Name: Transición recapitulante de lechón a destete In Vitro usando organoides intestinales fetales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-15T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Aprende a cultivar organoides intestinales fetales de ratón para estudiar la transición de lactancia al destete in vitro. Este modelo permite analizar mecanismos moleculares de maduración intestinal y reducir el uso de animales experimentales.

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Este estudio se llevó a cabo de conformidad con las directrices institucionales para el cuidado y uso de animales de laboratorio establecidas por el Comité ético de experimentación animal de la Universidad de Amsterdam en pleno cumplimiento de la legislación nacional sobre investigación animal siguiendo la Directiva europea 2010/63/UE para el uso de animales con fines científicos (ALC312).
1. Aislamiento de los pequeños organoides intestinales fetales
<ol><li>Sacrificar los fetos E18-E20 por decapitación con tijeras quirúrgicas, de acuerdo con las regulaciones éticas aprobadas.</li>
	<li>Inmediatamente después de la eutanasia, cortar cuidadosamente la parte inferior del abdomen del feto con tijeras intestinales y extraer todo el intestino. NOTA: El aislamiento debe realizarse con los intestinos entre E18 y E20 de gestación para lograr la transición adecuada de la criadencia al destete y la maduración in vitro.</li>
	<li>Con dos pequeños fórceps, estira el intestino. Usando el estómago y el apéndice como guías, corte la parte proximal y distal del intestino delgado. NOTA: Si la disección se realiza cuidadosamente, también es posible aislar el colon. Cortar usando apéndice como guía (Figura 1).</li>
	<li>Hacer que el intestino se abra longitudinalmente: fijar el intestino con una cuchilla de afeitar colocada longitudinalmente y tirar del intestino mediante fórceps deslizantes (un brazo de los fórceps a cada lado de la cuchilla de afeitar) a lo largo de la cuchilla de afeitar. Posteriormente, cortar el intestino abierto en trozos de 1 cm.</li>
	<li>Prepare dos tubos de 50 ml con 10 ml de solución salina con fosfato frío (PBS). Transfiera la parte proximal y distal del intestino delgado (y el colon, si corresponde) por separado a los tubos. Mantenga los tubos en el hielo mientras disecte los intestinos de ratones adicionales. Recoger todas las partes intestinales de una camada juntas en el mismo tubo. NOTA: Una camada suele tener 6-10 fetos. Los intestinos de todos los fetos deben combinarse. Esta cantidad debe ser suficiente para producir 4-8 pozos con organoides, en una placa de 48 pocillos, por parte intestinal.</li>
	<li>Proceda con el aislamiento organoide como se describió anteriormente11. En resumen, lave las piezas intestinales con PBS helado- frío, incubar con ácido etilendiaminetetraacético de 2 mM (EDTA) durante 30 minutos a 4 oC, disociar las criptas del tejido lavando duramente las piezas con PBS helado + 10% suero fetal (FCS), filtrar con un colador celular de 70 m y centrifugar para recoger las criptas a 150 x g.</li>
	<li>Placa 4 a 8 pozos con criptas en gel de matriz extracelular, dependiendo del tamaño del pellet, en una placa cálida de 48 pocillos. Utilizar 20 l de criptas suspendidas en gel de matriz extracelular por poca. Deje que el gel de matriz extracelular se solidifique en una incubadora de 37 oC durante 10 min. NOTA: Teniendo en cuenta que sólo entre el 40% y el 50% de las criptas aisladas forman organoides, aspiran a una densidad de 250 a 300 organoides por pozo. Primero agregue menos gel de matriz extracelular de lo necesario. Mirar bajo el microscopio después de enchapar el primer pozo para analizar si la densidad de las criptas aisladas es ideal. Si es necesario, agregue más gel de matriz extracelular.</li>
	<li>Mientras tanto, prepare el medio ENR: 14 mL del medio de águila modificada de Advanced Dulbecco/F-12 del ham (DMEM/F12) 1:1 +++ (complementado con 4-(2-hidroxietilo)-1-piperazineethanesácidos ácido sulfónico (HEPES) 1x, L-glutamina 0,01 M y 0,2U/ml penicilina/estreptomicina), 4 ml de medios acondicionados con naglomea, 2 ml de medios acondicionados con Rspondin, 400 ml de suplemento de B27 1x, 200 l de suplemento de N2 1x, 50 l de 1,25 mM n-acetilcisteína, 20 s de 0,05 g/ml Factor de crecimiento epidérmico (EGF). NOTA: Al cultivar organoides de colon, suplemento con 50% Wnt medios acondicionados.</li>
	<li>Añadir 250 s de medio ENR por pozo.</li>
</ol>2. Cultivo de organoides fetales
<ol><li>Cambiar el medio de las culturas 3 veces por semana. La maduración de los organoides se logra después de 1 mes de cultivo.</li>
	<li>En el día 3 después de cada pasaje, cuente el número de esferoides y organoides utilizando un microscopio óptico. Cuantificar al menos 3 pozos por condición y todos los organoides presentes en cada pocal. NOTA: El número de esferoides se reduce con el tiempo, mientras que el número de organoides aumenta(Figura 2).</li>
	<li>Pasar los organoides una vez a la semana por disociación mecánica como se describe a continuación.<ol>
<li>Retire el medio y agregue 1 ml de hielo Advanced DMEM/F12 1:1 +++. Recoger todo el gel de matriz extracelular con organoides en un tubo de 15 ml. Utilice una punta de 200 l encima de una punta de filtro de 1000 l y una pipeta hacia arriba y hacia abajo 20 veces para interrumpir los organoides.</li>
		<li>Centrífuga a 150 x g durante 5 min a 4oC. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet en 20 ml de gel de matriz extracelular por poca. Por lo general, los organoides fetales se pueden expandir en una proporción de 1:2.</li>
		<li>Deje que el gel de matriz extracelular se solidifique durante 5-10 min. Añadir 250 s de medio ENR por pozo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Análisis de maduración a nivel de ARN y proteínas
<ol><li>Analizar el cultivo cada 3 días después de cada pasaje, durante un período de 1 mes (es decir, el tiempo en el que se logra la maduración completa)(Figura 3). NOTA: El cultivo organoide fetal es dinámico (Película 1) y para evitar variaciones de la regeneración normal de los organoides después de la interrupción mecánica, es necesario recoger siempre muestras al mismo día después del paso.</li>
	<li>
Aislamiento de ARN
	<ol>
<li>Recoger 3 pozos de organoides utilizando 200 l de tampón de lisis de ARN por cada pocedés complementado con 2 ol de é-mercaptoetanol. Después de añadir el tampón de lisis de ARN + -mercaptoetanol al pozo, asegúrese de que todo el gel de matriz extracelular con organoides se transfiere a un tubo libre de RNase 1.5ml.</li>
		<li>Vórtice vigorosamente y manténgase a -80 oC durante no más de 1 mes. Aísle el ARN utilizando kits de columna de espín de sílice disponibles en el uso comercial.</li>
		<li>Para aumentar la calidad del ARN, después de los pasos de lavado añadir 500 éL de 80% EtOH y mezclar suavemente invirtiendo la columna. Centrifugar durante 2 min a 11.000 x g para secar completamente la columna. NOTA: Asegúrese de lavar el interior de la tapa del tubo con el 80% EtOH moviendo el tubo boca abajo de tres a cinco veces para deshacerse de todos los rastros de tiocianato de guanidina.</li>
		<li>Para aumentar el rendimiento del ARN, espere 1-2 minutos después de aplicar agua libre de RNase antes de la centrífuga. Vuelva a eluir el ARN aplicando el primer eluido de flujo a través a la columna una segunda vez. NOTA: La calidad aislada del ARN es suficiente para su uso en el análisis de expresiones de todo el genoma. Compruebe si el número de integridad del ARN está por encima de 8.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aislamiento de proteínas
	<ol>
<li>Recoger 5 pozos de organoides utilizando 250 l de solución de recuperación de células heladas en un tubo de 15 ml. Incubar durante al menos 30 minutos en hielo para disolver el gel de matriz extracelular (esto reducirá la contribución proteica del gel de matriz extracelular).</li>
		<li>Lavar con PBS helado. Añadir 250 l de tampón de lisis celular y almacenar a -80 oC. NOTA: Después de la sonicación, las muestras se pueden utilizar para detectar la actividad enzimática o para las manchas occidentales.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immunostaining
	<ol>
<li>Recoger 2 pozos de organoides utilizando 250 l de solución de recuperación de células heladas en un tubo de 15 ml. Incubar durante al menos 30 minutos sobre hielo para disolver el gel de matriz extracelular (esto reducirá el fondo de tinción). Lavar con PBS helado.</li>
		<li>Fijar los organoides usando 500 éL de 4% de paraformaldegyde (PFA) durante 1 h a 4 oC. Lavar con PBS helado. Proceder a la inmunofluorescencia de órganoide entero o a la incrustación de parafina, según los protocolos publicados12. NOTA: Utilice una pipeta Pasteur de plástico para manipular los organoides. Esto evitará la interrupción de su estructura.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Efecto del factor extrínsico (dexametasona como ejemplo) en el proceso de maduración organoidesa
<ol><li>En el primer día de cultivo, añadir 0.01M dexametasona a los organoides. Incubar los organoides con dexametasona durante todo el mes de cultivo añadiendo nueva dexametasona cada vez que se cambia el medio.</li>
	<li>Análisis de la expresión génica
	<ol>
<li>Aísle el ARN como se ha descrito anteriormente. Sintetizar, al mismo tiempo, el ADNc de todas las muestras a comparar (tratadas y no tratadas). Continúe con el método qRTPCR preferido.</li>
		<li>Utilice GeNorm para identificar los dos genes de referencia más estables cada vez que se utilice un nuevo tratamiento en los organoides fetales. Utilice la media geométrica de los dos genes de referencia elegidos para los cálculos de expresiones relativas. NOTA: Sugerencias de genes de referencia para la prueba de organoides fetales de ratón: Ciclophilin, Gapdh, áactina, 36b4, Hprt, Rpl4, Rpl32, Ppib y Tbp.</li>
		<li>Para investigar cómo un determinado factor extrínsico afecta la maduración fetal del ratón postnatal, se deben evaluar todos los siguientes genes.<ol>
<li>Compruebe si los marcadores fetales de lactasa (Lct), argininosuccinato sintasa 1 (Ass1), la proteína de maduración inducida por linfocitos B 1 (Blimp-1) y el receptor fc neonatal (FcRn) disminuyen la expresión durante las dos primeras semanas de cultivo y están ausentes durante el tiempo de cultivo restante(Figura 4C). Analice si este patrón está alterado.</li>
			<li>Compruebe si los marcadores adultos sucrase-isomaltase (Sis), arginase 2 (Arg2), trehalasa (Treh) y lisozyme (Lyz) aumentan en expresión después de dos semanas de cultivo(Figura 4D). Analice si este patrón se ve alterado por el factor externo. NOTA: La dexametasona es un factor externo que puede acelerar la maduración de los organoides fetales y se puede utilizar como un control positivo en todos los experimentos destinados a probar otros factores extrínsicos.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis de actividad enzimática
	<ol>
<li>Aísle la proteína como se describió anteriormente. Detectar la actividad de las disacáridasas intestinales de acuerdo con los protocolos publicados por Dahlqvist y Messer13,14.</li>
		<li>Preparar 0.625 M maleic-buffer pH 6.0 (mantener durante 3 meses a 4 oC). Usando este tampón, prepare 0.05 M de lactosa (añadir p-hidroxibenzoato sódico como estabilizador para inhibir la actividad de la p-galactosidasa ssosomal); 0.05 M maltosa; 0.05 M sacarosa y 0.05 M trehalosa. NOTA: Todas estas soluciones se pueden conservar durante 5 días a 4 oC. Manténgase en hielo mientras prepara el ensayo.</li>
		<li>Preparar las normas de ensayo diluyendo la solución de glucosa de 5,56 M con agua ultrapura para obtener soluciones con las siguientes concentraciones: 0,125 M; 0,1 M; 0.075 M; 0,05 M y 0,025 M. NOTA: solución estable durante al menos 3 meses a 4oC.</li>
		<li>Incubar en una placa de 96 pocillos durante 60 min a 37oC: - 30 l de lisato organoide con 30 oL de lactosa - 30 l de lisato organoide con 30 oL de sacarosa - 30 l de lisato organoides diluido diez veces con 30 s de maltosa - 30 l de lisato organoide cinco veces diluido con 30 s de trehalasa - 30 l de lisato organoide sin diluir con 30 ml de ácido maleico, como fondo de muestra - 30 l de cada estándar de glucosa - 30 l de agua ultrapura, en blanco - 30 l de control positivo (optimizar la dilución; tejido intestinal fetal lemido se puede utilizar como control para la actividad de la clatasa, mientras que el tejido intestinal adulto leñoso se puede utilizar como control para la sucrasa, maltase y trehalase) NOTA: La dilución de las muestras debe hacerse con tampón de lisis celular. Mantenga las muestras y la placa en hielo mientras prepara el ensayo.</li>
		<li>Para determinar la cantidad de glucosa producida por las enzimas presentes en el lisato organoide después de la incubación con sus respectivos sustratos, añadir rápidamente 200 s de solución de color PGO y medir la absorbancia a 450 nm cada 5 min durante 30 min a 37 oC. NOTA: Haga que la solución de color PGO sea fresca. Utilice 10 U/mL glucosa-oxidasa, 2 U/ml peroxidasa y 7,88 mmol/L o-dianisidina en tampón Tris-HCl de 0,5 mol/L a pH 7.0. La solución debe estar a temperatura ambiente cuando se añade a la placa.</li>
		<li>Calcular la actividad de acuerdo con la glucosa estándar y correcta para la cantidad total de proteína (determinada por el ensayo de ácido bicincino (BCA)). La actividad enzimática debe expresarse como glucosa m/proteína-min-1 (Figura 5B). NOTA: Mida la actividad de la arginasa utilizando un kit de ensayo de actividad arginasa disponible en el uso comercial.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Henning, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+development%3A+coordination+of+feeding%2C+digestion%2C+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Postnatal development: coordination of feeding, digestion, and metabolism.</a> American Journal of Physiology. 241 (3), 199-214 (1981).</li>
<li>Krasinski, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+intestinal+hydrolase+biosynthesis+during+postnatal+development+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of intestinal hydrolase biosynthesis during postnatal development in rats.</a> American Journal of Physiology. 267 (4), 584-594 (1994).</li>
<li>Hurwitz, R., Kretchmer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+arginine-synthesizing+enzymes+in+mouse+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Development of arginine-synthesizing enzymes in mouse intestine.</a> American Journal of Physiology. 251 (1), 103-110 (1986).</li>
<li>Rath, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunologic+functions+of+the+neonatal+Fc+receptor+for+IgG%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">The immunologic functions of the neonatal Fc receptor for IgG.</a> Journal of Clinical Immunology. 33, Suppl 1 9-17 (2013).</li>
<li>Martin, M. G., Wu, S. V., Walsh, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogenetic+development+and+distribution+of+antibody+transport+and+Fc+receptor+mRNA+expression+in+rat+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+Diseases+and+Sciences%22%5BJournal%5D)">Ontogenetic development and distribution of antibody transport and Fc receptor mRNA expression in rat intestine.</a> Digestive Diseases and Sciences. 42 (5), 1062-1069 (1997).</li>
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<li>Navis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+fetal+intestinal+organoids%3A+new+model+to+study+epithelial+maturation+from+suckling+to+weaning%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Mouse fetal intestinal organoids: new model to study epithelial maturation from suckling to weaning.</a> EMBO Reports. 20 (2), (2019).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Van Lidth de Jeude, J. F., Vermeulen, J. L., Montenegro-Miranda, P. S., Van den Brink, G. R., Heijmans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+lentiviral+transduction+and+downstream+analysis+of+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A protocol for lentiviral transduction and downstream analysis of intestinal organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52531(2015).</li>
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<li>Fordham, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+expanded+fetal+intestinal+progenitors+contributes+to+colon+regeneration+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transplantation of expanded fetal intestinal progenitors contributes to colon regeneration after injury.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 734-744 (2013).</li>
<li>Mustata, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Lgr5-independent+spheroid-generating+progenitors+of+the+mouse+fetal+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of Lgr5-independent spheroid-generating progenitors of the mouse fetal intestinal epithelium.</a> Cell Reports. 5 (2), 421-432 (2013).</li>
<li>Holscher, H. D., Bode, L., Tappenden, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Milk+Oligosaccharides+Influence+Intestinal+Epithelial+Cell+Maturation+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Gastroenterology+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Human Milk Oligosaccharides Influence Intestinal Epithelial Cell Maturation In Vitro.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 64 (2), 296-301 (2017).</li>
<li>Solomon, N. S., Gartner, H., Oesterreicher, T. J., Henning, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+glucocorticoid-responsiveness+in+mouse+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Development of glucocorticoid-responsiveness in mouse intestine.</a> Pediatric Research. 49 (6), 782-788 (2001).</li>
<li>Kedinger, M., Simon, P. M., Raul, F., Grenier, J. F., Haffen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+dexamethasone+on+the+development+of+rat+intestinal+brush+border+enzymes+in+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The effect of dexamethasone on the development of rat intestinal brush border enzymes in organ culture.</a> Developmental Biology. 74 (1), 9-21 (1980).</li>
</ol>

="jove_content">This project was financially supported by Danone Nutricia Reserarch. I.B.R. and R.M.v.E are employees of Danone Nutricia Research.--><html><body>Los autores no declaran nada que revelar.

Este protocolo describe el cultivo de organoides intestinales fetales tardíos durante un tiempo prolongado para imitar la transición de temible a destete in vitro. El proceso de maduración es igual al ritmo in vivo y se completa después de un mes en cultivo. Se detalla el análisis posterior de este cultivo utilizando técnicas cuantitativas de ARN y proteínas.
En este protocolo, se utilizan células intestinales primarias de embriones de ratón E18-E20. La etapa de desarrollo de las células de ratón primarias utilizadas para generar organoides para este protocolo es particularmente importante. El uso de la etapa de desarrollo anterior dará lugar a la generación de esferoides intestinales que mantienen su expresión génica fetal específica durante un período prolongado de tiempo con transición limitada a organoides adultos15,16. Sólo los esferoides tardíos de la etapa fetal son capaces de transitar a organoides adultos in vitro10. Para maximizar la ventana de oportunidad con respecto al impacto de los factores extrínsicos en la maduración intestinal, se recomiendan los intestinos de la etapa fetal tardía y no los intestinos de cachorros nacidos que han estado expuestos a microbios y leche materna. Se informa que ciertos metabolitos bacterianos y componentes de la leche pueden actuar como modificadores del proceso de maduración17.
Para obtener cantidades suficientes de células para mantener el cultivo durante un mes para estudiar toda la maduración desde el nacimiento hasta la edad adulta, mientras se recogen las muestras para análisis posteriores, los intestinos de 6-8 embriones deben utilizarse como material de partida. Se prefiere utilizar embriones de la misma etapa de desarrollo para generar el cultivo. No recomendamos agrupar diferentes camadas, ya que las ligeras diferencias en la etapa del desarrollo pueden influir en la expresión de los genes de maduración.
El protocolo descrito aquí explica la generación de organoides desde el intestino delgado proximal y distal para mantener las características del desarrollo de diferentes segmentos del intestino. Como alternativa, el intestino entero se puede utilizar para investigar la maduración general con respecto a la expresión de aumento/disminución de los marcadores específicos. En este último caso, se podrían utilizar menos embriones para aislar las células intestinales para comenzar el cultivo.
Este protocolo se desarrolla utilizando cultivos organoides tridimensionales. A medida que los organoides experimentan un crecimiento dinámico en el cultivo, es importante recoger muestras para análisis posteriores al mismo tiempo después del paso. En este protocolo, hemos seleccionado el día 3 después del paso, ya que representa el tiempo medio entre dos divisiones en las que los organoides contienen cogollos robustos y poca o ninguna muerte celular. Se puede utilizar un punto de tiempo alternativo después del passaging, pero debe ser coherente durante todo el experimento. No recomendamos el cultivo de organoides durante más de 7 días después de un paso, ya que el aumento de las células de la muerte en el lumen organoide puede afectar los resultados.
En nuestros experimentos, hemos utilizado la dexametasona como ejemplo de un factor extrínsico que se muestra y se estudia mejor en la literatura para acelerar la maduración intestinal in vivo9,18. La dexametasona ejerce sus efectos a través de rutas genómicas y no genómicas. Por ejemplo, a nivel de regulación genómica, se puede observar un aumento precoz de los niveles de ARNm de la Sis. A nivel no genómico, observamos alteraciones en la actividad de las enzimas digestivas como la trehalasa. Ambos están de acuerdo con los aspectos específicos descritos de la dexametasona sobre la activación del gen de la sucrasa y el efecto activador no genómico sobre las enzimas fronterizas intestinales observadas in vivo19. El hecho de que los factores extrínsicos, como los glucocorticoides sintéticos, puedan modular ciertos aspectos de la transición de lechal a destete en el cultivo organoide, de forma similar a la descrita in vivo, establece aún más los organoides intestinales del ratón fetal como modelo para la investigación de diferentes tipos de moduladores de maduración intestinal.
A pesar de que la maduración morfológica del epitelio intestinal humano se completa en el útero en la etapa gestacional de 22 semanas, la función de barrera intestinal madura hasta la infancia en una estrecha relación con el tipo de alimentación, el desarrollo de la microbiota y respuesta inmune. Debido a la limitada disponibilidad de tejidos humanos en estas etapas de desarrollo, el valor traslacional del modelo murino in vitro radica en la posibilidad de pantallas de alto rendimiento de factores capaces de modular la maduración intestinal, un proceso conservado entre mamíferos chupadores.
Es importante destacar que, con respecto a la ética animal en la investigación, este modelo puede contribuir al refinamiento de los experimentos con animales, ya que no incluye las intervenciones realizadas en animales. El número de animales se puede reducir aún más rediseñando las preguntas de investigación a uno o dos puntos de tiempo de cultivo que permitirán probar múltiples componentes dentro de un cultivo.

En muchas especies de mamíferos, incluyendo ratones y hombres, el intestino neonatal tiene varias características que son distintas del epitelio intestinal completamente maduro. Estas características facilitan que los enterocitos neonatales digiren y absorban la leche, que contiene altas grasas y bajos en carbohidratos, con la lactosa como principal carbohidrato. El borde del cepillo de las células epiteliales intestinales neonatales expresa la disacáridasa lactasa-phlorizina hidrolasa (Lct)1 para digerir la lactosa disacárido de la leche. Después del período de succión, los enterocitos se adaptan para digerir alimentos sólidos que son ricos en carbohidratos complejos y bajos en grasa. Esto se manifiesta por un cambio en la expresión de disacáridasa del borde del cepillo de la lactasa a la sucrasa-isomaltasa (Sis) y trehalasa (Treh), que puede digerir carbohidratos más complejos presentes en los alimentos sólidos2. Otro interruptor metabólico está relacionado con la baja concentración de arginina en la leche. Para prever la necesidad de arginina, los enterocitos neonatales expresan la tasa limitante enzima en la biosíntesis de arginina, argininosuccinato sintasa-1 (Ass1), para sintetizar arginina3. Por el contrario, enterocitos adultos expresan arginasa 2 (Arg2), una enzima capaz de catabolizar arginina que es abundante en alimentos sólidos. Además, el epitelio intestinal neonatal expresa el receptor Fc neonatal para inmunoglobulinas (FcRn), que media la absorción del IgG materno de la leche en la circulación/flujo sanguíneo4. La expresión de FcRn disminuye significativamente durante la transición de lechal a destete5. En ratones, la maduración de las células de Paneth ocurre postnatalmente, coincidentemente con la formación y maduración de criptas, y se caracteriza por la expresión de péptidos antimicrobianos lisosomas (Lyz) y defensinas6.
Todos estos cambios son parte de la transición de lechal al destete, un proceso que ocurre gradualmente después del nacimiento a un mes de edad en ratones, cuando el epitelio intestinal alcanza su estado adulto maduro. La transición de la lechón al destete está intrínsecamente regulada y establecida de desarrollo en el tubo intestinal. El factor de transcripción B de la proteína de maduración inducida por linfocitos B-1 (Blimp-1) desempeña un papel clave en este proceso de maduración intrínseca7. Blimp-1 está muy expresado en epitelio neonatal, mientras que su expresión disminuye y se pierde durante la transición de lechal a destete y por lo tanto puede servir como un marcador confiable de epitelio intestinal neonatal. A pesar de ser un proceso intrínseco, la transición de la leda-destete puede ser modulada por factores externos. Por ejemplo, el análogo sintético del cortisol, la dexametasona, se sabe que acelera la maduración intestinal en vivo8,9.
Los modelos in vitro actuales utilizados para estudiar la maduración epitelial intestinal, incluida la transición de lechal a destete, utilizan líneas celulares epiteliales adultas y/o organoides adultos que tienen características del epitelio intestinal adulto. Recientemente hemos demostrado que las células epiteliales intestinales primarias aisladas del intestino fetal tardío maduran y recapitulan la transición de lechal a destete cuando crecen in vitro como organoides10. Además, mostramos que este proceso de maduración intestinal in vitro se produce al mismo ritmo que in vivo. Finalmente, utilizamos dexametasona para acelerar el proceso de maduración de la misma manera descrita para estudios in vivo.
Aquí, delineamos un protocolo preciso para el aislamiento y el cultivo de organoides intestinales fetales tardíos del ratón. Describimos la forma preferida de recolectar muestras para el cultivo organoide prolongado y métodos para monitorear la transición de succión a destete in vitro. Este protocolo se puede utilizar para estudios in vitro de maduración epitelial intestinal y moduladores de este proceso y resulta en un mayor rendimiento, mayor calidad y valor traslacional de los datos y una reducción del uso animal.

<table><tbody><tr><td>Advanced DMEM/F12 1:1</td><td>Invitrogen</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensayo de actividad de arginasa Sigma-Aldrich</td><td></td><td>MAK112-1KT</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplemento</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>100x</td></tr><tr><td>BCA protein kit Fisher</td><td></td><td>10741395</td><td></td></tr><tr><td>Cell Lysis Buffer</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>9803S</td><td></td></tr><tr><td>Cell Solución de recuperación</td><td>Corning B.V.</td><td></td><td></td>354253</tr><tr><td>Filtro de células 70&micro; M</td><td>BD/VWR</td><td>734-0003</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Merck</td><td>10,84,18,250</td><td>EDTA Titriplex III</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Invitrogen PMG8045</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>1,00,98,31,000</td><td></td></tr><tr><td>Solución de glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6918</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>35050-038</td><td>100x</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td>1M</td></tr><tr><td>Aislado II ARN Mini Kit Bioline</td><td></td><td>BIO-52073</td><td></td></tr><tr><td>Lactosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3625</td><td>A-Lactosa monohidrato</td></tr><tr><td>Tampón Maleico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0375</td><td>Ácido maleico</td></tr><tr><td>Maltosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5885</td><td>D-(+)-Maltosa monohidrato >99%</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning B.V.</td><td>356231</td><td>Factor de Crecimiento Matriz de Membrana Basal Reducida</td></tr><tr><td>Millipore water</td><td>N.A.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suplemento N2</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td>100x</td></tr><tr><td>n-acetilcisteína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>Medios acondicionados para Noggin</td><td></td> O-dianisidina casera <td></td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>191248</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td> Penicilina/estreptomicina casera <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>0,2 U/mL</td></tr><tr><td>Preparación de enzimas PGO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-7119-10CAP</td><td>cápsulas con peroxidasa/glucosa</td></tr><tr><td>oxidasa p-hidroximercuribenzoato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>55540</td><td></td></tr><tr><td>Rspondin medios acondicionados Sacarosa</td><td>casera</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>Trehalosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5251</td><td>D-Trehalosa dihidratado</td></tr><tr><td>Tampón Tris-HCl Hecho</td><td></td><td></td> <td>en casa</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr></tbody></table>

transición recapitulante de lechón a destete in vitro usando organoides intestinales fetales

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

Al final del período de lacoo, muchas especies de mamíferos experimentan cambios importantes en el epitelio intestinal que están asociados con la capacidad de digerir alimentos sólidos. Este proceso se denomina transición de succión a destete y resulta en la sustitución del epitelio neonatal por epitelio adulto que va de la mano con ajustes metabólicos y morfológicos. Estos cambios complejos en el desarrollo son el resultado de un programa genético que es intrínseco a las células epiteliales intestinales pero que, en cierta medida, puede ser modulada por factores extrínsecos. Cultivo prolongado de células epiteliales intestinales primarias de ratón desde el período fetal tardío, recapitula la transición de lechal a destete in vitro. Aquí, describimos un protocolo detallado para el cultivo organoide intestinal fetal de ratón más adecuado para modelar este proceso in vitro. Describimos varios ensayos útiles diseñados para monitorear el cambio de las funciones intestinales asociadas con la transición de tuto-a-destete con el tiempo. Además, incluimos un ejemplo de un factor extríntico que es capaz de afectar la transición de succión a destete in vivo, como una representación de la modulación del momento de la transición de succión a destete in vitro. Este enfoque in vitro se puede utilizar para estudiar los mecanismos moleculares de la transición de succión a destete, así como moduladores de este proceso. Es importante destacar que, con respecto a la ética animal en la investigación, la sustitución de los modelos in vivo por este modelo in vitro contribuye al refinamiento de los experimentos con animales y posiblemente a una reducción en el uso de animales para estudiar los procesos de maduración intestinal.

Cultivo prolongado de células epiteliales intestinales fetales El protocolo para imitar la transición de la lenición al destete in vitro depende del manejo correcto de los organoides fetales durante el cultivo prolongado. El intestino proximal y distal aislado de los fetos del ratón E18-E20 se separan como se presenta en (Figura 1). Tras el aislamiento, las células epiteliales se sembran en cúpulas de gel de matriz extracelular(Figura 2). Por lo general, se necesitan cuatro pasajes y aproximadamente 28-30 días de cultivo para que los organoides fetales maduren al estado adulto. Durante este tiempo, se pueden recolectar células en varias etapas de maduración (Figura 3).
Análisis representativo posterior de la transición de la lección al destete in vitro Para confirmar que los organoides fetales aislados son claramente proximales o distales, compare el nivel de expresión de los marcadores proximales Miembro de la familia de dominio de corte 2 (Onecut2) y proteína de unión GATA 4 (Gata4) y marcadores distales Proteína de unión a ácido graso 6 (Fabp6) y Guanylate Cyclase Activator 2A (Guca2a) entre los cultivos organoides proximales y distales (Figura 4A, B). La transición de teno a destete in vitro puede ser monitoreada por dos conjuntos de genes: fetal(Figura 4C)y marcadores para adultos(Figura 4D). Los marcadores fetales deben disminuir gradualmente durante el curso del cultivo, mientras que la expresión de los marcadores adultos debe aumentar gradualmente(Figura 4C,D).
Uso del factor extrínsico como modificador de la transición de destete in vitro En este protocolo dexametasona un glucocorticoides sintético, se utilizó como un ejemplo de factor extrínsico capaz de modificar la transición de lechal a tejido in vitro. Los datos representativos de la Figura 5 sugieren que los efectos de los factores extrínsicos son mejores para ser determinados por múltiples ensayos, ya que no necesariamente deben ser genómicos. Por ejemplo, en el caso de la sucrasa-isomaltasa, tanto el ARN como la expresión de proteínas se inducen con dexametasona(Figura 5A),mientras que la expresión de trehalasa sólo se cambia a nivel proteico. (Figura 5B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60470/60470fig01.jpg"> Figura 1: Aislamiento del intestino delgado fetal del ratón. (A) Fotografía del intestino fetal diseccionado y estirado, incluyendo estómago, intestino delgado proximal y distal, apéndice y colon. La línea negra indica dónde se debe cortar el intestino para dividir el intestino delgado proximal y el intestino delgado distal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60470/60470fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60470/60470fig02.jpg"> Figura 2: Imágenes microscópicas representativas del cultivo organoide fetal proximal y distal en el día 3, día 17 y día 28 del cultivo. Todas las imágenes se obtuvieron en el día 3 después del pasaje y muestran la disminución en el número de esferoides horas extras. Barra de escala: 500 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60470/60470fig02large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Película 1: Video representativo que muestra la dinámica de la cultura organoide fetal, del día 4 al 6 de la cultura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60470/culture_dynamics.avi" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con</a> el botón derecho para descargar.)
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60470/60470fig03.jpg"> Figura 3: Representación esquemática de la colección organoide para el análisis de la maduración intestinal a lo largo del tiempo. Los cultivos organoides fetales proximales y distales deben ser cultivados durante un mes y aprobados cada semana. Las muestras para el análisis de maduración deben ser recogidas 3 días después del aislamiento y cada 3 días después de cada pasaje. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60470/60470fig03large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60470/60470fig04.jpg"> Figura 4: QRTPCRs representativos de marcadores de maduración intestinal en organoides fetales proximales y distales. (A) Los marcadores proximales Onecut2 y Gata4 se expresan principalmente en el cultivo organoide proximal, mientras que (B) los marcadores distales Fabp6 y Guca2a se expresan principalmente en el cultivo organoide distal. (C) Marcadores fetales Lct, Ass1, Blimp-1 y FcRn disminuyen y (D) marcadores para adultos Sis, Arg2, Treh y Lyz aumentan con el tiempo en cultivos organoides proximales y distales. Las barras de error representan SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60470/60470fig04large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60470/60470fig05.jpg"> Figura 5: El factor externo dexametasona puede modular la maduración de los organoides fetales. (A) La expresión génica del marcador fetal Blimp-1 disminuye en el día 12 del cultivo en organoides tratados con dexametasona en comparación con los organoides de control, mientras que tanto la expresión génica (B) como la actividad enzimática (C) del marcador adulto sucrase-isomaltasa (Sis) se incrementan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60470/60470fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este protocolo describe cómo imitar la transición de succión a destete in vitro utilizando organoides intestinales fetales tardíos de ratón cultivados durante 30 días.

Transición recapitulante de lechón a destete In Vitro usando organoides intestinales fetales

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...

Este protocolo describe un cultivo de células intestinales fetales de ratón que es el más adecuado para lograr la maduración a la etapa adulta in vitro. Este enfoque in vitro se puede utilizar para estudiar los mecanismos moleculares de la transición de la lección al destete, así como los moduladores de este proceso y para lograr un uso más eficiente de los animales experimentales. Es esencial que este modelo in vitro de maduración intestinal utilice células intestinales primarias desde la etapa de desarrollo tardía, entre los días embrionarios 18 y 20.Con dos pequeños fórceps, estira el intestino. Usando el estómago y el apéndice como guías, corte las partes proximal y distal del intestino delgado. Usando el apéndice como guía, corte los dos puntos.Para hacer que el intestino se abra longitudinalmente, coloque una cuchilla de afeitar a lo largo del intestino y tire del intestino deslizando fórceps a lo largo de la cuchilla de afeitar. Posteriormente, cortar el intestino abierto en trozos de un centímetro. Prepare tres tubos de 50 mililitros con diez mililitros de PBS helado.Transfiera las partes proximal y distal del intestino delgado y el colon por separado a los tubos. Mantenga los tubos sobre hielo mientras disecciona los intestinos de ratones adicionales. Recoger todas las partes intestinales de una camada juntas en el mismo tubo.Después de lavar las piezas intestinales con PBS helado, incubar con dos EDTA mililolares durante 30 minutos. Para disociar las criptas del tejido, lave parcialmente las piezas con PBS frío y el suero de ternero diez por ciento y filtre a través de un colador celular de 70 micras en un nuevo tubo. Repita el lavado del tejido dos veces más y combine la solución filtrada.Centrifugar la solución filtrada que contiene las criptas a 150 veces G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius para recoger las criptas como un pellet. Transfiera las criptas a un tubo de 15 mililitros y centrifugar de nuevo. A los pozos de la placa, añadir la cantidad total de gel de matriz extracelular necesario en el tubo y disolver el pellet.Añadir 20 microlitros de las criptas disueltas en cada pozo de una placa caliente de 48 pozos. Después de enchapar el primer pozo, mirar bajo el microscopio para confirmar la densidad de alrededor de 250 a 300 criptas por pozo. Coloque la placa en una incubadora de 37 grados Celsius durante diez minutos para dejar que el gel de matriz extracelular se solidifique.A continuación, prepare el medio ENR. Añadir 250 microlitros del medio ENR en cada pozo en el gel. Cambiar el medio tres veces por semana y pasar los organoides una vez a la semana.Durante un mes, cada tres días después de cada pasaje, analice la cultura. Tres días después de cada paso, aísle el ARN de un pozo añadiendo 200 microlitros de tampón de lisis de ARN complementados con dos microlitros de beta mercaptoetanol al pozo. A continuación, transfiera la muestra del pozo a un tubo de 1,5 mililitros libre de RNAse.En nuestros experimentos in vitro, hemos utilizado dexamethosona como ejemplo de un factor externo que se sabe para acelerar la maduración intestinal in vivo. Para aislar la proteína, agregue 250 microlitros de solución de recuperación de células heladas por pozo a cinco pozos de organoides y recójalos todos en un tubo de 15 mililitros. Incubar durante al menos 30 minutos sobre hielo para disolver el gel de matriz extracelular.Lavar con PBS frío helado, añadir 250 microlitros de tampón de lelisis celular, y almacenar a menos 80 grados Celsius. Para analizar la actividad enzimática, primero prepare 0.625 tampón maleico molar a pH seis y 0.05 soluciones molares de lactosa, sacarosa, maltosa y trehalasa y guárdelas en hielo. Preparar las normas de ensayo diluyendo 5,56 solución de glucosa molar con agua ultrapura para obtener soluciones con 5 concentraciones diferentes.Luego, en una placa de 96 pozos, agregue ocho grupos diferentes de suaveto organoide con sus respectivos sustratos, incluyendo estándares y control según el manuscrito. Incubar durante 60 minutos a 37 grados centígrados. Para determinar la cantidad de glucosa producida por las enzimas presentes en el color organoide, agregue rápidamente 200 microlitros de solución de color PGO recién preparada y mida la absorbancia en el espectrofotómetro a 450 nanómetros cada cinco minutos durante treinta minutos a 37 grados Centígrados.En este protocolo, el intestino proximal y distal se aisló de fetos de ratón E18 a E20. Tras el aislamiento, las células epiteliales se sembraron en cúpulas de gel de matriz extracelular. Después de aproximadamente 28 a 30 días de cultivo, los organoides fetales se desarrollaron para el estado adulto maduro.Los marcadores proximales Onecut2 y Gata4 se expresaron principalmente en el cultivo organoide proximal, mientras que los marcadores distales Fabp6 y Guca2a se expresaron principalmente en el cultivo organoide distal. Los marcadores fetales lactasa, Ass1, Blimp-1 y neonatal Fc receptor disminuyó en su expresión relativa y los marcadores adultos sucrase isomaltasa, argenase 2, trehalase y lisozima aumentaron con el tiempo en cultivos organoides distales proximales y distales. Los efectos de los factores extrínsecos no necesariamente deben ser genómicos.La expresión génica del marcador fetal Blimp-1 disminuyó en el día 12 para los organoides tratados con dexametasona en comparación con los organoides de control. Sin embargo, tanto la expresión génica como la actividad enzimática de los marcadores adultos sucrasa isomaltasa aumentaron. Al utilizar este protocolo, es importante darse cuenta de que sólo los organoides de etapa fetal tardía son capaces de transitar a organoides adultos in vitro.El número de seis a diez fetos como punto de partida de este cultivo se puede reducir aún más mediante el uso de todo el intestino para estudiar la maduración general. El valor traslacional de este modelo radica en la posibilidad de que los efectores extremos de alto grupo sean capaces de modular la maduración intestinal, que es un proceso conservado entre los mamíferos lactantes.

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Research

Investigación

JoVE Journal

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