho de que los métodos de cultivo y bioquímicos clásicos son engorrosos y, a veces cuestionable. Además, un laboratorio de microbiología de diagnóstico tiene que procesar un gran número de patógenos, que van desde unos pocos cientos a varios miles, a diario, lo que requiere el uso de sistemas automatizados. Además de la gestión de un diario de alto rendimiento, se necesita la identificación precisa de especies bacterianas. Esto se justifica ya que difieren en su patrón de susceptibilidad antimicrobiana y, por tanto, la identificación correcta proporciona al médico información esencial para elegir los antibióticos apropiados (por ejemplo, Enterococcus spp., Acinetobacter spp.) 12,43. Sistemas automatizados de identificación microbiana (AMIS) se aplican conjuntos estandarizados de reacciones enzimáticas para caracterizar las propiedades metabólicas de las bacterias aisladas <sup&gt; 13,15,16,26,27. Aunque los cartuchos utilizados en estos sistemas utilizan un gran número de diferentes reacciones bioquímicas, por ejemplo, 47 en la tarjeta de GN de las AMI utilizado en este estudio 52, esta estrategia permite la identificación segura sólo para un conjunto limitado de bacterias. Por otra parte, la base de datos, un sistema experto avanzado, se centra claramente en la detección de bacterias competentes y altamente relevantes de importancia médica 13,15,16,36. Dos sistemas adicionales, se utiliza ampliamente en los laboratorios, se aplican también este enfoque bioquímico para la identificación de bacterias. Estudios recientes demuestran una exactitud de identificación comparables entre los Amis utilizados en este estudio y uno de los competidores (93,7% y 93,0% respectivamente), mientras que la 3ª Amis tiene una precisión identificación de solamente el 82,4% de las especies de nivel 35. Estas discrepancias pueden ser explicadas por la calidad de las referencias de datos de identificación subyacentes, las versiones de los kits y software, las diferencias de metabolismo y la competencia del personal técnico 35,36. Se utilizan principalmente dos sistemas automatizados MALDI-TOF MS (sistema de identificación microbiana MALDI-TOF, MMI). Estos sistemas permiten la detección de un gran número de especies bacterianas en función de su proteína de espectros de masas de huellas dactilares. Por ejemplo, la base de datos de los MMIS utilizados contiene 6.000 espectros de referencia. Sistemas de identificación basados ​​en espectrometría de masas ofrecen una detección rápida y fiable de una gran variedad de microorganismos patógenos incluyendo raras 11,48,51. Hasta la fecha sólo unas pocas comparaciones directas están disponibles entre las MMIS utilizados en este estudio y su competidor 19,33. De acuerdo con DÆK et al. Ambos sistemas proporcionan una alta tasa similar de exactitud de identificación, pero los MMIS utilizados en este estudio parece ser más fiable en la identificación de especies 19. genes distintos Del mismo modo, las técnicas moleculares direccionamiento bien conservadas, sino también ( <em&gt; Por ejemplo, 16S rDNA o rpoB) permiten una clara identificación de las especies 3,22,61. Entre estos, el 16S rDNA es la limpieza de genes más ampliamente utilizado debido a su presencia en todas las bacterias 34. Su función se mantiene sin cambios y, por último, con aproximadamente 1.500 pb, que es el tiempo suficiente para ser adecuado para la bioinformática 14,34. Muchos investigadores consideran que el análisis del gen 16S rRNA como el &quot;estándar de oro&quot; para la identificación de bacterias 21. Esto es debido al hecho de que algunos laboratorios utilizan técnicas de hibridación ADN-ADN hasta la fecha para la identificación de bacterias raras o nuevas 14,34. Además, más y más bases de datos están disponibles, que puede ser utilizado para el análisis de genes 16S rRNA 50. Sin embargo, ha de tenerse en cuenta que los sistemas de detección basados ​​16S rDNA tienen una sensibilidad limitada en comparación con protocolos de PCR estándar. Además, el enfoque molecular es sofisticado, consume tiempo y requiere personal altamente capacitado, así comoinstalaciones de los laboratorios dedicados y es, por lo tanto, no se implementan fácilmente en el diagnóstico de rutina 55. Además, se ha demostrado que la combinación de al menos dos métodos diferentes de identificación bacteriana conduce a la identificación de cepas de alta precisión. La combinación de secuenciación de MALDI-TOF MS y 16S rDNA permite la identificación de un gran número de diferentes especies bacterianas con alta precisión. Recientemente se presentó la combinación de análisis de genes MALDI-TOF MS y 16S ARNr de identificación bacteriana estudiar las cuestiones epidemiológicas y patógenos raros 56.

<table><tbody><tr><td>CHROMASOLV, agua de grado HPLC, 1 L</td><td>Sigma-Aldrich Chemie, M&uuml; nchen, Alemania</td><td>270733</td><td></td></tr><tr><td>Lyser de tejidos LT</td><td>Qiagen, Hilden, Alemania</td><td>85600</td><td>Homogeneizador oscilante</td></tr><tr><td>Perlas de vidrio 1,0 mm</td><td>VWR International, Darmstadt, Alemania</td><td>412-2917</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer 5436</td><td>Eppendorf, Hamburgo, Alemania</td><td>2050-100-05</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit (250)</td><td>Qiagen, Hilden, Alemania</td><td>51306</td><td></td></tr><tr><td>Kit de núcleo de PCR Taq (1.000 U)</td><td>Qiagen, Hilden, Alemania</td><td>201225</td><td></td></tr><tr><td>Imprimación delantera TPU1 (5&acute;-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')</td><td>biomers.net, Ulm, Alemania &nbsp;</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Imprimación inversa RTU4 (5&agudo;-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3&agudo;)</td><td>biomers.net, Ulm, Alemania &nbsp;</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler&nbsp;</td><td>Eppendorf, Hamburgo, Alemania</td><td>-&nbsp;</td><td>Termociclador</td></tr><tr><td>Tubo de reacción 1,5 ml</td><td>SARSTEDT, N&uuml; mbrecht, Alemania</td><td>72.692</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de reacción 2 ml</td><td>SARSTEDT, N&uuml; mbrecht, Alemania</td><td>72.693.005</td><td></td></tr><tr><td>PCR 8er-CapStrips</td><td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Alemania</td><td>711040X</td><td></td></tr><tr><td>PCR 8er-SoftStrips</td><td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Alemania</td><td>711030X</td><td></td></tr><tr><td>Sharp R-ZV11&nbsp;</td><td>Sharp Electronics, Hamburgo,</td> <td>Alemania-Microondas</td><td></td></tr> <tr><td>Titriplex III (EDTA Na2-sal deshidratada; 1 kg)</td><td>Merck, Darmstadt, Alemania</td><td>1084211000</td><td></td></tr><tr><td>SeaKem LE Agarose</td><td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Alemania</td><td>849006</td><td></td></tr><tr><td>SmartLadder SF - 100 a 1.000 bp</td><td>Eurogentec, L&uuml; ttich, Bélgica</td><td>MW-1800-04</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol (25 g)</td><td>Sigma-Aldrich Chemie, M&uuml; nchen, Alemania</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>Xileno cianol FF (10 g)</td><td>Sigma-Aldrich Chemie, M&uuml; nchen, Alemania</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>ComPhor L Maxi&nbsp;</td><td>Biozym, Hessisch Oldendorf,</td> <td>Alemania-Solución</td><td></td></tr> <tr><td>de bromuro de etidio al 1% (10 ml)</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemania</td><td>2218.1</td><td></td></tr><tr><td>Gel Doc 2000</td><td>Bio-Rad Laboratories, M&uuml; nchen,</td><td></td> <td>Alemania-Gel-sistema de documentación&nbsp;</td></tr><tr><td>ExoSAP-IT (500 reacciones)</td><td>Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, Reino Unido</td><td>78201</td><td></td></tr><tr><td>Buffer (10x) con EDTA&nbsp;</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Alemania</td><td>402824 BigDye</td><td></td></tr><tr><td>Terminator Kit v1.1</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Alemania</td><td>4337450</td><td></td></tr><tr><td>Formamida Hi-Di (25 ml)</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Alemania</td><td>4311320</td><td></td></tr><tr><td>Kit de giro DyeEx 2.0 (250)</td><td>Qiagen, Hilden, Alemania</td><td>63206</td><td></td></tr><tr><td>3130 Analizador genético</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Alemania</td><td>-</td><td>Secuenciador</td></tr><tr><td>MicroAmp placa de reacción óptica de 96 pocillos con código de barras</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Alemania</td><td>4306737</td><td></td></tr><tr><td>3130 Analizador genético, base de placa de 96 pocillos</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Alemania</td><td>4317237</td><td></td></tr><tr><td>3130 Analizador genético, retenedor de placa de 96 pocillos</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Alemania</td><td>4317241</td><td></td></tr><tr><td>3130 Analizador genético, pocillo septos de placa</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Alemania</td><td>4315933</td><td></td></tr><tr><td>3130 Analizador Genético, Polímero POP-7, 7 ml</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Alemania</td><td>4352759</td><td></td></tr><tr><td>3130 Analizador Genético, Matriz de 4 Capilares, 50 cm</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Alemania</td><td>4333466</td><td></td></tr><tr><td>Software de análisis de secuenciación 5.4</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Alemania</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>microflex</td><td>Bruker Daltonik, Bremen,</td> <td>Alemania-Nuestro</td> <td>mMIS</td></tr><tr><td>VITEK MS</td><td>bioM&eacute; rieux, N&uuml; rtingen, Alemania &nbsp;</td><td></td><td>2nd mMIS</td></tr><tr><td>flexControl 3.4</td><td>Bruker Daltonik, Bremen,</td> <td>Alemania-Software</td> de <td>control de dispositivos</td></tr><tr><td>Biotyper Realtime Classification 3.1 (RTC)</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, Alemania-Software</td><td></td> de <td>análisis</td></tr><tr><td>&alpha;-ácido ciano-4-hidroxicinámico, HCCA, 1&nbsp; g</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, Alemania</td><td>201344</td><td></td></tr><tr><td>Norma de calibración de péptidos II</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, Alemania</td><td>222570</td><td></td></tr><tr><td>MSP 96 blanco acero pulido</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, Alemania</td><td>8224989</td><td></td></tr><tr><td>peqGREEN</td><td>peqlab&nbsp;</td><td>37-5010</td><td></td></tr><tr><td>MALDI Biotyper Galaxy&nbsp;</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, Alemania</td><td>Nº de pieza 1836007&nbsp;</td><td>Sistema automatizado de preparación de muestras</td></tr><tr><td>Vitek 2&nbsp;</td><td>bioM&eacute; rieux, N&uuml; rtingen, Alemania &nbsp;</td><td></td><td>Nuestro aMIS</td></tr><tr><td>MicroScan&nbsp;</td><td>Beckman Coulter, Krefeld, Alemania</td><td></td><td>2nd aMIS</td></tr><tr><td>BD Phoenix&trade; Sistema Automatizado de Microbiología</td><td>BD, Heidelberg, Alemania</td><td></td><td>3rd aMIS</td></tr><<tr><td>i>Staphylococcus aureus&nbsp;subsp.&nbsp; aureus&nbsp; Rosenbach (ATCC&reg; &nbsp; 25923&comercio;)</td><td>Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), LGC Standards, Molsheim, Francia</td><td></td><td>Control positivo para PCR&nbsp;</td></tr></tbody></table>

la identificación de patógenos bacterianos raras por 16s rrna gen secuenciación y maldi-tof ms

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

Hay un número de patógenos bacterianos raras y, por lo tanto, se ha descrito suficientemente que se presentan para causar infecciones graves, especialmente en pacientes inmunocomprometidos. En la mayoría de los casos, sólo unos pocos datos, publicados en su mayoría como informes de casos, los cuales están disponibles investigar el papel de los agentes patógenos tales como un agente infeccioso. Por lo tanto, con el fin de aclarar el carácter patógeno de tales microorganismos, es necesario llevar a cabo estudios epidemiológicos que incluyen un gran número de estas bacterias. Los métodos utilizados en un estudio de este tipo de vigilancia tienen que cumplir los siguientes criterios: la identificación de las cepas ha de ser precisa, según la nomenclatura válida, deben ser fáciles de manejar (robustez), económico en el diagnóstico de rutina y tienen que generar comparables resultados entre diferentes laboratorios. En general, hay tres estrategias para la identificación de cepas bacterianas en condiciones de rutina: 1) la identificación fenotípica caracterizar la Biochemical y metabólicas propiedades de las bacterias, 2) técnicas moleculares, tales como la secuenciación de genes 16S rRNA y 3) la espectrometría de masas como un enfoque basado en la novela proteoma. Desde espectrometría de masas y enfoques moleculares son las herramientas más prometedoras para la identificación de una gran variedad de especies bacterianas, se describen estos dos métodos. Se discuten los avances, limitaciones y problemas potenciales cuando se utilizan estas técnicas.

MALDI-TOF MS es una novela, método rápido y barato para el diagnóstico de rutina microbiológicos. La identificación de especies bacterianas mediante MALDI-TOF MS produce espectros compuesto principalmente de proteínas ribosomales, sino también otras proteínas muy conservadas &quot;con funciones de mantenimiento de la casa afectadas en grado mínimo y por las condiciones ambientales&quot; .El 17 de la base de datos de este MMIS contiene un amplio conjunto de espectros de referen...

La espectrometría de masas de tiempo de vuelo/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF MS) y las técnicas moleculares (secuenciación del gen 16S rRNA) permiten la identificación de patógenos bacterianos raros en diagnósticos rutinarios. El objetivo de este protocolo radica en la combinación de ambas técnicas que conduce a datos más precisos y confiables.

La identificación de patógenos bacterianos raras por 16S rRNA gen secuenciación y MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

El objetivo general de este protocolo de espectrometría de masas MALDI-TOF es mejorar la tipificación de patógenos raros mediante un procedimiento rápido y rentable. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la microbiología diagnóstica, ya que permite la identificación rápida de patógenos bacterianos poco comunes. Hoy queremos hablar sobre odoratimimus y bacterias del género Myroides.Para demostrar el método y hablar sobre la interpretación de los resultados. Por lo general, las personas nuevas en este método podrían encontrarlo difícil, ya que la transferencia de bacterias, la superposición con métricas y la interpretación de los resultados requieren habilidades técnicas y experiencia microbiológica. Tuvimos por primera vez la idea de utilizar la espectrometría de masas MALDI-TOF para detectar bacterias raras cuando tuvimos un paciente en nuestro hospital que sufría una infección en el pie diabético causada por Myroides odoratimus.Comience este protocolo con la extracción de ADN bacteriano, la PCR del ADN ribosómico 16S y la secuenciación Sanger, tal como se describe en el protocolo escrito. Utilice un palillo de madera para transferir una colonia bacteriana individual a un pocillo de una placa de acero de 96 pocillos. Añada un microlitro de ácido fórmico al 70 % encima del organismo secado al aire sobre el soporte de acero y deje secar durante aproximadamente dos a tres minutos.Cubra el punto con un microlitro de solución de matriz que contenga 50 mg/ml de CHCA en un disolvente orgánico compuesto por 50% acetonitrilo, 2,5% ácido trifluoroacético y 47,5% agua. Deje secar al aire durante aproximadamente cinco minutos en una campana el frotis y la matriz superpuesta. Para introducir las muestras, ventile el puerto de carga de la muestra del espectrómetro de masas presionando el botón de entrada/salida del instrumento.Abra el puerto de carga e inserte la placa objetivo del MS MALDI-TOF con la muestra bacteriana seca más el matriz. Cierre el puerto y vuelva a evacuar. Observe el vacío y, cuando alcance 4,5 millones de milibar, inicie la medición.Abra el software de análisis MMIS y haga clic en el menú Archivo. Seleccione "Nueva clasificación" y se debería abrir una nueva ventana llamada "Asistente de clasificación en tiempo real del analizador MALDI Biotyper". Escriba el nombre del proyecto en el campo "Nombre del proyecto" y haga clic en "Nuevo". En el nuevo cuadro de diálogo llamado "Nuevo proyecto", verifique el nombre del proyecto y continúe haciendo clic en el botón "Aceptar".En el Asistente de Clasificación en Tiempo Real del MALDI Biotyper, observe la ventana de colocación del analito. Seleccione las posiciones objetivo, haga clic derecho en cualquier posición seleccionada y seleccione Agregar muestras. En la vista de tabla que se abre automáticamente, escriba el nombre de la muestra, el ID de la muestra y, opcionalmente, un comentario.Haga clic en el botón Siguiente para continuar. A continuación, observe la ventana de selección de métodos de MALDI Biotyper. Seleccione Bruker Taxonomy" de MSPs from Taxonomy Trees y haga clic en Siguiente para continuar.Luego, observe la ventana de resumen del proyecto. Verifique las entradas insertadas anteriores para el proyecto de clasificación actual. Inicie la ejecución de clasificación haciendo clic en el botón Finalizar.Las mediciones comienzan automáticamente cuando se alcanza el vacío adecuado. Siga la ejecución de la clasificación hasta que la medición finalice correctamente. Una vez completada la medición, abra el menú "Ver" y haga clic en "Resultados" para ver la tabla de resultados en el Proyecto de Clasificación en Tiempo Real del MALDI Biotyper Uno.Ver los resultados de clasificación del Bruker-Daltonik MALDI Biotyper como un archivo html en el navegador web predeterminado. Imprima y guarde los resultados. Aquí se muestran los espectros obtenidos mediante MALDI-TOF MS que se miden y clasifican en tiempo real.A los espectros se les asigna un nombre de especie y un valor de puntuación que refleja la calidad de la medición. Las puntuaciones superiores a 2.300 representan una identificación de especie altamente probable. Una puntuación entre 2.000 y 2.300 indica una identificación segura de la especie.Un puntaje inferior a 1.700 y 2.000 indica una identificación probable de especie. Y un puntaje inferior a 1.700 no es confiable. La identificación de patógenos bacterianos cultivados en cultivo puro en un medio sólido lleva de dos a tres minutos.Es importante recordar que los patógenos bacterianos raros solo pueden identificarse mediante MALDI-TOF MS cuando los equipos cuentan de forma confiable con los espectros adecuados. De lo contrario, debe corregirse mediante la integración de espectros MaSDA de cepas tipificadas de sus aislados caracterizados. En los casos en que los resultados de puntuación no conduzcan a una identificación inequívoca de la cepa, pueden aplicarse métodos adicionales, como el perfilado bioquímico o la secuenciación del gen 16S rDNA.Aunque este método puede proporcionar información sobre la detección bacteriana, también puede aplicarse a otros microorganismos como hongos o anaerobios. Además, se puede medir la resistencia bacteriana. No olvide trabajar con una matriz que es una sustancia peligrosa, use guantes, gafas protectoras y trabaje bajo una campana extractora.Además, es absolutamente necesario secar bien la matriz y extenderla completamente para evitar salpicaduras en la cámara de análisis.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

La aplicación de láser asistida por matriz de desorción / ionización tiempo de vuelo (MALDI-TOF) espectrometría de masas (MS) directamente a caldo de cultivo de sangre acelera la identificación de bacterias. El método presentado es un método rápido y fiable para la identificación de bacterias Gram negativas directamente desde el caldo de cultivo de sangre.

La identificación rápida de bacterias gram negativas de Cultura sangre caldo de cultivo utilizando MALDI-TOF espectrometría de masas

Este trabajo detalla los procedimientos para la identificación rápida de bacterias utilizando MALDI-TOF MS. Los procedimientos de identificación incluyen la adquisición del espectro, la construcción de bases de datos y los análisis de seguimiento. Se presentan dos métodos de identificación, el basado en coeficientes de similitud y el método basado en biomarcadores.

El uso de MALDI-TOF espectrometría de masas y una base de datos personalizada para caracterizar bacterias indígenas a una cueva entorno único (Kartchner Cavernas, AZ, EE.UU.)

Se utilizó phyloproteomics basados en espectrometría de masas (MSPP) para escribir una colección de Campylobacter jejuni ssp. Doylei aislamientos a nivel de cepa en comparación con la tipificación de secuencia de multilocus (MLST).

subtipificación de<em&gt; Campylobacter jejuni</em&gt; Ssp.<em&gt; doylei</em&gt; El uso de aislamientos PhyloProteomics basados ​​en espectrometría de masas (MSPP)

Este manuscrito describe un detallado protocolo estandarizado de secuenciación de amplicones de rRNA 16S de alto rendimiento. El protocolo presenta un protocolo integrado, uniformado, factible y de bajo costo a partir de la recolección de muestras fecales a través de análisis de datos. Este protocolo permite el análisis de un gran número de muestras con estándares rigurosos y varios controles.

Protocolo guía para caracterización microbiana Fecal por secuencia de 16S rRNA-productos

IDBac es una tubería bioinformática basada en espectrometría de masas de código abierto que integra datos de espectros de proteínas intactos y metabolitos especializados, recogidos en material celular raspado de colonias bacterianas. La tubería permite a los investigadores organizar rápidamente cientos a miles de colonias bacterianas en grupos taxonómicos putativos, y diferenciarlos aún más en función de la producción especializada de metabolitos.

Uso de la tubería de código abierto MALDI TOF-MS IDBac para el análisis de datos de proteínas microbianas y metabolitos especializados

Aquí se describe un procedimiento operativo estándar simplificado para la elaboración de perfiles de microbiomas mediante la secuenciación y el análisis metagenómicos de 16S rRNA utilizando herramientas disponibles gratuitamente. Este protocolo ayudará a los investigadores que son nuevos en el campo del microbioma, así como aquellos que requieren actualizaciones sobre los métodos para lograr el perfilado bacteriano a una resolución más alta.

Análisis de microbiota utilizando PCR de dos pasos y secuenciación genética de rRNA 16S de próxima generación

Aquí presentamos un protocolo para la identificación rápida de proteínas producidas por bacterias patógenas secuenciadas genómicamente utilizando espectrometría de masas en tándem MALDI-TOF-TOF y análisis proteómico de arriba hacia abajo con software desarrollado internamente. Los iones proteicos metaestables se fragmentan debido al efecto del ácido aspártico y esta especificidad se explota para la identificación de proteínas.

Identificación de proteínas de inmunidad antibacteriana en Escherichia coli utilizando MALDI-TOF-TOF-MS/MS y análisis proteómico de arriba hacia abajo

Este protocolo permite una evaluación rápida y rentable de la composición microbiana en los productos lácteos mediante la combinación de la culturomica con MALDI-TOF MS. Ofrece resultados de taxonomía comparables a la secuenciación de ARNr 16S con un tiempo de respuesta más corto que los métodos de cultivo tradicionales.

Evaluación de la seguridad microbiana de las lecherías mediante perfiles proteómicos bacterianos mediante el enfoque MALDI

Un método simple para la identificación de los patógenos bacterianos prioridad es el uso de fagos reportero de la ingeniería genética. Estos fagos reportero, que son específicos de su especie huésped particular, son capaces de transducir una respuesta rápida de la señal bioluminiscente a las células huésped. En este documento, se describe el uso de fagos reportero para la detección...

&quot;Bioluminiscente &#39;reportero fagos para la detección de patógenos bacterianos de la categoría A

Embriones de pez cebra transparentes han demostrado ser útiles los ejércitos de modelo para visualizar y las interacciones funcionales de estudio entre las células inmunes y los patógenos bacterianos intracelulares, tales...

La infección de embriones de pez cebra con patógenos bacterianos intracelulares

Aprende a identificar patógenos bacterianos raros mediante espectrometría de masas MALDI-TOF y secuenciación del gen 16S rRNA. Este método rápido y rentable mejora el diagnóstico microbiológico clínico.

La identificación de patógenos bacterianos raras por 16S rRNA gen secuenciación y MALDI-TOF MS

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