Name: Infección por neumococo de células endoteliales humanas primarias en flujo constante (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-31T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Aprende a analizar la adherencia de neumococo a células endoteliales humanas primarias bajo estrés de cizallamiento en flujo constante. Este método permite visualizar y cuantificar bacterias en tiempo real.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

El proyecto fue financiado por el DFG (BE 4570/4-1) a S.B.

<ol><li>Weiser, J. N., Ferreira, D. M., Paton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pneumoniae%3A+transmission%2C+colonization+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pneumoniae: transmission, colonization and invasion.</a> Nature Reviews Microbiology. 16 (6), 355-367 (2018).</li>
<li>Bergmann, S., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatility+of+pneumococcal+surface+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Versatility of pneumococcal surface proteins.</a> Microbiology. 152, 295-303 (2006).</li>
<li>Bergmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-linked+kinase+is+required+for+vitronectin-mediated+internalization+of+Streptococcus+pneumoniae+by+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Integrin-linked kinase is required for vitronectin-mediated internalization of Streptococcus pneumoniae by host cells.</a> Journal of Cell Science. 122, 256-267 (2009).</li>
<li>Bergmann, S., Schoenen, H., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+between+bacterial+enolase+and+plasminogen+promotes+adherence+of+Streptococcus+pneumoniae+to+epithelial+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The interaction between bacterial enolase and plasminogen promotes adherence of Streptococcus pneumoniae to epithelial and endothelial cells.</a> International Journal of Medical Microbiology. 303, 452-462 (2013).</li>
<li>Bergmann, S., Rohde, M., Chhatwal, G. S., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-enolase+of+Streptococcus+pneumoniae+is+a+plasmin%28ogen%29-binding+protein+displayed+on+the+bacterial+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae is a plasmin(ogen)-binding protein displayed on the bacterial cell surface.</a> Molecular Microbiology. 40, 1273-1287 (2001).</li>
<li>Bergmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+plasmin%28ogen%29-binding+motif+in+surface+displayed+alpha-enolase+of+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel plasmin(ogen)-binding motif in surface displayed alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae.</a> Molecular Microbiology. 49, 411-423 (2003).</li>
<li>Bergmann, S., Rohde, M., Preissner, K. T., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nine+residue+plasminogen-binding+motif+of+the+pneumococcal+enolase+is+the+major+cofactor+of+plasmin-mediated+degradation+of+extracellular+matrix%2C+dissolution+of+fibrin+and+transmigration%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">The nine residue plasminogen-binding motif of the pneumococcal enolase is the major cofactor of plasmin-mediated degradation of extracellular matrix, dissolution of fibrin and transmigration.</a> Thrombosis and Haemostasis. 94, 304-311 (2005).</li>
<li>Jagau, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Von+willebrand+factor+mediates+pneumococcal+aggregation+and+adhesion+in+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Von willebrand factor mediates pneumococcal aggregation and adhesion in flow.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 511(2019).</li>
<li>Tischer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+local+disorder+in+a+clinically+elusive+von+willebrand+factor+provokes+high-affinity+platelet+clumping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Enhanced local disorder in a clinically elusive von willebrand factor provokes high-affinity platelet clumping.</a> Journal of Molecular Biology. 429, 2161-2177 (2017).</li>
<li>Ruggeri, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+von+willebrand+factor+and+its+function+in+platelet+adhesion+and+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+Research+Clinical+Haematology%22%5BJournal%5D)">Structure of von willebrand factor and its function in platelet adhesion and thrombus formation.</a> Best Practice Research Clinical Haematology. 14, 257-279 (2001).</li>
<li>Spiel, A. O., Gilbert, J. C., Jilma, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Von+willebrand+factor+in+cardiovascular+disease%3A+Focus+on+acute+coronary+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Von willebrand factor in cardiovascular disease: Focus on acute coronary syndromes.</a> Circulation. 117, 1449-1459 (2008).</li>
<li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Von+Willebrand+factor%2C+Jedi+knight+of+the+bloodstream%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream.</a> Blood. 124, 1412-1425 (2014).</li>
<li>Luttge, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pneumoniae+induces+exocytosis+of+weibel-palade+bodies+in+pulmonary+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pneumoniae induces exocytosis of weibel-palade bodies in pulmonary endothelial cells.</a> Cellular Microbiology. 14, 210-225 (2012).</li>
<li>Cornish, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+in+a+Pipe+of+Rectangular+Cross-Section%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+A%22%5BJournal%5D)">Flow in a Pipe of Rectangular Cross-Section.</a> Proceedings of the Royal Society A. 786, 691-700 (1928).</li>
<li>Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Albánez, S., Lillicrap, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+von+Willebrand+Factor+Pathophysiology+Using+a+Flow+Chamber+Model+of+von+Willebrand+Factor-platelet+String+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation.</a> Journal of Visualized Experiments. 14 (126), (2017).</li>
<li>Kjos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fluorescent+Streptococcus+pneumoniae+for+live-cell+imaging+of+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">fluorescent Streptococcus pneumoniae for live-cell imaging of host-pathogen interactions.</a> Journal of Bacteriology. 197, 807-818 (2015).</li>
<li>Bergmann, S., Steinert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+single+cells+to+engineered+and+explanted+tissues%3A+New+perspectives+in+bacterial+infection+biology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Reviews+of+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">From single cells to engineered and explanted tissues: New perspectives in bacterial infection biology.</a> International Reviews of Cell and Molecular Biology. 319, 1-44 (2015).</li>
<li>Harrison, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromachining+a+miniaturized+capillary+electrophoresis-based+chemical+analysis+system+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Micromachining a miniaturized capillary electrophoresis-based chemical analysis system on a chip.</a> Science. 261 (5123), 895-897 (1993).</li>
<li>Magnusson, M. K., Mosher, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin%3A+Structure%2C+assembly%2C+and+cardiovascular+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fibronectin: Structure, assembly, and cardiovascular implications.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 18, 1363-1370 (1998).</li>
<li>Zerlauth, G., Wolf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+fibronectin+as+a+marker+for+cancer+and+other+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Plasma fibronectin as a marker for cancer and other diseases.</a> The American Journal of Medicine. 77 (4), 685-689 (1984).</li>
<li>Li, X. J., Valadez, A. V., Zuo, P., Nie, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2012.+Microfluidic+3D+cell+culture%3A+potential+application+for+tissue-based+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">2012. Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays.</a> Bioanalysis. 4, 1509-1525 (2019).</li>
<li>Fiddes, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+circular+cross-section+PDMS+microfluidics+system+for+replication+of+cardiovascular+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A circular cross-section PDMS microfluidics system for replication of cardiovascular flow conditions.</a> Biomaterials. 31, 3459-3464 (2010).</li>
<li>Schimek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+biological+vasculature+into+a+multi-organ-chip+microsystem%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem.</a> Lab on a Chip. 13, 3588-3598 (2013).</li>
<li>Pappelbaum, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultralarge+von+willebrand+factor+fibers+mediate+luminal+Staphylococcus+aureus+adhesion+to+an+intact+endothelial+cell+layer+under+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Ultralarge von willebrand factor fibers mediate luminal Staphylococcus aureus adhesion to an intact endothelial cell layer under shear stress.</a> Circulation. 128, 50-59 (2013).</li>
<li>Schneider, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear-induced+unfolding+triggers+adhesion+of+von+willebrand+factor+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Shear-induced unfolding triggers adhesion of von willebrand factor fibers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 7899-7903 (2007).</li>
<li>Reneman, R. S., Hoek, A. P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wall+shear+stress+as+measured+in+vivo%3A+consequences+for+the+design+of+the+arterial+system%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+%26+Biological+Engineering+%26+Computing%22%5BJournal%5D)">Wall shear stress as measured in vivo: consequences for the design of the arterial system.</a> Medical & Biological Engineering & Computing. 46 (5), 499-507 (2008).</li>
<li>Valentijn, K. M., Sadler, J. E., Valentijn, J. A., Voorberg, J., Eikenboom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+architecture+of+Weibel-+Palade+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Functional architecture of Weibel- Palade bodies.</a> Blood. 117, 5033-5043 (2011).</li>
<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFreshney%2C+RI+%22Culture+of+animal+cells%3A+A+manual+of+basic+Technique%2C+5th+edition%22">Culture of animal cells: A manual of basic Technique, 5th edition</a>. , Wiley-Liss Publication, Wiley-Blackwell. (2005).</li>
<li>Shaw, J. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShaw%2C+JA+%22Epithelial+cell+culture-+a+practical+approach%22">Epithelial cell culture- a practical approach</a>. Shaw, A. J. , IRL Press at Oxford University Press. 218(1996).</li>
<li>Elm, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectodomains+3+and+4+of+human+polymeric+Immunoglobulin+receptor+%28hpIgR%29+mediate+invasion+of+Streptococcus+pneumoniae+into+the+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ectodomains 3 and 4 of human polymeric Immunoglobulin receptor (hpIgR) mediate invasion of Streptococcus pneumoniae into the epithelium.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (8), 6296-6304 (2004).</li>
<li>Nerlich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+endothelial+cells+by+tissue-invasive+M3+type+group+A+streptococci+requires+Src+kinase+and+activation+of+Rac1+by+a+phosphatidylinositol+3-kinase-independent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Invasion of endothelial cells by tissue-invasive M3 type group A streptococci requires Src kinase and activation of Rac1 by a phosphatidylinositol 3-kinase-independent mechanism.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20319-20328 (2009).</li>
<li>Ho, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver-cell+patterning+lab+chip%3A+mimicking+the+morphology+of+liver+lobule+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Liver-cell patterning lab chip: mimicking the morphology of liver lobule tissue.</a> Lab on a Chip. 13, 3578-3587 (2013).</li>
<li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328, 1662-1668 (2010).</li>
<li>Harink, B., Le Gac, S., Truckenmuller, R., van Blitterswijk, C., Habibovic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration-on-a-chip%3F+The+perspectives+on+use+of+microfluidics+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Regeneration-on-a-chip? The perspectives on use of microfluidics in regenerative medicine.</a> Lab on a Chip. 13, 3512-3528 (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La simulación de la interacción bacteriana con proteínas huésped sensibles al mecanosensible como el VWF requiere un sistema de cultivo celular perfundible que permita la generación de un flujo definido, unidireccional y continuo de líquidos, generando así un flujo confiable de tensión de cizallamiento . Ya se han descrito varios sistemas de bombas microfluídicas. Una revisión exhaustiva de Bergmann et al. resume los aspectos clave de los diferentes modelos de cultivo celular bidimensional y tridimensional<sup class="xre...

La patogénesis de las infecciones por neumococo se caracteriza por una interacción multifacética con una diversidad de compuestos de matriz extracelular y componentes de la hemostasia humana, como el plasminógeno y el VWF1,2, 3,4,5,6,7,8. El VWF multidominio de glicoproteína sirve como regulador clave de una hemostasis equilibrada mediante la mediación del reclutamiento de trombocitos y la incorporación de fibrina en el sitio de formación de trombos vasculares9. La importancia del VWF funcional y activo para el control del sangrado y la cicatrización de heridas se demuestra en la enfermedad de von Willebrand, un trastorno hemorrágico hereditario común10.
Globular VWF circula en el sistema sanguíneo humano a una concentración de hasta 14,0 g/ml11,10. En respuesta a la lesión vascular, la liberación local de FVW por parte de los cuerpos endoteliales de palademán de Weibel (WBP) se incrementa notablemente11,12. Estudios anteriores muestran que la adherencia del neumococo a las células endoteliales humanas y su producción de la toxina formacional de poros neumolisina estimula significativamente la secreción luminal de VWF13. Las fuerzas hidrodinámicas del flujo sanguíneo inducen una apertura estructural de los dominios de VWF mecanoresponsive. A caudales de 10 dyn/cm2 el VWF multimerizes a cadenas de proteínas largas de hasta varios cientos de micrómetros de longitud que permanecen unidos al subendotelio10,12.
Para comprender la función de las cadenas multimerizadas de VWF generadas bajo tensión cortante en la interacción del neumococo con la superficie endotelial, se estableció un enfoque de infección del cultivo celular basado en microfluidos. Se utilizó un dispositivo microfluídico con un sistema de bomba de presión de aire controlado por software. Esto permitió una recirculación continua y unidireccional del medio de cultivo celular con un caudal definido. De este tipo, el sistema aplicó una tensión cortante definida en la superficie de las células endoteliales, que permanecía unida dentro de diapositivas de canal especializadas. Este enfoque permitió la simulación de la fuerza cortante dentro del torrente sanguíneo del sistema vascular humano, en el que las cadenas VWF se generan en células endoteliales diferenciadas en condiciones de flujo constante definidas. Para ello, las células endoteliales se cultivaron en diapositivas de canal específicas (ver Tabla de Materiales),que fueron adaptadas para análisis microscópicos durante el flujo. El sistema de bomba microfluídica proporcionó la situación de tensión de cizallamiento altamente definida y controlada necesaria para la formación de cadenas VWF extendidas en la capa de células endoteliales confluentes. Después de la estimulación de la secreción de VWF de las células endoteliales de venas umbilicales humanas cultivadas confluentes (HUVEC) por la suplementación con histamina, la formación de cuerdas fue inducida mediante la aplicación de una tensión de cizallamiento (o) de 10 dyn/cm2. La tensión de cizallamiento se define como la fuerza que actúa sobre la capa de celda. Se calcula aproximadamente de acuerdo con Cornish et. al.14 con la ecuación 1: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60323/60323equ01.jpg">
En el caso de la tensión de cizallamiento en dyn/cm2, á viscosidad en (dyn)/cm2, h a la mitad de la altura del canal, a la mitad de la anchura del canal y a la velocidad de flujo en ml/min.
El resultado de la ecuación 1 depende de las diferentes alturas y anchuras de las diferentes diapositivas utilizadas (ver Tabla de Materiales). En este estudio se utilizó una diapositiva de canal Luer de 0,4 m que dio como resultado un factor de deslizamiento de cámara de 131,6 (ver fórmula 2). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60323/60323equ02.jpg">
La viscosidad del medio a 37oC es de 0,0072 dyns/cm2 y se utilizó una tensión de cizallamiento de 10 dyn/cm2. Esto dio lugar a un caudal de 10,5 ml/min (véase la fórmula 3). <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/60323/60323equ03.jpg">
Aquí, la adaptación y el avance de un procedimiento de cultivo celular microfluídico utilizando un sistema de flujo laminar unidireccional para la investigación y visualización de los mecanismos de infección bacteriana en la vasculatura del huésped se describe en detalle. La generación de cadenas VWF en capas endoteliales también se puede estimular mediante el uso de otros sistemas de bomba que son capaces de aplicar una tensión de cizallamiento continua y constante15.
Después del cultivo de células endoteliales primarias para confluencia en el flujo y la estimulación de la formación de cuerdas DeVWF, se añadieron neumococos que expresan proteína de fluorescencia roja (RFP)16 a la capa de células endoteliales bajo control microscópico constante. La unión de bacterias a las cuerdas del VWF en la superficie de las células endoteliales se visualizó y monitorizó microscópicamente durante hasta tres horas en tiempo real mediante el uso de anticuerpos con etiquetas fluorescentes específicas de VWF. Con este enfoque, se determinó el papel del VWF como cofactor de adhesión que promueve el apego bacteriano al endotelio vascular8.
Además de la visualización microscópica de la secreción de proteínas y los cambios de conformación, este método podría utilizarse para monitorear pasos individuales de los procesos de infección bacteriana en tiempo real y para cuantificar la cantidad de bacterias adheridas en diferentes puntos de tiempo de Infección. El sistema específico de bomba controlada por software también ofrece la posibilidad de cultivar las células endoteliales en condiciones de flujo constante definidas durante un máximo de varios días y permite una incubación de flujo medio pulsada definida. Además, este método se puede aplicar utilizando diferentes tipos de celda. La adaptación del protocolo de tinción también permite la detección y visualización de bacterias internalizadas en células eucariotas.
Este manuscrito describe este protocolo experimental avanzado que se puede utilizar como un enfoque definido, confiable y reproducible para una caracterización eficiente y versátil de los procesos fisiopatológicos.

<table><tbody><tr><td>1 mL de jeringa Luer</td><td>Fisher Scientific 10303002</td><td></td><td>con un volumen de 1 mL para inyección de gelatina mediante la conexión Luer de los portaobjetos</td></tr> 2 <tr><td>mL de jeringa Luer</td><td>Sarstedt</td><td>9077136</td><td>Para el desprendimiento/inyección de fluidos en las conexiones luer de los portaobjetos de la cámara de canales</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>eBioscience ahora Thermo Fisher</td><td>00-4555-56</td><td>Mezcla de proteasas utilizada para el desprendimiento suave de células endoteliales</td></tr><tr><td>AlexaFluor350-faloidina conjugada</td><td>Abcam</td><td>ab176751</td><td>sin concentración disponible del fabricante, la solución madre es suficiente para 300 tets, la compañía recomienda usar 100 &micro; L de una dilución 1:1.000, fluorescencia azul (ajustes de filtro DAPI)</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-ratón derivado de cabra conjugado con AlexaFluor488</td> Concentración de stock <td>Thermo Fisher Sientific</td><td>A11001</td><td>: 2 mg/mL para la inmunotinción de VWF humano en portaobjetos microfluídicos después de la fijación de PFA, fluorescencia verde</td></tr><tr><td>AlexaFluor568-anticuerpo anti-conejo derivado de cabra conjugado</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11011</td><td>concentración de existencias: 2 mg/mL para la inmunotinción de neumococos en portaobjetos microfluídicos después de la fijación de pFA, fluorescencia roja</td></tr><tr><td>Bacto Todd-Hewitt-Broth</td><td>Becton Dickinson GmbH</td><td>BD 249210</td><td>medio de cultivo bacteriano complejo</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153-25G</td><td>solubilizado, para la preparación de tampón de bloqueo</td></tr><tr><td>Matraces de cultivo celular con filtro</td><td>TPP</td><td>90026</td><td>subcultivo de HUVEC en matraces de cultivo celular no recubiertos de 25 cm2</td></tr><tr><td>Centrífuga Allegra X-12R</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>392304</td><td>centrifugado de bacterias (volúmenes de >2mL)</td></tr><tr><td>Centrífuga Allegra X-30</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>B06314</td><td>centrifugado de células eucariotas</td></tr><tr><td>Centrífuga Z 216 MK</td><td>Hermle</td><td>305.00 V05 - Z 216 M</td><td>centrifugación de bacterias (volúmenes inferiores a 2 mL)</td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td><td>3886.2</td><td>utilizado en una concentración de 0,2 mg/mL para el cultivo de neumococos transformados con una construcción genética portadora de proteína fluorescente roja y casete de resistencia al cloranfenicol</td></tr><tr><td>Abrazadera para tubo de perfusión</td><td>ibidi</td><td>10821</td><td>para retener el líquido en el tubo antes de conectar la corredera al sistema de bombeo</td></tr><tr><td>Incubadora 2</td> El tamaño de la incubadora <td>Fisher Scientific</td><td>MIDI 40</td><td>se adapta perfectamente al tamaño de la unidad de fluidos con corredera de canal conectada y se utilizó para el cultivo de flujo a 37 &° C y 5% CO2</td></tr><tr><td>CO2 Incubadora</td><td>Sanyo</td><td>MCO-18 AIC</td><td>para la incubación de bacterias y células en una atmósfera definida al 5% de CO2 y 37 & grados; </td></tr><tr><td>Placas de agar sangre C Colombia</td><td>Becton Dickinson GmbH</td><td>PA-254005.06</td><td>medio de cultivo complejo a base de agar para S. pneumoniae suplementado con un 7% de sangre de oveja</td></tr><tr><td>Ordenador</td><td>Dell Latitude</td><td>3440</td><td>Comuter con software de bomba</td></tr><tr><td>de presión Microscopio de barrido láser confocal (CLSM)</td><td>Leica</td><td>DMi8</td><td>Un microscopio inverso con una platina cubierta por una cámara calefactable y con una unidad de fluorescencia equipada con filtro de fluorescencia, fuente de luz de xenón (SP8, DMi8) y DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1,4 megapíxeles)</td></tr><tr><td>Di Fosfato de hidrógeno de potasio (KH2PO4)</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td><td>3904.1</td><td>utilizado para el tampón PBS</td></tr><tr><td>Material de secado</td><td>Merck</td><td>101969</td><td>perlas de sílice de naranja para el secado utilizadas en una botella de vidrio con un adaptador de tubo</td></tr><tr><td>Mezcla de suplemento ECGM</td><td>Promocell</td><td>C-39215</td><td>mezcla de suplementos para ECGM -medio, requerido para el precultivo de células endoteliales: 0,02 mL/mL Suero fetal de ternero, 0,004 mL/mL suplemento de crecimiento de células endoteliales, 0,1 ng/mL factor de crecimiento epidérmico, 1 ng/mL de factor de crecimiento básico de fibroblastos, 90 y micro; g/mL de heparina, 1 y micro; g/mL de hidrocortisona</td></tr><tr><td>ECGMS</td><td>Promocell</td><td>C-22010</td><td>ECGM suplementado con 5 % [p/p] de FCS y 1 mM de MgSO4 para aumentar la adhesión celular</td></tr><tr><td>Medio de crecimiento de células endoteliales (ECGM, listo para usar)</td><td>Promocell</td><td>C-22010</td><td>medio de cultivo de HUVECs, ya complementado con todos los componentes de la mezcla de suplementos</td></tr><tr><td>Suero de ternero fetal (FCS)</td><td>biocromo ahora Merck</td><td>S 0415</td><td>Suplemento para cultivo celular, utilizado para análisis de infecciones</td></tr> Vacuna <tr><td>conjugada por FITC anticuerpo anti-FWW humano</td><td>Abcam</td><td>ab8822</td><td>concentración de existencias: 10 mg/mL, para la inmunodetección de FVW globular y multimerizado en flujo</td></tr><tr><td>Unidad de fluidos</td><td>ibidi</td><td>10903</td><td>unidad de fluidos para cultivo de flujo Gelatina</td></tr><tr><td>(porcina)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G-1890-100g</td><td>para el prerecubrimiento de la superficie del canal de microdeslizamiento</td></tr><tr><td>Dihidrocloruro de histamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H-7250-10MG</td><td>para la inducción de la secreción de VWF de los cuerpos endoteliales de Weibel Palade</td></tr><tr><td>Cell Célula endotelial de la vena umbilical humana (HUVEC)</td><td>Promocell</td><td>C-12203 Lote-Nr. 396Z042</td><td>células endoteliales primarias de un donante agrupado, almacenadas criconservadas en nitrógeno líquido</td></tr><tr><td>Anticuerpo humano específico contra el FVW derivado de ratón (monoclonal)</td><td>Santa Cruz</td><td>SC73268</td><td>concentración de existencias: 200 y micro; g/mL para la inmunotinción de VWF en portaobjetos microfluídicos después de la fijación de PFA</td></tr><tr><td>Puerto de inyección</td><td>ibidi</td><td>10820</td><td>para la inyección de histamina o bacterias en el tubo del depósito durante la circulación de flujo</td></tr><tr><td>Microscopio óptico</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 35M</td><td>Microscopio óptico inverso para el control de la eliminación y recuento de células eucariotas utilizando un objetivo de agua de 40x que permite un aumento</td></tr> <tr><td>de 400xLuer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides)</td><td>ibidi</td><td>80176</td><td>portaobjetos modificados físicamente para el cultivo fludic (&mu; &ndash; Corredera I0,4Luer con una altura de canal de 0,4 mm, un volumen de canal de 100 &mu; L, un área de crecimiento de 2,5 cm y un área de recubrimiento de 25,4 cm2) Adecuado para todo tipo de ensayos de flujo, el tratamiento físico genera una superficie hidrófila y adhesiva.</td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio (MgSO4, sin hidratar)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506-500G</td><td>Para la preparación del medio ECGMS</td></tr><tr><td>Bomba microfluídica</td><td>ibidi</td><td>10905</td><td>bomba de presión de aire</td>Cámara de recuento</tr> de <tr><td>celdas Neubauer</td><td>Karl Hecht GmbH& Co KG</td><td>40442002</td><td>cámara de recuento microscópica para HUVEC</td></tr><tr><td>Paraformaldehído 16% (PFA)</td><td>Microscopía electrónica Sciences</td><td>15710-S</td><td>para la reticulación de muestras</td></tr><tr><td>Set de perfusión</td><td>ibidi</td><td>10964</td><td>El Set de Perfusión Amarillo/Verde tiene un diámetro de tubo de 1,6 mm, una longitud de tubo de 50 cm, un volumen total de trabajo de 13,6 mL, un volumen de tubo muerto de 2,8 mL y un tamaño de depósito de 10 mL. combinado con el &micro;-slide L0.4Luer, a 37 &deg; C y una viscosidad de 0,0072 dyn x s/cm2 se puede alcanzar un rango de caudal de 3,8 mL/min hasta 33,9 mL/min y un esfuerzo cortante entre 3,5 dyn/cm2 y 31,2 dyn/cm2. con una longitud de 50 cm para</td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato microfluídico (PBS),</td><td></td><td></td> <td>la solución se preparó utilizando los siguientes productos químicos: 0,2 g/L de KCl, 1,44 g/L Na2HPO4, 0,24 g/L KH2PO4 , pH 7,4</td></tr><tr><td>Cubetas de plástico</td><td>Sarstedt</td><td>67.741</td><td>(2 x ópticas) para la medición de OD a 600 nm</td></tr><tr><td>Antisuero específico contra el neumococo</td><td>Pineda</td><td></td><td>criado en conejo utilizando Streptococcus pneumoniae NCTC10319 y D39 inactivados por calor, purificados con IgG utilizando la columna de proteína-sepharose.</td></tr><tr>Placa <td></td><td></td> de <td>poliestireno o espuma de poliestireno</td><td>: esta es una medida de precaución para evitar el estrés por frío en las células sembradas en los portaobjetos del canal. Se puede utilizar cualquier tipo de espuma de poliestireno, como el material de la caja de embalaje. El plato puede tener un grosor de 0,5 cm y debe tener un tamaño de 20 cm2.</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio (KCl)</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td><td>6781.1</td><td>utilizado para el tampón PBS</td></tr><tr><td>Software de control de bombas (PumpControl v1.5.4)</td><td>ibidi</td><td>v1.5.4</td><td>Software informático para el control de la bomba de presión, el ajuste de las condiciones de caudal y el inicio/fin del caudal</td></tr><tr><td>Tubos de reacción 1,5/2,0 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.706/ 72.695.500</td><td>necesarios para diluciones de anticuerpos</td></tr><tr><td>Tubos de reacción con 50 mL volumen</td><td>Sarstedt</td><td>6,25,48,004</td><td></td></tr><tr><td>Neumococos que expresan RFP</td><td>Colección Nacional de Cultivos Tipo, Salud Pública Inglaterra</td><td>10,319</td><td>Streptococcus pneumoniae serotipo 47 que expresa RFP fusionado con una proteína similar a la ahistona integrada en el genoma</td></tr><tr><td>Pipetas serológicas 5, 10 mL</td><td>Sarstedt</td><td>86.1253.025/ 86.1254.025</td><td>para pipetear volúmenes</td></tr> <tr><td>más grandesCarbonato de sodio (Na2CO3, sin agua)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>451614-25G</td><td>para la preparación de 100 mM tampón de carbonato de sodio</td></tr><tr><td>Dihidrógeno fosfato (NaH2PO4)</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td><td>P030.2</td><td>utilizado para el tampón PBS</td></tr><tr><td>Fotómetro espectral Libra S22</td><td>Biochrom</td><td>80-2115-20</td><td>medición de la densidad óptica (OD) de la suspensión bacteriana a 600 nm</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389-500G</td><td>para la preparación de tampón de bloqueo</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284-500ML</td><td>Utilizado en una concentración final del 0,1% diluido en dH20 para la permeabilización de células eucariotas después de la fijación de PFA</td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>oxoide</td><td>LP0021</td><td>las bacterias se cultivan en el suplemento THB con 1% [p/p] de extracto de levadura = medio de cultivo bacteriano completo THY</td></tr></tbody></table>

infección por neumococo de células endoteliales humanas primarias en flujo constante

Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

La interacción de Streptococcus pneumoniae con la superficie de las células endoteliales se media en el flujo sanguíneo a través de proteínas sensibles al mecanosensible como el Factor Von Willebrand (VWF). Esta glicoproteína cambia su conformación molecular en respuesta al estrés de cizallamiento, exponiendo así sitios de unión para un amplio espectro de interacciones huésped-ligand. En general, el cultivo de células endoteliales primarias bajo un flujo de cizallamiento definido es conocido por promover la diferenciación celular específica y la formación de una capa endotelial estable y estrechamente vinculada que se asemeja a la fisiología del revestimiento interno de un vaso sanguíneo . Por lo tanto, el análisis funcional de las interacciones entre patógenos bacterianos y la vasculatura huésped que involucra proteínas mecanósensitiveas requiere el establecimiento de sistemas de bombeo que puedan simular las fuerzas de flujo fisiológico que se sabe que afectan a la superficie de células vasculares.
El dispositivo microfluídico utilizado en este estudio permite una recirculación continua y sin pulsos de fluidos con un caudal definido. El sistema de bomba de presión de aire controlado por ordenador aplica una tensión de cizallamiento definida en las superficies de células endoteliales mediante la generación de un flujo medio continuo, unidireccional y controlado. Los cambios morfológicos de las células y la unión bacteriana se pueden monitorear y cuantificar microscópicamente en el flujo mediante el uso de diapositivas de canal especiales que están diseñadas para la visualización microscópica. A diferencia de la infección por cultivo celular estático, que en general requiere una fijación de muestraantes antes del etiquetado inmune y los análisis microscópicos, las diapositivas microfluídicas permiten tanto la detección basada en fluorescencia de proteínas, bacterias y componentes celulares después de la fijación de la muestra; inmunofluorescencia en serie; y detección directa basada en fluorescencia en tiempo real. En combinación con bacterias fluorescentes y anticuerpos específicos etiquetados con fluorescencia, este procedimiento de infección proporciona un sistema de visualización de múltiples componentes eficiente para un gran espectro de aplicaciones científicas relacionadas con los procesos vasculares.

El cultivo de HUVEC primario en un flujo unidireccional constante da como resultado la formación de una capa celular confluente y estrechamente embalada que promueve la generación de WPB celulares llenos del VWF13mecanosensible,14. Este protocolo describe el uso de un sistema de recirculación sin pulso basado en bomba de presión de aire para el análisis de infecciones que requiere imitar la situación de tensión de cizallamiento en el flujo sanguíneo humano.
<...

Este estudio describe el monitoreo microscópico de la adherencia del neumococo a las cadenas del factor von Willebrand producidas en la superficie de células endoteliales primarias humanas diferenciadas bajo tensión de cizallamiento en condiciones de flujo definidas. Este protocolo se puede extender a la visualización detallada de estructuras celulares específicas y cuantificación de bacterias mediante la aplicación de procedimientos de inmunoinso diferencial.

Infección por neumococo de células endoteliales humanas primarias en flujo constante

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...

El uso de este sistema de cultivo celular endotelial permite la asimilación de la situación en el flujo sanguíneo. Y con esta situación, podemos analizar procesos de infección bacteriana incluyendo también la identificación de vectores bacterianos y también de vectores celulares que están involucrados en este proceso. Esta técnica allana el camino para explorar el impacto de las infecciones bacterianas en la integridad vascular, incluyendo también el impacto en los mecanismos de morfogénesis, en las respuestas a la inflamación y la regulación inmune.Esta técnica requiere un manejo especial de las células endoteliales y por lo tanto una descripción visual es mejor que una simple explicación verbal. Este método proporciona información sobre varias otras áreas de investigación correlacionadas con sistemas vasculares perfundidos como la diferenciación de células endoteliales, la cicatrización de heridas, la génesis tumoral y la angiogénesis. Uno de los pasos clave es el cultivo celular estandarizado, así como el manejo preciso de las células endoteliales primarias.Esta técnica requiere un manejo especial del cultivo celular que no podría ser claro con sólo una explicación verbal. Para

pneumococcus-infection-primary-human-endothelial-cells-constant

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este documento describe los diferentes métodos de...

Los modelos de co-cultivo de Pseudomonas aeruginosa Biofilms Cultivado en las células vivas las vías respiratorias humanas

Estamos describiendo un método de someter a las células adherentes al esfuerzo cortante de flujo laminar en un circuito de flujo continuo estéril. Adhesión de las células, la morfología puede ser estudiado a través de la cámara transparente, las muestras obtenidas de los circuitos para el análisis de metabolitos y células recolectadas después de la exposición de corte para futuros experimentos o la cultura.

De placas paralelas de flujo y la Cámara de circuito de flujo continuo para evaluar las células progenitoras endoteliales bajo una tensión cortante de flujo laminar

Este primer artículo se describe un procedimiento para aislar las células endoteliales humanas de las venas umbilicales y, a continuación se muestra cómo utilizar estas células para examinar la transmigración de neutrófilos bajo condiciones de flujo. Mediante el uso de una cámara de flujo de bajo volumen hecha de un polímero con las características ópticas de vidrio, en vivo de células de imagen fluorescente de poblaciones celulares raras también es posible.

Aislamiento de células endoteliales de vena umbilical y su uso en el Estudio de la transmigración de neutrófilos bajo condiciones de flujo

Fuente: Jagau, H. et al. Infección por neumococo de células endoteliales humanas primarias en flujo constante. J. Vis. Exp. (2019)Este video demuestra la visualización en tiempo real de la unión neumocócica a las cadenas del factor de von Willebrand (VWF) en células endoteliales en condiciones de flujo de medios constantes. Describe los pasos para estimular la liberación de VWF, etiquetar las cuerdas y cuantificar la unión bacteriana.

Evaluación de la unión neumocócica a células endoteliales humanas primarias bajo flujo constante de medios

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

Esta técnica proporciona un método para cosechar, normalizar y cuantificar el crecimiento intracelular de las bacterias patógenas que son pre-cultivadas en células naturales protozoos anfitrionas antes de las infecciones de las células de mamíferos. Este método puede ser modificado para acomodar una amplia variedad de células huésped para la fase de cebado así como los tipos de células diana.

Las infecciones tratables con células de mamíferos Protozoarios cebados con bacterias

Los leucocitos atraviesan la monocapa endotelial usando el paracelular o la ruta transcelular. Hemos desarrollado un ensayo sencillo para seguir la distribución de la unión endógena VE-cadherina y PECAM-1 durante la migración de leucocitos transendotelial bajo flujo fisiológico de discriminar entre las dos vías de transmigración.

Imágenes en tiempo real de la célula-célula cruces endoteliales Durante neutrófilos Transmigración Bajo Flujo Fisiológica

Presentamos un modelo de enfermedad vascular in vitro para investigar interacciones sanguíneas enteras con endotelio derivado del paciente. Este sistema permite el estudio de las propiedades trombogénicas de las células endoteliales primarias en diversas circunstancias. El método es especialmente adecuado para evaluar la trombogenicidad in situ y la terapia de anticoagulación durante diferentes fases de la coagulación.

In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

Describimos un protocolo para un modelo de co-cultivo tridimensional de vías respiratorias infectadas, utilizando CFBE41o- células, macrófagos THP-1, y Pseudomonas aeruginosa, establecido en la interfaz aire-líquido. Este modelo proporciona una nueva plataforma para probar simultáneamente la eficacia de los antibióticos, la función de barrera epitelial y los marcadores inflamatorios.

P. aeruginosa Co-cultivo 3D infectado de células epiteliales bronquiales y macrófagos en la interfaz aire-líquido para la evaluación preclínica de los antiinfecciosos

En este artículo, las células endoteliales pulmonares primarias se aislaron y cultivaron de ratones neonatos.

Aislamiento de células endoteliales pulmonares primarias de ratón

Aquí presentamos un protocolo para construir un sistema de órgano en chip (OOC) diseñado para imitar la neumonectomía. Este sistema investiga la posible correlación entre el deterioro del glicocáliz y las complicaciones después de la neumonectomía.

Modelado del glicocálix endotelial después de la neumonectomía en un chip fluídico 3D: un enfoque para fabricar un sistema de órgano en chip basado en el sistema vascular

Aprende a analizar la adherencia de neumococo a células endoteliales humanas primarias bajo estrés de cizallamiento en flujo constante. Este método permite visualizar y cuantificar bacterias en tiempo real.

Infección por neumococo de células endoteliales humanas primarias en flujo constante

Explorar más videos