De placas paralelas de flujo y la Cámara de circuito de flujo continuo para evaluar las células progenitoras endoteliales bajo una tensión cortante de flujo laminar

El objetivo general de este artículo de video es describir una técnica para someter las células adherentes a condiciones de flujo laminar y evaluar la respuesta a tensiones de cizallamiento de fluidos bien cuantificables. Esto se logra ensamblando primero el circuito de flujo sin la cámara de flujo. El circuito incluye el pulso del depósito, el amortiguador, el tubo duro, el tubo blando, las llaves de paso de cuatro vías y los adaptadores de señuelo conectados, así como un filtro de aire.

El siguiente paso es llenar el circuito con el ocho profuso deseado, como el medio celular en condiciones estériles, y luego encender la bomba para llenar el amortiguador de pulsos y purgar el tubo de aire. A esto le sigue la inserción de la corredera asentada en la placa inferior de la cámara de flujo. El paso final del procedimiento es el montaje completo del circuito de flujo con la cámara de flujo en línea.

En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la alineación de las células progenitoras endoteliales marcadas con fluorescencia bajo la exposición al estrés de cizallamiento del fluido a través de la cámara transparente utilizando un microscopio fluorescente para estudiar el comportamiento funcional de las células. A menudo es necesario imitar la fisiología in vivo sometiendo las células a un esfuerzo de cizallamiento de fluidos. Hemos diseñado una cámara de flujo de placas paralelas y un circuito de flujo continuo, que nos permiten estudiar las celdas en condiciones de flujo y observarlas a través de la cámara transparente.

Esta técnica puede servir como una valiosa herramienta de investigación para los campos de la medicina y la ingeniería. Nuestra cámara de flujo permite la visualización intermitente o en tiempo real de las células bajo flujo utilizando un microscopio vertical o invertido. Además, el diseño del Dr. Ach Nick permite a los investigadores obtener imágenes de células en superficies transparentes o radiopacas utilizando lentes de microscopio estándar.

Además, puede ser una herramienta importante en la investigación farmacológica para estudiar el efecto de los fármacos en las células en condiciones de flujo. La visualización de la configuración es fundamental porque varios de los pasos son difíciles de dominar solo leyendo un protocolo. Daré instrucciones paso a paso sobre cómo configurar la cámara de flujo y el circuito de flujo comúnmente utilizados en el laboratorio del Dr. Ock Next para ensamblar el circuito de flujo.

Comience conectando un segmento de tubo duro de 36 pulgadas a un extremo de un amortiguador de pulsos al otro extremo. Conecte un segmento de 18 pulgadas de tubo blando. Coloque un adaptador de señuelo macho de un octavo de pulgada al final de la sección de tubo blando de 18 pulgadas.

Conecte el señuelo macho a un adaptador de señuelo hembra de un octavo de pulgada. Conecte el señuelo hembra a un nuevo segmento de 18 pulgadas de tubo blando. Perfora tres agujeros en una tapa de vaso de vidrio de 250 mililitros.

Para colocar el tubo, inserte un segmento de 1.5 pulgadas de tubo blando en un orificio. Como salida de aire. Inserte los extremos libres del tubo duro y blando a través de los otros dos orificios de la tapa en la botella de vidrio de 250 mililitros, que actuará como depósito.

Asegúrese de que el tubo duro llegue al fondo del depósito. El mantenimiento de la esterilidad durante toda la configuración del circuito es crucial para el éxito de este procedimiento. Por lo tanto, todas las piezas deben estar esterilizadas y debe usar guantes estériles en todo momento.

Además de las piezas ensambladas, estas piezas deben estar esterilizadas. Una cámara de flujo completa, segmentos de tres por dos pulgadas de tubo blando, un macho y una hembra, un adaptador de señuelo de un octavo de pulgada, cuatro tornillos de cabeza plana de media pulgada, 6 5 16 pulgadas, ocho de 30 segundos. Huellas de pulgada por pulgada, tornillos de cabeza plana, un par de pinzas, un portaobjetos de vidrio y dos toallas esterilizadas por vapor.

Esterilización en autoclave a 121 grados centígrados durante 60 minutos. Coloque la cámara de flujo del circuito de flujo de cuatro por cuatro vías de parada de una por una vía, la llave de parada y todas las piezas esterilizadas en este campo estéril. Mientras usa guantes estériles, conecte las dos llaves de paso de cuatro vías.

Coloque las tapas en los puertos de muestra abiertos. Separe los adaptadores de señuelo macho y hembra que conectan los dos segmentos de tubería blanda del circuito de flujo e inserte las llaves de paso conectadas. Conecte el tubo blando insertado en el depósito en una jeringa de 30 mililitros y retire el pistón de la jeringa.

Llene la botella con 125 mililitros de medio EPC. Vuelva a conectar el tubo blando a la llave de paso. Coloque un filtro de jeringa estéril en la rejilla de ventilación.

Ahora transfiera el circuito de flujo a una incubadora humidificada a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono. Sujete el tubo duro en el cabezal de la bomba de rodillo flexible maestro indicado para usar con este tipo de tubo Palmer de carbón. Asegúrese de que la tubería no se superponga con las pistas de montaje de la bomba de rodillos.

Marque el tubo donde sale del cabezal de la bomba a cada lado con un rotulador. Después de asegurarse de que todas las llaves de paso estén cerradas hacia los puertos de muestra y abiertas a lo largo del circuito de flujo, encienda la bomba. Verifique la dirección del flujo.

El PERFUSE ocho debe moverse desde el depósito de vidrio a través del tubo duro hasta el amortiguador de pulsos. Para el ensamblaje de la cámara de flujo, use guantes estériles para conectar un segmento de tubo blando de dos pulgadas a un adaptador de señuelo hembra de un octavo de pulgada. Conecte otro segmento de tubo blando de dos pulgadas a un adaptador de señuelo macho de un octavo de pulgada.

Conecte el tubo blando de dos pulgadas con adaptador de señuelo hembra al puerto de entrada y el tubo blando de dos pulgadas con adaptador de señuelo macho al puerto de salida. Coloque las llaves de parada de cuatro vías en ambos adaptadores de señuelo. Conecte la pieza de tubo blando restante de dos pulgadas al conector del puerto lateral que sale de la trampa de burbujas y conecte una llave de paso unidireccional con pinzas estériles.

Retire el portaobjetos sembrado de células del recipiente de cultivo celular y colóquelo en el hueco de la placa inferior de la cámara de flujo. Asegúrese de que el portaobjetos esté colocado con el lado de la célula asentada hacia arriba, usando una jeringa o pipeta, coloque 10 mililitros de medio EPC tibio sobre el portaobjetos asentado de la celda. Permita que el medio cubra el portaobjetos en la cámara de flujo, pero no derrame el medio sobre la junta tórica de la placa inferior.

Coloque la placa superior de la cámara de flujo en la placa inferior, alineando los orificios de los tornillos. Mantenga las dos placas paralelas para no introducir burbujas de aire en las placas de tornillo de la cámara. Junto. Usando un destornillador automático que funciona con batería, ventile la trampa de burbujas de entrada abriendo la llave de paso unidireccional unida al puerto de la trampa de burbujas del lado de entrada.

Use una jeringa de 10 mililitros para enjuagar suavemente el tubo de entrada con medio EPC y luego cierre esta llave de parada y táchela. Ahora desairee el canal de la cámara abriendo la llave de paso de cuatro vías del puerto de salida y enjuagando suavemente el medio EPC a través de la cámara de flujo. Nuevamente, usando una tapa de jeringa de 10 mililitros, todas las conexiones de la llave de paso de cuatro vías y ciérrelas.

Transfiera la cámara de flujo a la incubadora humidificada con el circuito de flujo ensamblado. Pausa la bomba del circuito de flujo, cierre el circuito de flujo. Detenga los grifos en la dirección del flujo para evitar fugas.

Conecte la cámara de flujo al circuito de flujo Después de que la cámara de flujo se haya conectado al circuito de flujo, abra las llaves de paso en la dirección del flujo. Reanude la bomba de flujo y asegúrese de que el PERFUSE eight fluya en la dirección correcta. Ajuste el caudal a la tensión pura deseada.

Durante el experimento de flujo, la cámara de flujo se puede quitar del circuito para obtener imágenes de las células mediante microscopía óptica o fluorescente. Para hacer esto, desconecte la cámara de flujo del circuito de flujo en la llave de paso para detener las conexiones de la llave. Para recolectar perfunde ocho muestras para su análisis.

Primero, detenga la bomba, cierre la llave de paso ubicada más cerca del amortiguador de pulsos. Retire su tapa protectora, colocándola boca abajo para asegurarse de que no esté contaminada. Inserte una jeringa pequeña en el puerto de muestra.

Cierre la llave de paso en la dirección de la cámara de flujo, manteniendo abiertos el puerto de muestra y el circuito en la dirección del amortiguador de pulsos. Extraiga la cantidad deseada de muestra del circuito, cierre la llave de paso hacia el puerto de muestra antes de retirar la jeringa. Guarde la abundante muestra de ocho en un vial etiquetado y congele a menos 80 grados centígrados.

Vuelva a tapar el puerto de muestra y asegúrese de que todas las llaves de paso estén abiertas antes de comenzar el flujo. Con este método, las células progenitoras endoteliales derivadas de la sangre humana se pueden sembrar en portaobjetos de titanio en 15 minutos y adherirse bajo fuerzas de cizallamiento fisiológicas. Como se muestra en esta figura, los EPC se propagan bajo la influencia del flujo desde aproximadamente 210 micras cuadradas inmediatamente después de la siembra hasta aproximadamente 657 micras cuadradas después de tres horas y aproximadamente 1,152 micras cuadradas después de 48 horas de esfuerzo cortante del fluido de 15 dines por centímetro cuadrado.

Esta imagen de microscopio óptico ilustra la orientación aleatoria de las EPC humanas. Después de un período de asiento estático de seis horas después de tres horas de flujo a 100 centavos por centímetro cuadrado, las celdas se han extendido pero permanecen en una orientación aleatoria. Después de 48 horas de esfuerzo cortante del fluido a 100 dines por centímetro cuadrado, los EPC se alinean y orientan en la dirección del flujo.

Aquí, las EPC se marcaron con CTO y los núcleos celulares se tiñeron con herx para morir después del flujo. A modo de comparación, esta imagen muestra EPC porcinos en portaobjetos de titanio alineados con la dirección del flujo. Después de 48 horas de flujo y 15 dines por centímetro cuadrado de exposición al esfuerzo cortante, los bordes celulares se tiñeron con tinción anti pcam y los núcleos con tinción de ácido nucleico de citoxina.

Este método también permite obtener muestras de los ocho de PERFUSE en puntos de tiempo predeterminados para el análisis y/o cuantificación de los metabolitos celulares secretados. Aquí se muestra un ejemplo de la producción de nitrito durante un experimento de flujo de 48 horas con EPC porcinos. Al intentar este procedimiento, es importante mantener la esterilidad en todo momento.

Además, es importante tomar las medidas necesarias para reducir el número de burbujas de aire en la cámara de flujo antes del inicio del flujo continuo, ya que pueden arrancar las celdas. También recomendamos verificar cada una de las conexiones en la cámara de flujo y el circuito antes de la profusión para evitar fugas de PERFUSE eight durante un experimento. Esta cámara está diseñada con juntas tóricas incorporadas que permiten una oposición completa de las placas superior e inferior y proporcionan un sello a prueba de fugas sin necesidad de bombas de vacío.

Esta característica también garantiza una altura constante de la cámara entre experimentos y elimina la necesidad de juntas de goma o ajustes. Nuestra cámara de flujo emplea portaobjetos de microscopio estandarizados. Por lo tanto, hay un gran número de células disponibles para futuros experimentos.

Por ejemplo, el ARN y el ADN de las células después del flujo se pueden evaluar para la síntesis de proteínas o la expresión génica. Nuestro diseño de circuito permite la recolección de ocho muestras para el análisis y la cuantificación de metabolitos celulares como el nitrito, un metabolito oxidativo primario del óxido nítrico, que es secretado por las células bajo estrés de cizallamiento de fluidos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo ensamblar nuestra cámara de flujo y circuito de flujo estéril para someter las celdas de adherencia a la tensión de cizallamiento de fluidos.