Transición recapitulante de lechón a destete In Vitro usando organoides intestinales fetales
15 de noviembre de 2019
Este protocolo describe cómo imitar la transición de succión a destete in vitro utilizando organoides intestinales fetales tardíos de ratón cultivados durante 30 días.
Este protocolo describe un cultivo de células intestinales fetales de ratón que es el más adecuado para lograr la maduración a la etapa adulta in vitro. Este enfoque in vitro se puede utilizar para estudiar los mecanismos moleculares de la transición de la lección al destete, así como los moduladores de este proceso y para lograr un uso más eficiente de los animales experimentales. Es esencial que este modelo in vitro de maduración intestinal utilice células intestinales primarias desde la etapa de desarrollo tardía, entre los días embrionarios 18 y 20.
Con dos pequeños fórceps, estira el intestino. Usando el estómago y el apéndice como guías, corte las partes proximal y distal del intestino delgado. Usando el apéndice como guía, corte los dos puntos.
Para hacer que el intestino se abra longitudinalmente, coloque una cuchilla de afeitar a lo largo del intestino y tire del intestino deslizando fórceps a lo largo de la cuchilla de afeitar. Posteriormente, cortar el intestino abierto en trozos de un centímetro. Prepare tres tubos de 50 mililitros con diez mililitros de PBS helado.
Transfiera las partes proximal y distal del intestino delgado y el colon por separado a los tubos. Mantenga los tubos sobre hielo mientras disecciona los intestinos de ratones adicionales. Recoger todas las partes intestinales de una camada juntas en el mismo tubo.
Después de lavar las piezas intestinales con PBS helado, incubar con dos EDTA mililolares durante 30 minutos. Para disociar las criptas del tejido, lave parcialmente las piezas con PBS frío y el suero de ternero diez por ciento y filtre a través de un colador celular de 70 micras en un nuevo tubo. Repita el lavado del tejido dos veces más y combine la solución filtrada.
Centrifugar la solución filtrada que contiene las criptas a 150 veces G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius para recoger las criptas como un pellet. Transfiera las criptas a un tubo de 15 mililitros y centrifugar de nuevo. A los pozos de la placa, añadir la cantidad total de gel de matriz extracelular necesario en el tubo y disolver el pellet.
Añadir 20 microlitros de las criptas disueltas en cada pozo de una placa caliente de 48 pozos. Después de enchapar el primer pozo, mirar bajo el microscopio para confirmar la densidad de alrededor de 250 a 300 criptas por pozo. Coloque la placa en una incubadora de 37 grados Celsius durante diez minutos para dejar que el gel de matriz extracelular se solidifique.
A continuación, prepare el medio ENR. Añadir 250 microlitros del medio ENR en cada pozo en el gel. Cambiar el medio tres veces por semana y pasar los organoides una vez a la semana.
Durante un mes, cada tres días después de cada pasaje, analice la cultura. Tres días después de cada paso, aísle el ARN de un pozo añadiendo 200 microlitros de tampón de lisis de ARN complementados con dos microlitros de beta mercaptoetanol al pozo. A continuación, transfiera la muestra del pozo a un tubo de 1,5 mililitros libre de RNAse.
En nuestros experimentos in vitro, hemos utilizado dexamethosona como ejemplo de un factor externo que se sabe para acelerar la maduración intestinal in vivo. Para aislar la proteína, agregue 250 microlitros de solución de recuperación de células heladas por pozo a cinco pozos de organoides y recójalos todos en un tubo de 15 mililitros. Incubar durante al menos 30 minutos sobre hielo para disolver el gel de matriz extracelular.
Lavar con PBS frío helado, añadir 250 microlitros de tampón de lelisis celular, y almacenar a menos 80 grados Celsius. Para analizar la actividad enzimática, primero prepare 0.625 tampón maleico molar a pH seis y 0.05 soluciones molares de lactosa, sacarosa, maltosa y trehalasa y guárdelas en hielo. Preparar las normas de ensayo diluyendo 5,56 solución de glucosa molar con agua ultrapura para obtener soluciones con 5 concentraciones diferentes.
Luego, en una placa de 96 pozos, agregue ocho grupos diferentes de suaveto organoide con sus respectivos sustratos, incluyendo estándares y control según el manuscrito. Incubar durante 60 minutos a 37 grados centígrados. Para determinar la cantidad de glucosa producida por las enzimas presentes en el color organoide, agregue rápidamente 200 microlitros de solución de color PGO recién preparada y mida la absorbancia en el espectrofotómetro a 450 nanómetros cada cinco minutos durante treinta minutos a 37 grados Centígrados.
En este protocolo, el intestino proximal y distal se aisló de fetos de ratón E18 a E20. Tras el aislamiento, las células epiteliales se sembraron en cúpulas de gel de matriz extracelular. Después de aproximadamente 28 a 30 días de cultivo, los organoides fetales se desarrollaron para el estado adulto maduro.
Los marcadores proximales Onecut2 y Gata4 se expresaron principalmente en el cultivo organoide proximal, mientras que los marcadores distales Fabp6 y Guca2a se expresaron principalmente en el cultivo organoide distal. Los marcadores fetales lactasa, Ass1, Blimp-1 y neonatal Fc receptor disminuyó en su expresión relativa y los marcadores adultos sucrase isomaltasa, argenase 2, trehalase y lisozima aumentaron con el tiempo en cultivos organoides distales proximales y distales. Los efectos de los factores extrínsecos no necesariamente deben ser genómicos.
La expresión génica del marcador fetal Blimp-1 disminuyó en el día 12 para los organoides tratados con dexametasona en comparación con los organoides de control. Sin embargo, tanto la expresión génica como la actividad enzimática de los marcadores adultos sucrasa isomaltasa aumentaron. Al utilizar este protocolo, es importante darse cuenta de que sólo los organoides de etapa fetal tardía son capaces de transitar a organoides adultos in vitro.
El número de seis a diez fetos como punto de partida de este cultivo se puede reducir aún más mediante el uso de todo el intestino para estudiar la maduración general. El valor traslacional de este modelo radica en la posibilidad de que los efectores extremos de alto grupo sean capaces de modular la maduración intestinal, que es un proceso conservado entre los mamíferos lactantes.
Descripción general
Este protocolo describe cómo imitar la transición de la lactancia a la destete in vitro utilizando organoides intestinales fetales tardíos de ratón cultivados durante 30 días. Este modelo permite el estudio de los mecanismos moleculares implicados en la maduración intestinal.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Neurociencia
- Biología del desarrollo
- Técnicas de cultivo celular
Antecedentes
- La maduración intestinal es crucial durante la transición de la lactancia a la destete.
- El uso de células intestinales fetales puede reducir la necesidad de animales experimentales.
- Las células intestinales primarias de las últimas etapas del desarrollo son esenciales para este modelo.
- El protocolo describe la disección y el cultivo de organoides intestinales.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un modelo in vitro para estudiar la maduración intestinal.
- Analizar los efectos de factores externos sobre el desarrollo intestinal.
- Proporcionar información sobre los mecanismos moleculares de la maduración.
Métodos Utilizados
- Diseción de intestinos de ratones fetales tardíos.
- Cultivo de criptas intestinales en gel de matriz extracelular.
- Aislamiento de ARN y proteínas para análisis.
- Evaluación de la actividad enzimática y la expresión génica a lo largo del tiempo.
Resultados principales
- Los organoides fetales maduraron a un estado adulto después de 30 días.
- Se observó una expresión distinta de los marcadores proximales y distales.
- Factores extrínsecos como la dexametasona influyeron en la maduración.
- La expresión génica de los marcadores adultos aumentó mientras que la de los marcadores fetales disminuyó.
Conclusiones
- Los organoides en etapa fetal tardía son capaces de transicionar a organoides adultos in vitro.
- Este modelo puede ayudar a identificar moduladores de la maduración intestinal.
- Ofrece una alternativa valiosa a los estudios tradicionales en animales.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La modelización in vitro de la transición de la lactancia a la destete aborda un desafío clave en la investigación del desarrollo gastrointestinal al proporcionar un sistema reproducible para estudiar la maduración epitelial. Este enfoque permite la validación de dianas terapéuticas y la reducción mecanicista de riesgos para tratamientos dirigidos a trastornos intestinales, ofreciendo valor predictivo mediante cambios cuantificables en marcadores. Al reducir la dependencia de modelos in vivo, posibilita el cribado de mayor rendimiento de moduladores manteniendo la relevancia fisiológica.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la interrogación de los programas genéticos que impulsan la maduración del epitelio intestinal, apoyando la prueba de hipótesis sobre dianas específicas.
- Valor operativo: Proporciona un sistema definido para evaluar las transiciones de marcadores fetales a adultos, facilitando la validación funcional de nuevas dianas.
- Valor predictivo: Rastrea los cambios en la expresión de lactasa, sacarasa-isomaltasa y lisozima a lo largo del tiempo, permitiendo la evaluación temprana de los efectos de compuestos sobre las vías de maduración.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera lecturas cuantitativas mediante ensayos de actividad enzimática (por ejemplo, sacarasa, trehalasa) para medir la maduración funcional.
- Valor operativo: Estandariza el cultivo de organoides y el muestreo en intervalos fijos tras el paso, asegurando mediciones basales reproducibles.
- Escalabilidad: Utiliza un formato de placa de 48 pocillos compatible con sistemas de manipulación líquida para pruebas de compuestos de throughput medio.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Modela un proceso de desarrollo conservado entre los mamíferos, lo que permite extrapolar los efectos de los moduladores sobre la maduración intestinal neonatal.
- Alineamiento de Biomarcadores: Relaciona cambios moleculares (por ejemplo, la regulación negativa de Blimp-1, la regulación positiva de sacarasa-isomaltasa) con resultados funcionales como la capacidad de digestión de carbohidratos.
- Reducción de Riesgos Preclínicos: Permite probar factores extrínsecos (por ejemplo, dexametasona) para identificar aceleradores o inhibidores de la maduración antes de los estudios in vivo.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El modelo se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano, donde los conocimientos mecanicistas sobre la maduración intestinal pueden orientar la selección de dianas y la optimización de fármacos líderes para trastornos gastrointestinales.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la aclaración de vías al vincular la exposición a factores extrínsecos con cambios temporales en los perfiles de expresión génica en fetos y adultos.
- Selección: Permite obtener organoides listos para ensayos con resultados enzimáticos cuantificables, adecuados para la selección en bibliotecas de compuestos.
- Análisis: Proporciona protocolos para el aislamiento temporalmente resuelto de ARN y proteínas, con el fin de correlacionar marcadores moleculares con la actividad enzimática funcional.
- Investigación Traducional: Conecta las etapas de maduración in vitro con los fenotipos in vivo de lactancia a destete mediante paneles conservados de marcadores.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma escalable para la prueba repetida de moduladores nutricionales, hormonales o farmacológicos del desarrollo intestinal.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en la maduración intestinal al aislar los programas intrínsecos de la célula de las variables sistémicas.
- Valor operativo: Define calendarios claros de pase y muestreo (por ejemplo, aislamiento de ARN cada tres días tras el pase) para garantizar la consistencia longitudinal.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al permitir la detección temprana de retrasos o aceleradores de la maduración en respuesta a compuestos candidatos.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de moduladores según su tamaño del efecto sobre la cinética de expresión de marcadores adultos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el aislamiento de tejidos primarios y en técnicas de cultivo de organoides a partir de fetos de ratón de día embrionario 18–20.
- Depende del manejo de geles de matriz extracelular y de protocolos de disección estéril para mantener la viabilidad de las criptas.
- Necesita tampones estandarizados de lisis de ARN y de ensayos enzimáticos para análisis moleculares y funcionales longitudinales.
- Limitado a células intestinales fetales tardías; las etapas más tempranas no logran transicionar a organoides adultos in vitro.
- La sensibilidad del ensayo depende de la preparación adecuada del sustrato (por ejemplo, lactosa, sacarosa) y de la frescura de la solución coloreada de PGO para una detección precisa de glucosa.
