La identificación de patógenos bacterianos raras por 16S rRNA gen secuenciación y MALDI-TOF MS
11 de julio de 2016
La espectrometría de masas de tiempo de vuelo/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF MS) y las técnicas moleculares (secuenciación del gen 16S rRNA) permiten la identificación de patógenos bacterianos raros en diagnósticos rutinarios. El objetivo de este protocolo radica en la combinación de ambas técnicas que conduce a datos más precisos y confiables.
El objetivo general de este protocolo de espectrometría de masas MALDI-TOF es mejorar la tipificación de patógenos raros a través de un procedimiento rápido y rentable. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la microbiología diagnóstica, ya que permite una rápida edificación de patógenos bacterianos raros. Hoy queremos hablar de los odoratimimus y las bacterias del género Myroides.
Demostrar el método y hablar sobre la interpretación de los resultados. Por lo general, las personas nuevas en este método pueden encontrarlo difícil, ya que la transferencia de bacterias, la superposición de métricas y la interpretación de los resultados requieren habilidades técnicas y experiencia microbiológica. La primera vez que tuvimos la idea de utilizar MALD-TOF MS para detectar bacterias raras fue cuando tuvimos un paciente en nuestro hospital que sufría una infección alimentaria diabética causada por myroides odoratimus.
Comience este protocolo con la extracción de ADN bacteriano, PCR de ADN ribosómico 16S y secuenciación de Sanger como se describe en el protocolo de texto. Use un palillo de dientes de madera para transferir una sola colonia bacteriana a un pocillo de un objetivo de acero de 96 pocillos. Coloque un microlitro de ácido fórmico al 70% sobre el organismo secado al aire en el objetivo de acero y déjelo secar durante aproximadamente dos o tres minutos.
Superponga la mancha con un microlitro de solución de matriz que contenga 50 mg/ml de CHCA en un disolvente orgánico compuesto por 50% de acetonitrilo, 2,5 ácido trifluoroacético y 47,5% de agua. Deje que el frotis y la matriz superpuesta se sequen al aire durante unos cinco minutos en una campana. Para introducir las muestras, airee el puerto de carga de muestras del espectrómetro de masas pulsando el botón de entrada/salida del instrumento.
Abra el puerto de carga e inserte la placa de destino MALDI-TOF MS con la matriz de frotis bacteriano seca plus. Cierre el puerto y evacúe de nuevo. Observe el vacío y cuando alcance los 4,5 millones de milibares inicie la medición.
Abra el software de análisis MMIS y haga clic en el menú de archivos. Seleccione "Nueva clasificación" y se abrirá una nueva ventana llamada MALDI Biotyper Real Time Classification Wizard. Escriba el nombre del proyecto en el campo Nombre del proyecto "y haga clic en Nuevo, en el nuevo cuadro de diálogo llamado Nuevo proyecto, verifique el nombre del proyecto y proceda haciendo clic en el botón Aceptar".
En el Asistente de clasificación en tiempo real de MALDI Biotyper, observe la ventana de colocación del analito. Seleccione las posiciones de destino, haga clic con el botón derecho en cualquier posición seleccionada y seleccione Agregar muestras. En la vista de tabla que se abre automáticamente, escriba el nombre de la muestra, el ID de la muestra y, opcionalmente, un comentario.
Haga clic en el botón "Siguiente" para continuar. A continuación, observe la ventana de selección de métodos de MALDI Biotyper. Seleccione "Taxonomía Bruker" de los MSP de Árboles de taxonomía y haga clic en Siguiente" para continuar.
A continuación, observe la ventana de resumen del proyecto. Verifique las entradas insertadas que se dan arriba para el proyecto de clasificación real. Inicie la ejecución de la clasificación haciendo clic en el botón "Finalizar".
Las mediciones se inician automáticamente cuando se alcanza el vacío adecuado. Siga la ejecución de la clasificación hasta que la medición se complete con éxito. Una vez completada la medición, abra el menú "Ver" y haga clic en "Resultados" para ver la tabla de resultados en el Proyecto Uno de Clasificación en Tiempo Real de MALDI Biotyper.
Vea los resultados de la clasificación de Bruker-Daltonik MALDI Biotyper como un archivo html en el navegador web predeterminado. Imprima y guarde los resultados. Aquí se muestran los espectros obtenidos por MALDI-TOF MS que se miden y clasifican en tiempo real.
A los espectros se les asigna un nombre de especie y un valor de puntuación que refleja la calidad de la medición. Las puntuaciones superiores a 2.300 representan una identificación de especie altamente probable. Una puntuación entre 2.000 y 2.300 indica una identificación segura de la especie.
Una puntuación inferior a 1.700 y 2.000 designa una probable identificación de la especie. Y una puntuación por debajo de 1.700 no es fiable. La identificación de patógenos bacterianos cultivados en un cultivo puro en un medio sólido tarda de dos a tres minutos.
Es importante recordar que los patógenos de bacterias raras solo se pueden encontrar con MALDI-TOF MS cuando los instrumentos contienen de manera confiable los espectros apropiados. De lo contrario, debe eliminarse mediante la integración de espectros MaSDA de cepas tipificadas de sus aislados caracterizados. En el caso de que los resultados de la puntuación no conduzcan a una identificación inequívoca de la cepa, se pueden aplicar otros métodos, como el perfil bioquímico o la secuenciación del ADNr 16S.
Aunque este método puede proporcionar información sobre la detección de bacterias, también se puede aplicar a otros microorganismos como hongos o anaerobios. Además, se puede medir la resistencia de las bacterias. No olvide trabajar con una matriz que es una sustancia peligrosa, use guantes, gafas protectoras y trabaje bajo una capucha.
Además, es absolutamente necesario secar la matriz y untar a fondo para evitar salpicaduras en la cámara de análisis.
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Resumen
Este protocolo describe el uso de la espectrometría de masas MALDI-TOF para mejorar la identificación de patógenos bacterianos raros. Al integrar este método con técnicas moleculares, los investigadores pueden lograr diagnósticos más precisos en microbiología.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Microbiología
- Técnicas de diagnóstico
- Identificación de patógenos
Antecedentes
- La MS MALDI-TOF es una herramienta poderosa para la tipificación de patógenos.
- Los patógenos bacterianos raros representan desafíos en el diagnóstico de rutina.
- Es fundamental comprender las limitaciones de los métodos tradicionales.
- Se requieren habilidades técnicas para una implementación eficaz.
Objetivo del estudio
- Mejorar la identificación de patógenos raros.
- Proporcionar un procedimiento diagnóstico rápido y rentable.
- Mostrar el método utilizando ejemplos bacterianos específicos.
Métodos Utilizados
- Espectrometría de masas MALDI-TOF para cribado de patógenos.
- Secuenciación del gen 16S rRNA para identificación molecular.
- Procedimientos técnicos para transferencia y recubrimiento bacteriano.
- Interpretación de los resultados de espectrometría de masas.
Resultados principales
- Identificación exitosa de Myroides odoratimimus.
- Se demostraron diagnósticos rápidos para patógenos raros.
- Se destacó la importancia de la experiencia técnica.
- Se aportaron conocimientos sobre la aplicabilidad del método en entornos clínicos.
Conclusiones
- La MS de MALDI-TOF combinada con técnicas moleculares mejora los diagnósticos.
- La capacitación es esencial para el uso efectivo del método.
- Las aplicaciones futuras podrían ampliar el alcance de la identificación de patógenos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La identificación precisa de patógenos bacterianos raros es fundamental para la microbiología diagnóstica en la I+D de biofármacos, especialmente en poblaciones de pacientes inmunocomprometidos. La integración de la espectrometría de masas MALDI-TOF con la secuenciación del ARNr 16S permite una identificación rápida y rentable a nivel de especie, apoyando la reducción de riesgos mecanicistas en la validación de dianas antimicrobianas. Este enfoque combinado mejora la confianza predictiva en modelos preclínicos al reducir los falsos negativos en la detección de patógenos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la confirmación de la identidad de patógenos raros en modelos de infección.
- Valor operativo: Proporciona una identificación robusta de cepas conforme a la nomenclatura, esencial para la desactivación de riesgos del blanco de forma reproducible.
- Valor predictivo: Apoya la selección de carteras mediante la caracterización precisa de patógenos en sistemas relevantes para la enfermedad.
Desarrollo de pruebas y cribado
- Valor científico: Genera resultados cuantitativos (por ejemplo, >2.300 para una identificación altamente probable) que permiten la confirmación estandarizada de aciertos en cribados antimicrobianos.
- Valor operativo: Facilita la disponibilidad del ensayo mediante la identificación rápida (<3 min) a partir de cultivos puros, mejorando la capacidad de procesamiento y escalabilidad del cribado.
- Valor de reproducibilidad: Asegura la comparabilidad entre laboratorios mediante el emparejamiento estandarizado de espectros y el uso de bases de datos validadas.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Conecta el descubrimiento con la continuidad preclínica mediante la validación de patógenos raros en modelos de infección clínicamente relevantes.
- Valor operativo: Permite tomar decisiones de avance ajustadas al riesgo cuando los umbrales de puntuación (2.000–2.300) confirman la identificación segura de especies.
- Continuidad traslacional: Facilita la alineación de biomarcadores cuando la presencia del patógeno se correlaciona con la respuesta del huésped en modelos inmunocomprometidos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se encaja dentro del continuo de descubrimiento que va desde la validación del blanco hasta la evaluación preclínica, donde la identificación precisa del patógeno informa los estudios mecanicistas y la evaluación del compuesto principal.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la confirmación de agentes bacterianos raros en modelos de infección, reduciendo la ambigüedad mecanicista.
- Detección: Proporciona sistemas biológicos validados y listos para ensayos con resultados cuantitativos para una evaluación fiable de compuestos.
- Análisis: Ofrece lecturas basadas en puntuaciones (por ejemplo, clasificación mediante MALDI Biotyper) que permiten comparaciones objetivas entre condiciones y la validación de resultados positivos.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica mediante la validación de patógenos en sistemas relevantes para la enfermedad, solo cuando existe respaldo en el material fuente.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una capacidad diagnóstica reutilizable en múltiples proyectos de patógenos raros, reduciendo esfuerzos redundantes de validación.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la validación de objetivos, reducción de asignaciones erróneas de patógenos y mitigación mecanicista de riesgos.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad de la identificación de patógenos entre laboratorios.
- Valor estratégico: Mejora en las decisiones de avance o interrupción en programas antimicrobianos, eficiencia del capital mediante diagnósticos rápidos y reducción del riesgo biológico en fases avanzadas.
- Impacto en la cartera: Priorización basada en riesgos de candidatos antimicrobianos utilizando identidades confirmadas de patógenos en modelos preclínicos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia microbiológica en la transferencia bacteriana, la superposición de matriz y la interpretación de resultados.
- Depende de instrumentación MALDI-TOF MS con bases de datos taxonómicas actualizadas (por ejemplo, Bruker Taxonomy) para una coincidencia espectral precisa.
- Necesita protocolos estandarizados de preparación de muestras para asegurar una matriz y una extensión secas, evitando la contaminación del analizador.
- Requiere recurrir a la secuenciación del ARNr 16S o al perfilado bioquímico cuando los puntajes MALDI-TOF son inferiores a 1.700 para identificaciones no confiables.
- Incluye protocolos de seguridad para manipular soluciones de matriz peligrosas (por ejemplo, ácido fórmico, acetonitrilo) bajo campana extractora y con EPP.
