Análisis para el Desarrollo de los cardiomiocitos mediante inmunofluorescencia en el corazón de embriones de ratón

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la maduración miofial y de cardiomiocitos en el corazón embrionario de ratón en desarrollo. Esto se logra primero orientando y congelando el corazón embrionario en medio de corte. A continuación, se criosecciona el corazón en la orientación adecuada.

A continuación, las secciones del corazón se someten a un marcaje inmunofluorescente de las proteínas de interés. Por último, se realiza la microscopía confocal de los cortes de corazón con tinción inmunológica. En última instancia, se utilizan análisis de imágenes bidimensionales y tridimensionales para mostrar el desarrollo de MyFi y otras estructuras de cardiomiocitos.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del desarrollo cardíaco, como la forma en que las mutaciones y los genes cardíacos afectan el ensamblaje de MyFi y la aparición de estructuras específicas como discos interconectados y clientes. Para congelar corazones embrionarios, utilice una temperatura de corte óptima o un medio OCT para llenar una placa de Petri de 3,5 centímetros en una campana química. Fresco. Dos metilbutano en nitrógeno líquido.

Después de aislar los corazones embrionarios de ratón de acuerdo con el protocolo de texto, coloque los corazones en OCT y deje que se equilibren durante varios segundos antes de transferirlos a un molde de siete milímetros que contenga OCT. Oriente la pared interior del corazón hacia el fondo del molde. Coloque suavemente el molde en el metilbutano enfriado con nitrógeno líquido.

Tenga cuidado de no permitir que los dos líquidos de metilbutano toquen el OCT o se congele el corazón hasta que el OCT esté blanco sólido. Luego transfiera el molde a una cubitera que contenga hielo seco. Después de que todos los corazones estén congelados, envuelva los moldes criogénicos en papel de aluminio y guárdelos a menos 80 grados centígrados hasta que estén listos para la criosección.

Para fijar corazones embrionarios, use 4% de PFA en PBS para llenar los pocillos de una placa de cultivo de 12 láminas. Después de diseccionar los corazones embrionarios de acuerdo con el protocolo de texto, coloque cada corazón en un pocillo de PFA y fíjelo a cuatro grados centígrados durante la noche Para crioproteger los corazones con una pipeta de transferencia de plástico, mueva cada corazón a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contenga 1,5 mililitros de sacarosa al 15% en PBS y agite suavemente a cuatro grados centígrados hasta que el corazón se hunda hasta el fondo del tubo. Transfiera cada corazón a un 30% de sacarosa en PBS y agite suavemente a cuatro grados centígrados hasta que el corazón se hunda hasta el fondo del tubo.

Congele los embriones en OCT como se demostró anteriormente en este video. Después de colocar los moldes criogénicos en la cámara de criostato y equivaler a menos 17 grados centígrados, invierta el molde criogénico y use una presión suave para expulsar el bloque cardíaco del molde. Oriente la pared anterior del corazón hacia la parte superior del bloque de tejido moldeado.

Coloque una gota grande de OCT en el mandril y monte el bloque de corazón en la gota de OCT. Mantener la orientación de tal manera que la pared anterior del corazón esté más alejada del mandril. Deje que el corazón se congele en el mandril.

Cargue el mandril y el bloque de corazón montado en el soporte de objetos de criostato. Ajuste de modo que el ángulo de la cuchilla sea de tres a cinco grados en relación con la muestra. Recoja secciones de 10 micrómetros en portaobjetos de microscopio que hayan sido tratados previamente con un recubrimiento cargado positivamente.

Deje que las muestras se sequen por completo antes de almacenarlas a menos 80 grados centígrados para llevar a cabo la inmunofluorescencia. Después de fijar y/o quitar la OCT de las secciones, use un tampón de bloqueo diluido en PBS para bloquear durante 45 minutos con una agitación suave. Si se utiliza un anticuerpo primario generado en ratón, añadir un fragmento de FAB monovalente IgG H más L anti ratón de burro o cabra diluido uno a 100 en PBS 0,1%tween 20 e incubar a temperatura ambiente durante 45 minutos con una suave agitación.

Agregue el anticuerpo primario o los anticuerpos diluidos en un tampón de bloqueo x e incube durante dos horas a temperatura ambiente o a cuatro grados centígrados durante la noche. Después de la incubación, use un XPBS para lavar las secciones tres veces durante 10 minutos. A temperatura ambiente, el adidor conjugó un anticuerpo secundario diluido de uno a 500 en tampón de bloqueo a las muestras e incubó protegido de la luz durante dos horas.

A temperatura ambiente, use un XPBS para lavar las secciones a temperatura ambiente tres veces durante 10 minutos protegido de la luz. Monte los portaobjetos en un medio antidecoloración colocando dos gotas de medio en cada extremo del portaobjetos y use un cubreobjetos para cubrir. Usa esmalte de uñas para sellar los cubreobjetos.

Guárdelo a cuatro grados centígrados, protegido de la luz hasta que esté listo para tomar la imagen. Usando un objetivo de cuatro x y fluorescencia láser, encuentre la muestra y el área de interés. Captura la imagen para usarla como mapa.

Al obtener imágenes con gran aumento. Retire la corredera haciendo ajustes mínimos en la etapa de la corredera. A continuación, cambie a un objetivo de inmersión en aceite de 60 x.

Coloque una pequeña gota de aceite en el objetivo y vuelva a colocar la corredera en la plataforma de deslizamiento. A continuación, vuelva a buscar la muestra, ajuste el tiempo de exposición a la potencia del láser y el binning a los niveles deseados para cada canal. Una vez que se hayan determinado los ajustes óptimos de acuerdo con las directrices del protocolo de texto, utilice los ajustes de muestra para todas las secciones de tejido dentro del experimento.

Utilice el histograma de intensidad para anotar el rango de intensidad óptimo para cada canal, que se utilizará para el análisis. Genere un Zack utilizando la función de adquisición seleccionando los canales láser adecuados. A continuación, elija los límites superior e inferior de la pila Z.

Elija un tamaño de paso de Zack que sea la mitad del valor del grosor de corte óptico proporcionado por el software. Haga clic en ejecutar para recopilar las imágenes utilizando Fiji o un programa comparable para el análisis de imágenes. Abra el archivo Zack con una opción de modo de color personalizado y los canales se dividirán en ventanas separadas.

En el menú desplegable de la imagen, abra la herramienta ajustar el contraste de brillo y, dentro de cada canal, establezca el rango de intensidad óptimo del histograma. Como se determinó anteriormente, aplique estos rangos de canales a todos los Zacks que se estén analizando. Luego, desde el color de la imagen, menú desplegable, fusione los canales individuales en una sola imagen compuesta.

Con el menú del proyecto Z de pilas de imagen, cree una pila Z aplanada a partir de la imagen compuesta. Dado que esta imagen será significativamente más brillante que la imagen 3D, ajuste el rango de intensidad del histograma para la muestra de control para evitar la sobresaturación y aplique la misma configuración al Zack aplanado experimental. Para generar una imagen 3D, primero elija el menú del proyecto 3D Pilas de imágenes. Elija el eje X o el eje Y de rotación.

Establezca el espaciado de corte en el mismo número de micras que el tamaño del paso de la pila Z. Elija la rotación total deseada y establezca el incremento del ángulo de rotación en uno. A continuación, abra el visor de imágenes J 3D desde el menú desplegable de plugins.

Elija la imagen compuesta generada en la pantalla como volumen y establezca el factor de remuestreo en uno o dos. Estas figuras muestran los resultados típicos de la tinción de cos de diferentes proteínas en un corazón congelado a presión, un corazón fijo con acetona, el anticuerpo contra discos Z marcados con S alfa actinina de forma reproducible y en discos interconectados con alta especificidad y fondo mínimo. El anticuerpo contra la proteína de unión de adherencia beta-catenina se unió a la membrana de los cardiomiocitos y las células no cardiomiocitarias y la colocalización con la actinina SFA ocurrió en discos presuntamente interados en E 16.5 beta one La inmunofluorescencia de integrinas en el corazón embrionario es especialmente desafiante, pero la tinción de integrinas beta one en estos estudios reveló una señal con la misma periodicidad que los discos Z marcados con actinina SFA, posiblemente reflejando los clientes nacientes que se forman en E 16.5.

En E 12.5, el patrón de tinción de actinina SFA y tropomicina mostró una periodicidad regular en los cardiomiocitos trabeculares consistentes con miofibrillas maduras en la zona compacta externa La actinina SFA fue más punteada que lineal y la señal de tropomiosina fue difusa en lugar de lineal, con tinción adherente a NCA y cardiomiocitos trabeculares en E 12.5 corazones colocalizados con áreas de tinción intensa de actina SFA que posiblemente representen discos interconectados. Aquí se muestra un corazón embrionario E 12.5 fijado con PFA marcado para actinina SFA y actón filamentoso de un ratón transgénico RFP Ruby de acto de vida. La relación entre la actina y el ruido de SFA disminuyó en comparación con las secciones de corazón congeladas.

La reconstrucción tridimensional de la imagen reveló que los MyFi dentro de un cardiomiocitos eran aproximadamente paralelos entre sí, pero los cardiomiocitos individuales estaban orientados en diferentes ángulos entre sí. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo orientar y criocortar correctamente los corazones embrionarios, así como realizar inmunotinción, microscopía confocal y análisis de imágenes para evaluar la maduración de MyFi y cardiomiocitos durante el desarrollo del corazón del ratón. Admitir.