Infección por neumococo de células endoteliales humanas primarias en flujo constante

Este estudio describe el monitoreo microscópico de la adherencia del neumococo a las cadenas del factor von Willebrand producidas en la superficie de células endoteliales primarias humanas diferenciadas bajo tensión de cizallamiento en condiciones de flujo definidas. Este protocolo se puede extender a la visualización detallada de estructuras celulares específicas y cuantificación de bacterias mediante la aplicación de procedimientos de inmunoinso diferencial.

El uso de este sistema de cultivo celular endotelial permite la asimilación de la situación en el flujo sanguíneo. Y con esta situación, podemos analizar procesos de infección bacteriana incluyendo también la identificación de vectores bacterianos y también de vectores celulares que están involucrados en este proceso. Esta técnica allana el camino para explorar el impacto de las infecciones bacterianas en la integridad vascular, incluyendo también el impacto en los mecanismos de morfogénesis, en las respuestas a la inflamación y la regulación inmune.

Esta técnica requiere un manejo especial de las células endoteliales y por lo tanto una descripción visual es mejor que una simple explicación verbal. Este método proporciona información sobre varias otras áreas de investigación correlacionadas con sistemas vasculares perfundidos como la diferenciación de células endoteliales, la cicatrización de heridas, la génesis tumoral y la angiogénesis. Uno de los pasos clave es el cultivo celular estandarizado, así como el manejo preciso de las células endoteliales primarias.

Esta técnica requiere un manejo especial del cultivo celular que no podría ser claro con sólo una explicación verbal. Para empezar, trabajar en un ambiente estéril utilizando un banco limpio. Utilice una pipeta para inyectar 100 microlitros de una solución PBS de gelatina porcina filtrada estéril al 2% en un único reservorio de un portaobjetos de canal de temperatura equilibrada.

Coloque el portaobjetos recubierto de gelatina en una fina placa de poliestireno o espuma de poliestireno para evitar una caída en la temperatura del deslizamiento con una jeringa Luer de un mililitro para añadir 100 microlitros de las cuatro veces 10 a la quinta suspensión HUVEC por mililitro en la diapositiva para sembrar y cultivar el HUVEC. Incubar el tobogán del canal con el HUVEC durante 60 minutos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Después de eso, llene cada depósito medio en ambos extremos de la diapositiva del canal con 60 microlitros de medio ECGMS.

Incubar durante otra hora a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono. A continuación, para ajustar la bomba microfluídica, conecte primero el conjunto de perfusión equilibrada a la unidad de bomba, llene con 13,6 mililitros de medio ECGMS e inicie el software de control de la bomba. En el menú de la configuración de la unidad fluida, seleccione el conjunto de perfusión adecuado y el tipo de diapositiva de la cámara utilizando las ventanas de desplazamiento hacia abajo.

Elija 0.007 dyne segundo por centímetro cuadrado en el software para viscosidad media. Fuera de la incubadora, conecte una botella de vidrio llena de perlas de sílice de secado al tubo de presión de aire. Seleccione los parámetros de flujo en el menú del software, ajuste la presión a 40 milibares y enjuague los tubos de la bomba con el medio líquido iniciando el flujo medio continuo.

Garantizamos un accesorio de celda apretado mediante el uso de HUVEC cultivados subconfluentemente y, además, nos centramos en sacar burbujas de aire del sistema, así como en utilizar una fuente de alimentación independiente para el sistema de bomba. Toque en las conexiones del tubo para eliminar las burbujas de aire y asegúrese de que no circulan burbujas de aire en el sistema de la bomba. Para conectar la corredera del canal, detenga la circulación de flujo en el software de control de la bomba y sostenga el flujo medio y el tubo de perfusión sujetando los tubos cerca de la conexión Luer.

Conecte el portaobjetos de canal evitando así las burbujas de aire. En la pestaña avanzada del software de control de la bomba, utilice el creador del ciclo de herramientas de software para programar los ciclos de tensión de cizallamiento deseados para el cultivo de flujo. Programe los niveles de tensión cortantes para la circulación del flujo e inicie la perfusión a largo plazo.

Comience con cinco dyne por centímetro cuadrado que corresponde a un caudal de 5,44 mililitros por minuto durante 30 minutos seguido de flujo continuo a una tensión de cizallamiento de 10 dyne por centímetro cuadrado que corresponde a un caudal de 10,85 mililitros por minuto. Control de bombeo de depósito equilibrado. Coloque la unidad fluida con el portaobjetos de canal conectado en una incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.

Inicie el control del software del microscopio y ajuste los ajustes principales para la monitorización microscópica de fluorescencia seleccionando los ajustes de filtro adecuados. Para la visualización microscópica, coloque la unidad fluida en la cámara de calentamiento de 37 grados Celsius. Coloque la diapositiva del canal en el escenario de un microscopio precalificado.

Controlar la morfología celular y la integridad de la capa HUVEC antes de la inyección de histamina y bacterias a la circulación del flujo. Mantenga la configuración de flujo. Inducir la liberación de VWF de cuerpos Palade endoteliales viables inyectando 136 microlitros de una solución de hetamina de 100 mililitros a través de un puerto de inyección en el medio ECGMS que circula en el tubo de perfusión.

Para la detección de inmunofluorescencia de cuerdas FWF multimerizadas, inyecte 20 microgramos de un anticuerpo conjugado FITC específico de VWF en un volumen de 200 microlitros de PBS en los 13,6 mililitros circulantes de medio ECGMS. Para cuantificar la unión neumocócica a las cadenas VWF generadas en las superficies celulares HUVEC, inyecte 1,35 veces 10 al octavo CFU por mililitro RFP que expresa neumococos en un volumen máximo de un mililitro en el medio ECGMS utilizando el puerto de inyección. Seleccione un objetivo de inmersión de aceite 63X para el aumento del microscopio y ajuste los ajustes del filtro de fluorescencia en el software del microscopio al canal RFP con un filtro de detección de 540 nanómetros para la detección de RFP expresando neumococos.

Para cuantificar la unión bacteriana a las cadenas VWF, cree instantáneas de pilas Z de al menos 30 vistas de campo representativas cada una que contenga aproximadamente 10 HUVEC morfológicamente intactas y cuente la cantidad de neumococos. Para evaluar la fijación bacteriana después de la fijación antes de la tinción inmunofluorescent, detenga el flujo, retire 10 mililitros de medio ECGMS de los depósitos de la bomba y agregue 10 mililitros de PBS complementados con 5%paraformaldehído y proceda según el manuscrito. En este protocolo, los pasos experimentales principales comienzan con un precultivo de células endoteliales primarias para la subconfluencia en los matraces de cultivo celular.

Las células se siembran en un portaobjetos recubierto de gelatina. Las bacterias se cultivan en placas de agar seguidas por el cultivo en una fase compleja de registro medio líquido a medio. Para el cultivo celular microfluídico, un deslizamiento de canal con células endoteliales se conecta a los tubos de perfusión de una unidad fluida del sistema de bomba y se somete a un flujo constante para la diferenciación celular.

La generación de las cuerdas VWF fue inducida por inyección de histamina a una tensión de cizallamiento de 10 dyne por centímetro cuadrado y microscópicamente monitoreada por detección de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos específicos de VWF etiquetados por FITC. Después de la inyección de proteína de fluorescencia roja expresando bacterias al medio circulante, la unión de Neumococo a las cuerdas VWF se visualizó microscópicamente en tiempo real mediante la emisión de fluorescencia a 450 nanómetros. Después de la fijación de las células utilizando PFA, la tinción diferencial de inmunofluorescencia proporciona la visualización de la unión bacteriana en puntos de tiempo de infección específicos.

El paso más importante de este procedimiento es asegurar una fijación de celda apretada en la superficie de la diapositiva ajustando los niveles fisiológicos de tensión de cizallamiento y evitando fluctuaciones extremas de la presión de la bomba. Además de la visualización microscópica, esta técnica se puede aplicar para estudiar los efectos farmacológicos de los nuevos antiinfecciosos y también para analizar las consecuencias a largo plazo de los procesos de infección vascular. Este sistema de bomba perfunde patógenos bacterianos por presión de aire para evitar cualquier transmisión a través de aerosoles.

Se recomienda seguir las precauciones de bioseguridad.