Name: Desarrollo de un Modelo Experimental No Invasivo, Asistido por Láser de Pérdida Celular Endotelial Corneal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: Aprenda a desarrollar un modelo ex vivo no invasivo de queratopatía bullosa temprana utilizando láser Nd:YAG para desprender células endoteliales corneales de ojos porcinos. Este método facilita el estudio de nuevas terapias.

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Agradecemos a Christine y Jan A. M. Sochurek por su ayuda con métodos experimentales.

Todos los procedimientos relacionados con el tejido animal siguen las directrices del Comité local de cuidado y ética de los animales.
1. Preparación del cultivo de órganos y tratamiento con láser
<ol><li>Obtenga ojos porcinos recién enucledados del matadero local. Manténgalos frescos (4oC) en el medio águila modificado de Dulbecco (DMEM) con alta glucosa, complementado con L-glutamina, piruvato sódico, penicilina/estreptomicina (1%), y suero porcino (10%), a partir de ahora mencionado en este artículo como medio completo.</li>
	<li>Retire los tejidos extracelulares con tijeras y empape los ojos en una solución oftálmica de povidona-yodo al 5% durante 5 minutos antes de colocarlos en solución salina esterilizada con fosfato (PBS) hasta su uso.</li>
	<li>Los ojos de la pantalla son las principales patologías del segmento anterior, como la cicatrización de la córnea, el edema y otras opacidades con un dispositivo de tomografía de coherencia óptica de dominio espectral(Tabla de materiales).</li>
	<li>Coloque los ojos delante de una unidad de lámpara de hendidura equipada con un láser Nd:YAG(Tabla de materiales),que tiene una longitud de onda de 1.064 nm y un diámetro de punto focal de 10 m en el aire. NOTA: Para un posicionamiento óptimo se utiliza un aparato de sujeción impreso en 3D, que fue diseñado para mantener el ojo firme, sin poner demasiada presión sobre él(Figura 1).</li>
	<li>Utilice un aumento de 12x y desvíese la iluminación para visualizar las capas corneales individuales.</li>
	<li>Ajuste la energía del pulso (por ejemplo, 1,6 mJ) y el punto de enfoque (por ejemplo, 0,16 mm) para la ablación selectiva de células endoteliales.</li>
	<li>Colocar una paracentesis de córnea transparente cerca del limbo e inyectar viscoelástico(Tabla de Materiales)para estabilizar la cámara anterior.</li>
	<li>Infórmese la córnea central tratada con láser utilizando una trephine de 8 mm.</li>
	<li>Colocar la córnea extirpada en un pozo de una placa de 12 pocillos con el sitio endotelial hacia arriba e incubar el espécimen en 3 ml de medio completo a 37oC durante un máximo de 3 días. NOTA: Los posibles agentes citoprotectores se pueden agregar al medio durante este paso.</li>
</ol>2. Preparación para la histología
<ol><li>Preparar el tampón de Sorensen con un pH de 7,4 que contenga 19,6 ml de 133 mM KH2PO4 y 80,4 ml de 133 mM Na2HPO4.</li>
	<li>Retire el medio del pozo que contiene la córnea y fije el tejido durante 20 minutos a temperatura ambiente (RT) utilizando paraformaldehído libre de metanol (4%) en el tampón de Sorensen.</li>
	<li>Colocar el tejido en 20% sacarosa en PBS hasta que el tejido se hunda (1 h) y luego en 30% sacarosa en PBS durante la noche en RT. Tenga cuidado de evitar el contacto con las burbujas y la interfaz de la superficie de aire. Incruste el tejido en el compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) y guárdelo a -80 oC.</li>
	<li>Cortar las secciones de 10 m de espesor con un criostato a -27 oC. NOTA: Un cepillo de pelo de camello es útil para ayudar a guiar la sección emergente sobre la cuchilla.</li>
	<li>Transfiera la sección a una diapositiva del microscopio tocando la diapositiva al tejido dentro de 1 min después de cortarla para evitar el secado por congelación del tejido. Almacene las diapositivas a -80 oC.</li>
</ol>3. Tinción de hematoxilina y eosina (H&E)
<ol><li>Seque las secciones durante varios minutos para eliminar la humedad.</li>
	<li>Mancha con hematoxilina filtrada 0.1% Mayers durante 10 min en un tubo de 50 ml.</li>
	<li>En un frasco de Coplin, enjuague en frío ddH2O durante 5 min y sumerja en 0.5% eosin 10x.</li>
	<li>Sumerja en ddH2O hasta que la eosina deje de rayar y luego sumerja en 50% (10x) así como 70% (10x) EtOH.</li>
	<li>Equilibrar en 95% EtOH (30 s) y 100% EtOH (60 s) antes de sumergirse en xileno varias veces.</li>
	<li>Finalmente monte y cubra la muestra antes de tomar imágenes utilizando un microscopio de luz.</li>
</ol>

<ol><li>DelMonte, D. W., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+physiology+of+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cataract+and+Refractive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Anatomy and physiology of the cornea.</a> Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).</li>
<li>Edelhauser, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+balance+between+corneal+transparency+and+edema%3A+the+Proctor+Lecture%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The balance between corneal transparency and edema: the Proctor Lecture.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (5), 1754-1767 (2006).</li>
<li>Tuft, S. J., Coster, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+corneal+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">The corneal endothelium.</a> Eye. 4, London, England. Pt 3 389-424 (1990).</li>
<li>Bourne, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+the+corneal+endothelium+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">Biology of the corneal endothelium in health and disease.</a> Eye. 17, 912-918 (2003).</li>
<li>He, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+map+of+the+human+corneal+endothelial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">3D map of the human corneal endothelial cell.</a> Scientific Reports. 6, 29047(2016).</li>
<li>Gain, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Survey+of+Corneal+Transplantation+and+Eye+Banking%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking.</a> JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).</li>
<li>Schwartzkopff, J., Bredow, L., Mahlenbrey, S., Boehringer, D., Reinhard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+corneal+endothelium+following+complete+endothelial+cell+loss+in+rat+keratoplasty%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Regeneration of corneal endothelium following complete endothelial cell loss in rat keratoplasty.</a> Molecular Vision. 16, 2368-2375 (2010).</li>
<li>Bredow, L., Schwartzkopff, J., Reinhard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+corneal+endothelial+cells+following+keratoplasty+in+rats+with+bullous+keratopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Regeneration of corneal endothelial cells following keratoplasty in rats with bullous keratopathy.</a> Molecular Vision. 20, 683-690 (2014).</li>
<li>Bartakova, A., Kunzevitzky, N. J., Goldberg, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+Cell+Therapy+for+Corneal+Endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Ophthalmology+Reports%22%5BJournal%5D)">Regenerative Cell Therapy for Corneal Endothelium.</a> Current Ophthalmology Reports. 2 (3), 81-90 (2014).</li>
<li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+three-dimensional+organ+culture+model+for+corneal+wound+healing+and+corneal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Development of a three-dimensional organ culture model for corneal wound healing and corneal transplantation.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 2840-2846 (2006).</li>
<li>Aron-Rosa, D., Aron, J. J., Griesemann, M., Thyzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+neodymium-YAG+laser+to+open+the+posterior+capsule+after+lens+implant+surgery%3A+a+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+-+American+Intra-Ocular+Implant+Society%22%5BJournal%5D)">Use of the neodymium-YAG laser to open the posterior capsule after lens implant surgery: a preliminary report.</a> Journal - American Intra-Ocular Implant Society. 6 (4), 352-354 (1980).</li>
<li>Vogel, A., Hentschel, W., Holzfuss, J., Lauterborn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cavitation+bubble+dynamics+and+acoustic+transient+generation+in+ocular+surgery+with+pulsed+neodymium%3A+YAG+lasers%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Cavitation bubble dynamics and acoustic transient generation in ocular surgery with pulsed neodymium: YAG lasers.</a> Ophthalmology. 93 (10), 1259-1269 (1986).</li>
<li>Vogel, A., Schweiger, P., Frieser, A., Asiyo, M. N., Birngruber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraocular+Nd%3AYAG+laser+surgery%3A+laser-tissue+interaction%2C+damage+range%2C+and+reduction+of+collateral+effects%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Journal+of+Quantum+Electronics%22%5BJournal%5D)">Intraocular Nd:YAG laser surgery: laser-tissue interaction, damage range, and reduction of collateral effects.</a> IEEE Journal of Quantum Electronics. 26 (12), 2240-2260 (1990).</li>
<li>Zhu, Q., Zhu, Y., Tighe, S., Liu, Y., Hu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+Human+Corneal+Endothelial+Cells+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Engineering of Human Corneal Endothelial Cells In Vitro.</a> International Journal of Medical Sciences. 16 (4), 507-512 (2019).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinamide+inhibits+corneal+endothelial+mesenchymal+transition+and+accelerates+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Nicotinamide inhibits corneal endothelial mesenchymal transition and accelerates wound healing.</a> Experimental Eye Research. 184, 227-233 (2019).</li>
<li>Pescina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+convenient+ex+vivo+model+for+the+study+of+the+transcorneal+permeation+of+drugs%3A+histological+and+permeability+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: histological and permeability evaluation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 63-71 (2015).</li>
<li>Smeringaiova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Wound+Repair+of+the+Organ-Cultured+Porcine+Corneas%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Endothelial Wound Repair of the Organ-Cultured Porcine Corneas.</a> Current Eye Research. 43 (7), 856-865 (2018).</li>
<li>Yamashita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rabbit+Corneal+Endothelial+Dysfunction+Model+Using+Endothelial-Mesenchymal+Transformed+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A Rabbit Corneal Endothelial Dysfunction Model Using Endothelial-Mesenchymal Transformed Cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 16868(2018).</li>
<li>Schubert, H. D., Trokel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+repair+following+Nd%3AYAG+laser+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Endothelial repair following Nd:YAG laser injury.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (8), 971-976 (1984).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabbit+Model+of+Corneal+Endothelial+Injury+Established+Using+the+Nd%3A+YAG+Laser%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Rabbit Model of Corneal Endothelial Injury Established Using the Nd: YAG Laser.</a> Cornea. 36 (10), 1274-1281 (2017).</li>
<li>McCally, R. L., Bonney-Ray, J., de la Cruz, Z., Green, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+endothelial+injury+thresholds+for+exposures+to+1.54+micro+m+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Health+Physics%22%5BJournal%5D)">Corneal endothelial injury thresholds for exposures to 1.54 micro m radiation.</a> Health Physics. 92 (3), 205-211 (2007).</li>
<li>Nash, J. P., Wickham, M. G., Binder, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+damage+following+focal+laser+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Corneal damage following focal laser intervention.</a> Experimental Eye Research. 26 (6), 641-650 (1978).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los resultados de este estudio piloto indican que un láser Nd:YAG se puede utilizar para ablar selectivamente las células endoteliales corneales cuando se eligen los parámetros adecuados para la dosis de energía y la posición del punto de enfoque.
Como la función endotelial es importante para la transparencia corneal y la protección de la córnea del edema estromales, los modelos de disfunción endotelial juegan un papel importante en el desarrollo de fármacos antiedematosos o procedimientos qui...

La transparencia de la córnea es esencial para la transmisión de la luz a la retina y sus fotorreceptores1. En este sentido, un estado relativo de deshidratación es fundamental para mantener las fibras de colágeno dentro del estroma corneal correctamente alineados. Esta homeostasis es mantenida por células endoteliales corneales (CEC) ubicadas en la membrana del Descemet (DM)2. El endotelio es la capa corneal más interna. Tiene una importante función de barrera y bomba, que es crucial para la transparencia corneal3. A diferencia del epitelio, el endotelio no es capaz de renovarse así mismo 4. Por lo tanto, cualquier daño celular causado por enfermedad o trauma estimula las células endoteliales restantes para agrandar y migrar, para cubrir los defectos resultantes y para mantener la funcionalidad corneal5. Sin embargo, si la densidad CEC cae por debajo de un umbral crítico, la descompensación del endotelio conduce a un edema, lo que resulta en visión borrosa y malestar o incluso dolor intenso4. A pesar de la disponibilidad de fármacos para aliviar los síntomas, actualmente el único tratamiento definitivo en estos casos es el trasplante de córnea, que se puede realizar en forma de un injerto de espesor completo o un trasplante endotelial lamelar. Este último procedimiento está disponible como queratoplastia endotelial de membrana (DMEK) de Descemet, así como como queratoplastia endotelial automatizada de Descemet (DSAEK)6. Sin embargo, la protección de la CEC restante y la mejora de su supervivencia podrían ser un objetivo alternativo, que necesita un modelo adecuado de enfermedad para probar posibles medicamentos terapéuticos.
Los modelos actuales de enfermedad por pérdida de CEC se centran en la destrucción del endotelio mediante la inyección de agentes tóxicos (por ejemplo, cloruro de benzalconio) en la cámara anterior o por abrasión mecánica de las células mediante una técnica invasiva dedescemetorhexis7,8. Si bien estos modelos están bien establecidos, existen desventajas como la respuesta inflamatoria general y los daños colaterales imprecisos. Por lo tanto, estos modelos son más propensos a representar las etapas finales de la enfermedad, cuando las opciones quirúrgicas antes mencionadas son inevitables.
Con los avances en las estrategias de tratamiento celular como las células madre y la terapia génica, la aplicación de estas terapias celulares podría ser útil en las primeras etapas de la pérdida de CEC9. Posteriormente, necesitamos un modelo que represente estas etapas tempranas de la enfermedad de manera más adecuada. En este sentido, los modelos de cultivo celular han mejorado en la última década, pero todavía están limitados en su validez, ya que las células in vitro no pueden acercarse a replicar las complejas interacciones que se producen entre los diferentes tipos de células dentro de la córnea10. Por lo tanto, los modelos de enfermedad ex vivo e in vivo siguen siendo muy demandados y mejorar los existentes es de suma interés.
La cirugía intraocular no invasiva por fotodisfial utilizando un láser neodimio:YAG (Nd:YAG) se ha convertido en un procedimiento de rutina para oftalmólogos de todo el mundo desde su introducción a finales de la década de 197011. La fotorinterrupción se basa en la absorción de luz no lineal que conduce a la formación de plasma, generación de ondas de choque acústicas y creación de burbujas de cavitación, siempre que el sitio de aplicación se encuentra en un entorno líquido12. En general, estos procesos contribuyen al efecto previsto del corte preciso de tejidos. Sin embargo, también pueden ser la fuente de daños colaterales innecesarios que limitan el confinamiento local de la cirugía láser13.
La predicción de los efectos mecánicos resultantes ha mejorado significativamente a través de la caracterización del curso de propagación de ondas de choque y cavitación. Nuestro objetivo es atacar la CEC con el menor daño posible al tejido circundante para proporcionar un modelo de enfermedad experimental no invasiva, asistida por láser para las primeras etapas de la pérdida de CEC. Para ello, es necesario determinar las energías óptimas del pulso y las posiciones de los puntos focales del láser.

<table><tbody><tr><td>BARRON VACUUM TREPHINE</td><td>Katena</td><td>K20-2058</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM 3050S</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águila Modificada' s Glucosa media-alta</td><td>PAA</td><td>E-15009</td><td></td></tr><tr><td>Soporte ocular</td><td>Self</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido</td><td>Leica</td><td>DMI 6000 B</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>529568</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Merck</td><td>1065860500</td><td></td></tr><tr><td>láser Nd:YAG</td><td>Zeiss Meditec</td><td>visuLAS YAG II plus</td><td></td></tr><tr><td>OCT Tissue Tek</td><td>Sakura Finetechnical</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010056</td><td></td></tr><tr><td>Suero porcino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12736C</td><td></td></tr><tr><td>Tomógrafo de coherencia óptica de dominio espectral</td><td>Heidelberg Engineering</td><td>Spectralis</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos</td><td>Microscopio</td><td></td> de dos fotones Sarstedt 833921 <td></td></tr><tr><td></td><td>JenLab</td><td>DermaInspect</td><td></td></tr><tr><td>Viscoelástico</td><td>OmniVision</td><td>Methocel</td><td></td></tr></tbody></table>

desarrollo de un modelo experimental no invasivo, asistido por láser de pérdida celular endotelial corneal

Development of a Noninvasive, Laser-Assisted Experimental Model of Corneal Endothelial Cell Loss

Los láseres Nd:YAG se han utilizado para realizar cirugía intraocular no invasiva, como la capsulotomía desde hace varias décadas. El efecto incisivo se basa en la descomposición óptica en el foco láser. Se generan ondas de choque acústicas y burbujas de cavitación, causando ruptura del tejido. Los tamaños de burbuja y las amplitudes de presión varían con la energía del pulso y la posición del punto focal. En este estudio, los ojos porcinos enucleados se colocaron frente a un láser Nd:YAG disponible comercialmente. Se probaron las energías de pulso variables, así como las diferentes posiciones de los puntos focales posteriores a la córnea. Las lesiones resultantes fueron evaluadas por microscopía de dos fotones e histología para determinar los mejores parámetros para un desprendimiento exclusivo de células endoteliales corneales (CEC) con un daño colateral mínimo. Las ventajas de este método son la ablación precisa de la CEC, la reducción de los daños colaterales y, sobre todo, el tratamiento sin contacto.

Usando el procedimiento presentado aquí, tratamos los ojos con un láser Nd:YAG, evaluando diferentes energías de pulso (1.0-4.6 mJ) y posiciones de los puntos focales (distancia de la superficie posterior de la córnea: 0.0-0.2 mm) para encontrar los parámetros óptimos. Se evaluaron múltiples réplicas (n x 3) para cada constelación de los parámetros láser (12 x 21).
Además del protocolo antes mencionado, la muestra fue analizada con un microscopio de dos fotones antes de la fijación y la tinció...

Aquí, presentamos un protocolo para separar las células endoteliales corneales (CEC) de la membrana de Descemet (DM) utilizando un láser neodimio:YAG (Nd:YAG) como modelo de enfermedad ex vivo para la queratopatía bullosa (BK).

Desarrollo de un Modelo Experimental No Invasivo, Asistido por Láser de Pérdida Celular Endotelial Corneal

Nd:YAG lasers have been used to perform noninvasive intraocular surgery, such as capsulotomy for several decades now. The incisive effect relies on the ...

Los modelos actuales de enfermedades para la pérdida de células endoteliales corneales se centran en la destrucción del endotelio y más probablemente representan las etapas finales de la enfermedad cuando el trasplante de córnea es inevitable. Sin embargo, ahora están disponibles nuevos tratamientos con células madre o terapia génica que podrían ser más útiles para las primeras etapas de la enfermedad, cuyos modelos faltan. La cirugía intraocular no invasiva por fotodisrupción con un láser Nd:YAG se ha convertido en un procedimiento de rutina para los oftalmólogos.Después de obtener los ojos de cerdo recién enucleados del matadero local, coloque las muestras en cuatro grados Celsius medio completo. Use tijeras para extraer los tejidos extracelulares y remojar los ojos en una solución oftálmica de yodo 5%povidona durante cinco minutos. A continuación, coloque las muestras desinfectadas en PBS estériles a temperatura ambiente.Usando un dispositivo de tomografía de coherencia óptica de dominio espectral, examina los ojos para detectar las principales patologías del segmento anterior, como cicatrices corneales, edema y otras opacidades. Después del cribado, coloque los ojos delante de una unidad de lámpara deslizante equipada con un láser Nd:YAG con una longitud de onda de 1.064 nanómetros y un diámetro de punto focal de 10 micrómetros en el aire. Seleccione el aumento 12X y desvíe la iluminación para visualizar las capas corneales individuales.Después de establecer la energía del pulso y el punto de enfoque a los parámetros apropiados para la ablación selectiva de las células endoteliales corneales, aplique varias tomas láser en el tejido. Luego, bajo un microscopio diseccionado, coloque una paracentesis clara de córnea cerca del limbo e inyecte viscoelástico para estabilizar la cámara anterior. A continuación, utilice una tretina de ocho milímetros para extirpar la córnea central tratada con láser y coloque la córnea aislada en un pozo de un lado endotelial de placa de 12 pozos hacia arriba.Una vez recolectadas todas las córneas, añada tres milímetros de medio completo a cada muestra e incubar los especímenes durante hasta tres días a 37 grados centígrados. Al final de la incubación, reemplace el medio en cada pozo por 4%paraformaldehído libre de metanol en el tampón de Sorensen para una incubación de 20 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, coloque las muestras fijas en 20% sacarosa en PBS durante aproximadamente una hora hasta que las córneas se hundan.Transfiera las muestras a una sacarosa al 30% en PBS durante la noche antes de incrustar los tejidos a una temperatura de corte óptima para su almacenamiento a menos 80 grados centígrados. Utilice un criostato establecido en menos 27 grados Celsius para obtener secciones de 10 micrómetros de espesor de los tejidos congelados que recogen cada sección en una diapositiva del microscopio dentro de un minuto después de que se adquiera. A continuación, guarde los portaobjetos a menos 80 grados centígrados hasta que se manche.Para la tinción de hematoxilina y eosina, seque al aire las secciones congeladas durante varios minutos para eliminar la humedad antes de mancharlas con hematoxilina filtrada de 0,1% de Mayer durante 10 minutos en un tubo de 50 mililitros. Al final de la incubación, enjuague los portaobjetos en agua doble destilada durante cinco minutos en una cubeta. A continuación, sumerja los toboganes en 0,5%eosina 10 veces, seguido de enjuagar en agua doble destilada hasta que la eosina deje de rayar.Sumerja los portaobjetos enjuagados 10 veces en 50%etanol y 10 veces en 70%etanol. Después de la última caída de 70%etanol, equilibre las secciones en 95%etanol durante 30 segundos, seguido de 60 segundos en 100%etanol antes de varias caídas en xileno. A continuación, monte las muestras con cubreobjetos antes de obtener imágenes en un microscopio de luz.Dos imágenes de microscopía de fotón y luz deben evaluarse de forma independiente como sin daños, demasiado daño o cantidad correcta de daño. Sobre la base de estas evaluaciones, se puede calcular un mapa de calor para seleccionar la constelación correcta de parámetros láser para la ablación selectiva de las células endoteliales corneales con un daño mínimo al tejido circundante. El análisis previo ha determinado que el punto focal del láser debe estar al menos 0,15 milímetros detrás del endotelio corneal para la energía de pulso más baja probada.Para las energías de pulso superiores a 2,9 milioules, la distancia focal más larga probada sigue siendo demasiado cercana al endotelio. Varios agentes citoprotectores pueden ser probados mientras los especímenes extirpados están en cultivo. Si se demuestra que tienen éxito, se pueden añadir a la solución de riego para el tratamiento.

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Investigación

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Medicina

Este video muestra un procedimiento no invasivo asistido por láser para dañar selectivamente las células endoteliales de la córnea en el ojo porcino. El modelo ex vivo desarrollado de daño celular endotelial se puede utilizar para estudiar enfermedades del endotelio corneal.

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Aquí, presentamos el protocolo de neovascularización coroidea (CNV) inducida por láser en ratones, un modelo experimental que recrea las características vasculares de la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) neovascular. Una vez dominado, puede inducir de forma fiable y eficaz la CNV como sistema modelo para probar diversas medidas experimentales.

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En vitro y en modelos in vivo para estudiar la transición del endotelio corneal-mesenquimal

El siguiente artículo proporciona una técnica sencilla, reproducible para crear efectivamente un modelo sostenible de ratón de la insuficiencia límbica (SIL). Este modelo animal es útil para probar y comparar la eficacia de los tratamientos para las enfermedades de las células madre del limbo.

Un procedimiento mecánico simple de crear deficiencia de células madre limbares en ratón

Presentamos la utilidad de la proyección de imagen longitudinal en vivo en el seguimiento de los cambios morfológicos del neovascularization coroides laser-inducida en ratones.

En Vivo La proyección de imagen multimodal y análisis del modelo de neovascularización coroidea inducida por láser Mouse

Aquí, se presenta un protocolo paso a paso para la preparación y el cultivo de botones corneales divididos porcinos. Como este modelo de cultivo de órganos típicamente cultivado organomuestra tasas de mortalidad celular en un plazo de 15 días, comparables a las córneas de donantes humanos, representa el primer modelo que permite el cultivo a largo plazo de córneas no humanas sin añadir dextran tóxico.

Un modelo de cultivo de órgano endotelial Corneal porcino usando botones de córnea divididos

Stripping Only de Descemet es un procedimiento experimental en el que a los pacientes con guttas corneales centrales resultantes de la distrofia corneal endotelial de Fuchs se les extirpa la membrana de Descemet para que las células periféricas regeneren la capa endotelial. Presentamos una novedosa metodología simulando DSO en córneas humanas distróficas ex vivo con curación acelerada estimulada por eFGF1 (NM141).

Un modelo de cultivo de órganos corneales humanos de la extracción de Descemet solo con curación acelerada estimulada por el factor de crecimiento de fibroblastos diseñado 1

Este protocolo describe un método para inducir una lesión precisa y reproducible de la córnea y el álcali limbal en un modelo de ratón. El protocolo es ventajoso, ya que permite una lesión distribuida uniformemente en la córnea y el limbo del ratón altamente curvados.

Inducción de lesiones corneales y alcalinas mediante una técnica de punzón y trefina en un modelo de ratón

Aquí, proponemos tres métodos diferentes para dañar las fibras sensoriales que inervan la córnea. Estos métodos facilitan el estudio de la regeneración axonal en ratones. Estos tres métodos, adaptables a otros modelos animales, son ideales para el estudio de la fisiología de la inervación corneal y la regeneración.

Tres estrategias para inducir queratitis neurotrófica y regeneración nerviosa en la córnea murina

Aprenda a desarrollar un modelo ex vivo no invasivo de queratopatía bullosa temprana utilizando láser Nd:YAG para desprender células endoteliales corneales de ojos porcinos. Este método facilita el estudio de nuevas terapias.

Desarrollo de un Modelo Experimental No Invasivo, Asistido por Láser de Pérdida Celular Endotelial Corneal

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