Gen bacteriano y Análisis de Expresión El uso de microarrays

Hola, mi nombre es Ena y rutinariamente hacemos perfiles de expresión génica en el laboratorio. Y usamos esta técnica para monitorear genes diferenciales regulados entre la metanfetamina y el tipo salvaje. Y hoy tengo un tipo salvaje y muestras de ARN de metanfetamina y todos hacemos C primero.

Utilizamos un método de etiquetado indirecto y la ventaja de esta técnica es evitar el sesgo ocular que puede ocurrir en el etiquetado directo. Y para ello disponemos de muestras de ARN y optamos por obtener tres microgramos de ARN en 13 microlitros de volumen total. Y añadimos 2,5 micro de he aleatorio en nuestros parques.

E incubaremos la muestra a siete y cinco grados para tener la naturaleza del ARN durante ocho minutos. Y ahora agregaremos el, agregaremos un cóctel de transcripción inversa que contiene AM L-D-L-D-U-T-P mezcla continua, tampón de transcriptasa inversa y también ET TT Big it down E incubar la muestra a 42 grados durante cuatro horas. Así que después de cuatro horas simplemente sacamos las muestras.

Y ahora en el tubo tenemos una mezcla de CDNA y ARN. Y lo que queremos hacer es hacer ARN hidrox agregando hidróxido de sodio y EDTA y la concentración final para el hidróxido de sodio debe ser de cien molares. Y la concentración final para e BT debe ser de cinco molares.

Y ahora incubaremos las muestras a un baño de agua a 65 grados durante 10 minutos. Así que la incubación está terminada y utilizaremos las muestras añadiendo un pH de siete montones de agua a la concentración final de 500 molares. En este punto, puede almacenar las muestras a menos 20 o puede continuar con la limpieza.

Para la limpieza del CDNA, utilizamos el kit de purificación KaiGen PCR. Sin embargo, dado que el tampón de arbustos y el tampón de iones contienen liberación, no lo hacemos, preparamos nuestro propio tampón de arbustos del destino y el tampón de iones del destino y agregará 300 litros de PPI y canalizaremos ese estanque lentamente hasta que transfiera la mezcla en columnas Y girará durante un minuto a la velocidad más alta Y observará el, el tampón que preparamos. Tampón de lavado de fosfato, agregará 750 microlitros y así, y agregará otro Para uno nuevamente.

Así que volveremos a girar para asegurarnos de que nos hemos ido a la cama. Y transferiremos estos tubos a tubos vacíos para infractores. Y agregaré 30 marcadores de tampón pho fosfato E, que son cuatro cuatro molares de fosfato de potasio a pH 8.5.

Y aquí sólo tienes que asegurarte de añadir todo en el centro de la columna y vas a incubar a temperatura ambiente durante un minuto. Así que volverá a girar durante un minuto y añadiré otros 30 micro tampón cero que incube o dormitorio. Así que quito la columna y tenemos un volumen total de 60 micros o CDA.

Una vez que limpiamos el CDNA, puedes, puedes almacenarlo a menos 20 grados y también podemos secarlo y luego almacenarlo para que podamos secar el CDNA en retroalimentación. Así que ahora en el tubo tenemos CDA seco, que está modificado. Y lo que haremos es suspender la muestra seca.

Suspenderé la muestra en 10 turas de bicarbonato 15 LAR a pH nueve. Y lo haré subiendo y bajando en este paso, es muy importante recuperar el ADNc. Bueno, para comprar la reacción de la corporación al trabajo, esta reacción debe tener lugar en el cuarto oscuro porque las etiquetas fluorescentes son sensibles a la muerte.

Sin embargo, los optando por estas ciencias de la vida y están, vinieron en paquetes individuales. S cinco tiene gorra morada y el lado tres tiene tapa naranja y también S cinco aparece Sion cuando se está suspendiendo y Cary aparece magenta. Así que lo que haré en el cuarto oscuro es transferir estas muestras a tubos de tinte, volveré a suspender el tinte y las transferiré de nuevo al tubo que tengo.

Y luego incubaré en la oscuridad durante dos horas, después de dos horas de incubación, estas detienen la reacción agregando 35 re de acetato de sodio de cien milimolares a pH 5.2. Y después de eso, limpiamos con el procedimiento de limpieza similar. Sin embargo, esta vez utilizamos el tampón de lavado y el tampón de elución proporcionados por el cajún.

Puede describir los lugares en los que colocó la muestra y que deberían limpiar el instrumento. Así que puedes tu muestra o tu mezcla ahora mismo I To, Así que esta es mi muestra etiquetada con ciencia ficción y aquí lo que vemos es OD dos 60, que muestra el contenido de CDA y OD six 50, que muestra la incorporación de D para ciencia ficción. Y aquí está mi muestra de etiqueta del lado tres.

De nuevo, tuerce seis concentración y cinco 50 compases sitio tres incorporación. Dado que mi corporación D trabaja de manera eficiente, combinaré muestras ahora, Sra. Lo extraño brevemente. Y ahora volveremos a escribir un ejemplo utilizando los comentarios.

Bien, para la ización del tobogán, rehidrataremos colocando universalmente el tobogán encima del agua y eso hará que las manchas sean más grandes. Y luego, para proteger eso, simplemente secaremos a cien grados centígrados y luego hibridaremos con UV o reticulación cruzada UV en el portaobjetos y luego incubaremos en el tampón pre alto que tenemos. Así que coloco el tobogán boca abajo, pero aún no toca el agua.

Y esperaremos así cinco minutos. Así que esta caja parece más grande, deberían ser más brillantes que antes de que la pusieras, y simplemente se secará poniendo la corredera a cien grados y observarás si hay condensación. Y nos conectaremos con ustedi.

Entonces, para hidratarse, sumergiré el tobogán en el agua de antes de la guerra. Y esto debería ser muy rápido porque el objetivo aquí es deshacerse de todas las manchas o todos los oligonucleótidos en el lugar que no están vinculados. Y si vas despacio en este proceso, solo obtendrás com tails en tus spots.

Así que solo asegúrate de que realmente lo estás haciendo rápido y asegúrate de que no tomes tu vuelo fuera del agua y hacer esto cosas durante 30 segundos y simplemente fut inmediatamente a temperatura ambiente durante cinco minutos y 700 pm aire Consigue esto, colocamos esta corredera en el tampón de la estación de tuberías de antes de la guerra que teníamos Y empujando lentamente la corredera en el frasco y vamos a incubar esto a 42 grados durante al Al menos 45 minutos. Así que aquí tenemos nuestra muestra seca para ser hibridada. Así que primero vamos a suspender Resus en el agua.

En este paso simplemente resus suspendemos pasando hacia arriba y hacia abajo y posiblemente no expongamos la muestra demasiado blanca, blanca. Y luego agregarás el ADN del esperma de alguien 1.5 y la concentración es de 10 miligramos por mil. Y agregará 1.2 comercializador de TRNA.

La concentración es de 12,5 miligramos por, añadimos ARNt y ADN de espermatozoides para bloquear el hidro inespecífico. Y añadimos 5,35 marcador cero tres XSSC, lo que da una concentración final de tres x. Y por último añadimos 3,5 microlitros de 1%SDS.

Ahora herviremos la mezcla durante cinco minutos y giraremos a máxima velocidad durante cinco minutos y estará listo para tener eso. Ha pasado una hora desde que incubamos nuestro portaobjetos y ahora mismo tengo agua e isopropanol. Así que primero agitaré el portaobjetos en agua para deshacerme de la SDS y luego lavaré su dza propanol y lo pondré directamente en el calibre estándar.

Y aquí, solo ten cuidado de no exponer demasiado la luz al aire para evitar que se seque. Así que voy directamente del amortiguador de la estación de daño al agua y lavamos el tobogán. Un par de minutos, solo asegúrate de que el movimiento sea solo hacia arriba y hacia abajo, no hacia los lados.

Y también asegúrese de que el tobogán no esté por encima del agua y lo transferiremos a isopropanol de inmediato. Y se queda aquí por un par de minutos otra vez. ¿Y podría su página responder a su página a temperatura ambiente durante cinco minutos?

700 R.Frío. Por lo tanto, nuestra corredera también está lista para ser hibridada y es mejor si la guarda en una caja de corredera para protegerla del autobús. Entonces, para la estación de cosecha usaremos elevación o deslizamiento.

Hay tiras blancas en el cubreobjetos y proporcionarán algo de elevación y espacio para que nuestra muestra vaya entre el cubreobjetos y el portaobjetos. Y lo limpio con etanol y luego coloco el alambre y me aseguro de que no haya ninguna partícula de prueba. Así que primero cogeremos nuestra diapositiva de plantilla que tenemos marcada en el área de impresión, y encima de ella pondremos la diapositiva que hemos preparado y nos aseguraremos de que se alinean perfectamente.

Asegúrate de que se alineen perfectamente. Y hay que asegurarse de que las tiras están en el costado, que vamos a ponerlas boca abajo. Así que es muy difícil de ver, pero asegúrate de que puedas verlo.

Y las rayas deben estar en los lados de las correderas. Y cargaremos nuestra muestra por los lados. Tomo pequeñas cantidades de muestra, así que primero tomo 15 microlitros y empiezo a cargar desde la esquina de la tapa.

Y poco a poco lo tiraba hacia adentro y me movía a lo largo del borde para cubrir toda el área. En esta etapa es muy importante no introducir ninguna burbuja y tomo otro migrador de 15 y lo aplico a los lados de los portaobjetos para evitar que se sequen. Por lo tanto, nuestra muestra está lista y usted incubará nuestros portaobjetos y cámaras de priorización, que tienen micro canales para hidratar el portaobjetos mientras se hibrida.

Y agregaremos 10 comercializadores de tres XSSC en seis esquinas de la diapositiva. Había seis lugares en la, en la cámara, lo siento, en cada esquina yo, y a cada lado, asegúrese de transferir la corredera muy suavemente para que el cubreobjetos no se escape. Y cuando pongas la corredera con el lado derecho hacia arriba, verás que se va a apilar, se va a pegar al agua que pones y vas a poner la tapa y te aseguras de que los tornillos están apretados.

Incubaremos la cámara de conversación a una bolsa de agua a 65 grados, pero no queremos ponerla directamente en el fondo. Así que simplemente colocamos una especie de barrera de plástico para evitar la transferencia excesiva de calor. Y colocamos nuestra cámara de ización suavemente y para evitar cualquier desplazamiento, también puedes poner algún tipo de peso.

Y esta incubación durará toda la noche, normalmente entre 10 y 12 horas. Por lo tanto, para el lavado de la loncha, utilizamos un XSSC con una SDS del 0,05 por ciento. Esto va a ser para quitar el cubreobjetos.

Y esto va a ser para lavar el primer paso. Y haremos dos pasos más solo con 0.06%six XSC a través de toda la SDS que tenemos. Así que todos jodemos la conversación y tomamos diapositivas y las ponemos boca abajo en un recipiente de bolso.

Y simplemente lo agitaremos de lado a lado y veremos que el deslizamiento de la cubierta se caerá suavemente. Muy bien, y, Y simplemente transferiremos a otro tampón de lavado que contenga XES. Comes durante un minuto.

Pasa a ir oh seis XSSC. Y para asegurarnos de que nos hemos deshecho de todos los FDS, lo repetiremos una vez más. La centrífuga para secar estuvo a temperatura ambiente durante cinco minutos a 700 RP. Guarda esta diapositiva en el cuadro de diapositivas porque es sensible a la luz.

Así que este es un escáner de diapositivas y pondrás la diapositiva aquí, un pequeño espacio justo aquí, pondrás la diapositiva boca abajo, etiquetada hacia y, Y en la segunda diapositiva solo definirás el área que quieres escanear. Y simplemente tomarás esta área en nuestras diapositivas. Tenemos, usamos 16 pines para imprimir nuestras diapositivas.

Por lo tanto, cada bloque corresponde a un pin y nuestras diapositivas contienen más de 8.000 puntos. Y representamos el genoma en color vi dos veces porque son alrededor de 4.000 genes. Así que tenemos dos puntos por cada oligo que usamos.

Y si estos se acercan, se vería en este experimento en particular, comparamos los mutantes reguladores de transcripción con el tipo salvaje, y el mutante estaría marcado con ciencia ficción, lo que le da color rojo. Y el tipo silvestre fue el sitio tres, que le da el color verde. Por lo tanto, cualquier cosa que parezca roja, como estas manchas, indica que la abundancia de las transcripciones en el mutante era mayor que en el tipo salvaje.

Por lo tanto, aparecen rojos o tonos de rojo, y cualquier cosa que aparezca verde indica que la abundancia de la transcripción era mayor en el tipo salvaje en comparación con el mutante. Y cualquier mancha que aparezca amarilla indica que esa transcripción estaba igualmente presente tanto en el tipo mutante como en el salvaje. Entonces, cuando se superponen, aparecerían amarillos como estos peros.