Análisis para el Desarrollo de los cardiomiocitos mediante inmunofluorescencia en el corazón de embriones de ratón

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la maduración de los miocitos y los cardiomiocitos en el corazón embrionario de ratón en desarrollo. Esto se logra primero orientando y congelando el corazón embrionario en medio de corte. A continuación, el corazón se secciona por criomicrotomía en la orientación adecuada.

Luego, las secciones del corazón se someten a marcado inmunofluorescente de las proteínas de interés. Finalmente, se realiza microscopía confocal de las secciones cardíacas inmunomarcadas. En última instancia, se utilizan análisis de imágenes bidimensionales y tridimensionales para mostrar el desarrollo de los MiFi y otras estructuras de los cardiomiocitos.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del desarrollo cardíaco, como cómo las mutaciones y los genes cardíacos afectan el ensamblaje de MyFi y la aparición de estructuras específicas como los discos intercalados y los costameres. Para congelar rápidamente corazones embrionarios, utilice medio de temperatura óptima para corte o medio OCT para llenar una placa de Petri de 3,5 centímetros en una campana química. Enfríe dos metilbutano en nitrógeno líquido.

Después de aislar los corazones embrionarios de ratón según el protocolo descrito, coloque los corazones en OCT y déjelos equilibrar durante varios segundos antes de transferirlos a un molde de siete milímetros que contenga OCT. Oriente la pared interna del corazón hacia el fondo del molde. Coloque suavemente el molde en butano de metilo dos enfriado con nitrógeno líquido.

Teniendo cuidado de no permitir que el líquido de metilbutano entre en contacto con el OCT o el corazón hasta que el OCT esté completamente sólido y de color blanco. Luego, transfiera el molde a un recipiente con hielo seco. Una vez que todos los corazones estén congelados, envuelva los moldes criogénicos en papel de aluminio y almacénelos a menos 80 grados Celsius hasta que estén listos para la criosección.

Para fijar los corazones embrionarios, use PFA al 4 % en PBS para llenar los pocillos de una placa de cultivo de 12 pocillos. Después de diseccionar los corazones embrionarios según el protocolo descrito en el texto, coloque cada corazón en un pocillo con PFA y fíjelos a cuatro grados Celsius durante la noche. Para proteger criogénicamente los corazones, utilice una pipeta plástica de transferencia para trasladar cada corazón a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros que contenga 1,5 mililitros de sacarosa al 15 % en PBS, y agite suavemente a cuatro grados Celsius hasta que el corazón se hunda al fondo del tubo. A continuente, transfiera cada corazón a sacarosa al 30 % en PBS y agite suavemente a cuatro grados Celsius hasta que el corazón se hunda al fondo del tubo.

Congele los embriones en OCT como se demostró anteriormente en este video. Después de colocar los moldes criogénicos en la cámara del criostato y equilibrar a menos 17 grados Celsius, invierta el molde criogénico y use presión suave para expulsar el bloque del corazón del molde. Oriente la pared anterior del corazón hacia la parte superior del bloque de tejido moldeado.

Coloque una gota grande de OCT sobre el platillo y monte el bloque del corazón sobre la gota de OCT. Mantenga la orientación de modo que la pared anterior del corazón quede más alejada del platillo. Deje que el corazón se congele sobre el platillo.

Cargue el portaobjetos y el bloque cardíaco montado en el portaobjetos del criostato. Ajuste para que el ángulo del cuchillo sea de tres a cinco grados con respecto a la muestra. Recoga secciones de 10 micrómetros sobre portaobjetos de microscopio que hayan sido previamente tratados con un recubrimiento cargado positivamente.

Deje que las muestras se sequen completamente antes de almacenarlas a 80 grados Celsius negativos para realizar inmunofluorescencia. Después de fijar y/o eliminar el OCT de las secciones, use un tampón de bloqueo 1x diluido en PBS para bloquear durante 45 minutos con agitación suave. Si utiliza un anticuerpo primario generado en ratón, agregue un fragmento monovalente de FAB de IgG H más L anti ratón de burro o cabra, diluido 1 a 100 en PBS con 0,1 % de tween 20, e incube a temperatura ambiente durante 45 minutos con agitación suave.

Añada el anticuerpo primario o anticuerpos diluidos en un volumen de tampón de bloqueo y incube durante dos horas a temperatura ambiente o a cuatro grados Celsius durante la noche. Tras la incubación, use un volumen de PBS 1X para lavar los cortes tres veces durante 10 minutos. A temperatura ambiente, añada el anticuerpo secundario conjugado diluido 1:500 en tampón de bloqueo a las muestras e incube protegido de la luz durante dos horas.

A temperatura ambiente, use un XPBS para lavar los cortes a temperatura ambiente tres veces durante 10 minutos, protegidos de la luz. Monte las laminillas en un medio antidesvanecimiento colocando dos gotas del medio en cada extremo de la laminilla y cúbrala con un cubreobjetos. Use esmalte de uñas para sellar los cubreobjetos.

Guarde la muestra a cuatro grados Celsius, protegida de la luz hasta que esté lista para la obtención de imágenes. Utilizando un objetivo de 4x y fluorescencia láser, localice la muestra y el área de interés. Capture la imagen para usarla como mapa.

Al realizar imágenes con gran aumento, retire el portaobjetos realizando ajustes mínimos en la platina. Luego, cambie a un objetivo de inmersión en aceite de 60 x.

Coloque una pequeña gota de aceite sobre el objetivo y vuelva a colocar la preparación en la platina del microscopio. A continuación, localice nuevamente la muestra, y ajuste la potencia del láser, el tiempo de exposición y el binning a los niveles deseados para cada canal. Una vez determinadas las configuraciones óptimas según las indicaciones del protocolo escrito, utilice dichas configuraciones para todas las secciones de tejido dentro del experimento.

Utilice el histograma de intensidad para anotar el rango de intensidad óptimo de cada canal, que se utilizará para el análisis. Genere un Zack utilizando la función de adquisición al seleccionar los canales láser adecuados. Luego, elija los límites superior e inferior de la pila Z.

Seleccione un tamaño de paso de Zack que sea la mitad del valor del grosor de rebanada óptica proporcionado por el software. Haga clic en ejecutar para adquirir las imágenes utilizando Fiji o un programa comparable para el análisis de imágenes. Abra el archivo de Zack con una opción de modo de color personalizada y las canales separadas en ventanas independientes.

Desde el menú desplegable de imagen, abra la herramienta de ajuste de brillo y contraste y, dentro de cada canal, establezca el rango óptimo de intensidad del histograma. Como se determinó previamente, aplique estos rangos de canal a todas las imágenes de Zacks que se estén analizando. Luego, desde el menú desplegable de color de imagen, combine los canales individuales en una única imagen compuesta.

Mediante el menú Proyección Z de pilas de imágenes, cree una pila Z aplanada a partir de la imagen compuesta. Dado que esta imagen será significativamente más brillante que la imagen 3D, ajuste el rango de intensidad del histograma para la muestra de control con el fin de evitar la sobrexposición, y aplique los mismos ajustes a la pila Z aplanada experimental. Para generar una imagen 3D, primero seleccione el menú Proyección 3D de pilas de imágenes. Elija el eje X o el eje Y de rotación.

Establezca el espaciado de corte con el mismo número de micrómetros que el tamaño del paso de la serie Z. Elija el ángulo total de rotación deseado y fije el incremento del ángulo de rotación en uno. Luego, abra el visor 3D de ImageJ desde el menú desplegable de complementos.

Seleccione la imagen compuesta generada mostrada como volumen y establezca el factor de remuestreo en uno o dos. Estas figuras muestran resultados típicos de tinción de cos para diferentes proteínas en un corazón congelado rápidamente y en un corazón fijado con acetona; el anticuerpo contra la alfa actinina S marcó de forma reproducible los discos Z y los discos intercalados con alta especificidad y fondo mínimo. El anticuerpo contra la proteína de la unión de adherencia beta-catenina se unió a la membrana de cardiomiocitos y células no cardiomiocitos, y la colocalización con la alfa actinina SFA ocurrió en los discos intercalados presuntos en E 16.5. La inmunofluorescencia de la integrina beta uno en el corazón embrionario es especialmente difícil, pero la tinción de la integrina beta uno en estos estudios reveló una señal con la misma periodicidad que los discos Z marcados por la alfa actinina SFA, lo que posiblemente refleja la formación de costameres nascentes en E 16.5.

En E 12,5, el patrón de tinción de SFA actinina y tropomiosina mostró una periodicidad regular en los cardiomiocitos trabeculares, consistente con miofibrillas maduras en la zona compacta externa. La SFA actinina presentaba un patrón más puntiforme que lineal, y la señal de tropomiosina era difusa en lugar de lineal. La tinción adherente de NCA y los cardiomiocitos trabeculares en corazones de E 12,5 se colocalizaron con áreas de tinción intensa de SFA actinina, posiblemente representando discos intercalados. Se muestra aquí un corazón embrionario de E 12,5 fijado con PFA, marcado para SFA actinina y actina filamentosa de un ratón transgénico life act RFP Ruby. La relación señal-ruido de SFA actina fue menor en comparación con secciones de corazones congelados rápidamente.

La reconstrucción tridimensional de imágenes reveló que los MyFi dentro de un cardiomiocito eran aproximadamente paralelos entre sí, pero los cardiomiocitos individuales presentaban orientaciones en ángulos variables unos respecto a otros. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo orientar y seccionar criogénicamente corazones embrionarios adecuadamente, así como realizar tinción inmunohistoquímica, microscopía confocal y análisis de imágenes para evaluar la maduración de los MyFi y de los cardiomiocitos durante el desarrollo cardíaco del ratón.Admit.