La identificación de patógenos bacterianos raras por 16S rRNA gen secuenciación y MALDI-TOF MS

El objetivo general de este protocolo de espectrometría de masas MALDI-TOF es mejorar la tipificación de patógenos raros a través de un procedimiento rápido y rentable. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la microbiología diagnóstica, ya que permite una rápida edificación de patógenos bacterianos raros. Hoy queremos hablar de los odoratimimus y las bacterias del género Myroides.

Demostrar el método y hablar sobre la interpretación de los resultados. Por lo general, las personas nuevas en este método pueden encontrarlo difícil, ya que la transferencia de bacterias, la superposición de métricas y la interpretación de los resultados requieren habilidades técnicas y experiencia microbiológica. La primera vez que tuvimos la idea de utilizar MALD-TOF MS para detectar bacterias raras fue cuando tuvimos un paciente en nuestro hospital que sufría una infección alimentaria diabética causada por myroides odoratimus.

Comience este protocolo con la extracción de ADN bacteriano, PCR de ADN ribosómico 16S y secuenciación de Sanger como se describe en el protocolo de texto. Use un palillo de dientes de madera para transferir una sola colonia bacteriana a un pocillo de un objetivo de acero de 96 pocillos. Coloque un microlitro de ácido fórmico al 70% sobre el organismo secado al aire en el objetivo de acero y déjelo secar durante aproximadamente dos o tres minutos.

Superponga la mancha con un microlitro de solución de matriz que contenga 50 mg/ml de CHCA en un disolvente orgánico compuesto por 50% de acetonitrilo, 2,5 ácido trifluoroacético y 47,5% de agua. Deje que el frotis y la matriz superpuesta se sequen al aire durante unos cinco minutos en una campana. Para introducir las muestras, airee el puerto de carga de muestras del espectrómetro de masas pulsando el botón de entrada/salida del instrumento.

Abra el puerto de carga e inserte la placa de destino MALDI-TOF MS con la matriz de frotis bacteriano seca plus. Cierre el puerto y evacúe de nuevo. Observe el vacío y cuando alcance los 4,5 millones de milibares inicie la medición.

Abra el software de análisis MMIS y haga clic en el menú de archivos. Seleccione "Nueva clasificación" y se abrirá una nueva ventana llamada MALDI Biotyper Real Time Classification Wizard. Escriba el nombre del proyecto en el campo Nombre del proyecto "y haga clic en Nuevo, en el nuevo cuadro de diálogo llamado Nuevo proyecto, verifique el nombre del proyecto y proceda haciendo clic en el botón Aceptar".

En el Asistente de clasificación en tiempo real de MALDI Biotyper, observe la ventana de colocación del analito. Seleccione las posiciones de destino, haga clic con el botón derecho en cualquier posición seleccionada y seleccione Agregar muestras. En la vista de tabla que se abre automáticamente, escriba el nombre de la muestra, el ID de la muestra y, opcionalmente, un comentario.

Haga clic en el botón "Siguiente" para continuar. A continuación, observe la ventana de selección de métodos de MALDI Biotyper. Seleccione "Taxonomía Bruker" de los MSP de Árboles de taxonomía y haga clic en Siguiente" para continuar.

A continuación, observe la ventana de resumen del proyecto. Verifique las entradas insertadas que se dan arriba para el proyecto de clasificación real. Inicie la ejecución de la clasificación haciendo clic en el botón "Finalizar".

Las mediciones se inician automáticamente cuando se alcanza el vacío adecuado. Siga la ejecución de la clasificación hasta que la medición se complete con éxito. Una vez completada la medición, abra el menú "Ver" y haga clic en "Resultados" para ver la tabla de resultados en el Proyecto Uno de Clasificación en Tiempo Real de MALDI Biotyper.

Vea los resultados de la clasificación de Bruker-Daltonik MALDI Biotyper como un archivo html en el navegador web predeterminado. Imprima y guarde los resultados. Aquí se muestran los espectros obtenidos por MALDI-TOF MS que se miden y clasifican en tiempo real.

A los espectros se les asigna un nombre de especie y un valor de puntuación que refleja la calidad de la medición. Las puntuaciones superiores a 2.300 representan una identificación de especie altamente probable. Una puntuación entre 2.000 y 2.300 indica una identificación segura de la especie.

Una puntuación inferior a 1.700 y 2.000 designa una probable identificación de la especie. Y una puntuación por debajo de 1.700 no es fiable. La identificación de patógenos bacterianos cultivados en un cultivo puro en un medio sólido tarda de dos a tres minutos.

Es importante recordar que los patógenos de bacterias raras solo se pueden encontrar con MALDI-TOF MS cuando los instrumentos contienen de manera confiable los espectros apropiados. De lo contrario, debe eliminarse mediante la integración de espectros MaSDA de cepas tipificadas de sus aislados caracterizados. En el caso de que los resultados de la puntuación no conduzcan a una identificación inequívoca de la cepa, se pueden aplicar otros métodos, como el perfil bioquímico o la secuenciación del ADNr 16S.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la detección de bacterias, también se puede aplicar a otros microorganismos como hongos o anaerobios. Además, se puede medir la resistencia de las bacterias. No olvide trabajar con una matriz que es una sustancia peligrosa, use guantes, gafas protectoras y trabaje bajo una capucha.

Además, es absolutamente necesario secar la matriz y untar a fondo para evitar salpicaduras en la cámara de análisis.