Los métodos para la transferencia Precisamente localizada de células o ADN en Early postimplantación embriones de ratón

El objetivo general de estos procedimientos es demostrar cómo transferir con precisión células o ADN a embriones de ratón tempranos después de la implantación. Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en biología del desarrollo, como probar el potencial in vivo de células cultivadas in vitro y las funciones de ciertos genes en etapas embrionarias específicas. Las principales ventajas de estas técnicas son que no requieren ningún equipo especializado y hacen posible la manipulación experimental de la postura temprana del ratón de plantación. Después de sacrificar una hembra embarazada en el día E 7.5 o E 8.5 según el protocolo de texto, use tijeras y pinzas para aislar el útero y colocarlo en un plato de 30 milímetros lleno de M dos medios con dos pares de pinzas finas.

Separe con cuidado el miometrio, luego pele la decidua, teniendo cuidado de no perforar las cavidades embrionarias adicionales. Retire la membrana del riker usando fórceps para pellizcarla y separarla lentamente del embrión. Luego, bajo un microscopio de disección estereoscópica, revise los embriones para asegurarse de que el amnios del saco vitelino y el cono de la placenta estén intactos. Con una pipeta, transfiera los embriones a un plato limpio de M dos y colóquelos en una tapa de placa de Petri de plástico de 30 milímetros sobre hielo o una plataforma de hielo para enfriar parcialmente los embriones.

Prepare el medio de cultivo y los embriones de cultivo de acuerdo con el protocolo de texto para injertar células cultivadas en embriones de ratón. Comience utilizando una punta de pipeta de 200 microlitros para raspar físicamente las células madre de eblasto, que expresan GFP de forma ubicua en una placa de cultivo de seis pocillos. Transfiere las células a la placa que contiene los embriones.

Conecte un capilar de injerto tirado a mano al tubo aspirador para hacer una pipeta bucal, succione suavemente la pipeta bucal para extraer uno o más grupos de células de más de 20 células en el capilar de injerto. A continuación, sople suavemente las células para dispersar grandes grumos. Seleccione un grupo que contenga alrededor de 10 a 20 células y llévelo al capilar de injerto.

De nuevo, manteniendo el grupo cerca de la abertura del capilar con un par de pinzas. Sostenga el embrión sin apretar en su lugar e inserte el capilar de injerto en la región de interés. Para crear una apertura.

Expulse suavemente el grupo fuera del capilar de injerto, dejando la cadena corta de 10 a 20 células alojadas en el embrión. Deje los embriones en la misma placa de medio M dos y use un microscopio de disección de compuestos de fluorescencia y una cámara para obtener imágenes de los embriones injertados. Mantenga el tiempo de imagen al mínimo para evitar la exposición de los embriones a luz y calor excesivos.

Inmediatamente después de la obtención de imágenes con una pasta, transfiera los embriones con un volumen mínimo de M dos medios a un medio de cultivo preequilibrado y el cultivo de acuerdo con las pautas del protocolo de texto antes de realizar experimentos de electroporación, use una micropipeta horizontal polar para extraer pipetas de inyección de ADN con una punta fina y una abertura de menos de 10 micrómetros para evitar daños en los tejidos. Para la electroporación capilar de vidrio, utilice una microforja para cortar la abertura de las pipetas de inyección de ADN a un diámetro interno de 20 o 30 micrómetros con una punta limpia y sin bordes rotos. Conecte cada electrodo de platino a un alambre aislado delgado e insértelo en un soporte de aguja de microinyección cubierto con cinta aislante.

Para preparar un electrodo capilar hecho a mano, inserte un alambre de platino de 0,2 milímetros de diámetro en un capilar de vidrio de electroporación con una abertura fija de 20 o 30 micrómetros de diámetro. Concentrar la corriente eléctrica y llevar el ADN plasmático a una pequeña región de interés en el embrión. Para hacer un electrodo en forma de L, doble un alambre de platino de 0,2 milímetros de diámetro, creando una forma de L con la parte horizontal de la L de alrededor de un milímetro de longitud.

Monte los portaagujas en soportes de instrumentos de micromanipulación estándar. Conecte el electrodo capilar al ánodo de la fuente de alimentación. Conecte el electrodo en forma de L al ánodo del multímetro.

Luego conecte el cátodo del multímetro al cátodo de la fuente de alimentación. Llene el capilar de vidrio de electroporación con PBS hasta uno o dos milímetros de la parte superior e inserte el electrodo recto de platino en el capilar de vidrio hasta que llegue al fondo del capilar. Ancle el electrodo en forma de L en la superficie de la placa de Petri de 30 milímetros llena de PBS.

Utilice una picobomba neumática para la inyección de ADN. Inserte la aguja de inyección desde el eblast lateral en la cavidad amniótica del embrión e inyecte aproximadamente cinco microlitros de solución de ADN en la cavidad o hasta que esté completamente llena. Ten cuidado de no reventar el embrión.

A continuación, coloque cuidadosamente el embrión entre los electrodos y mueva el electrodo capilar hasta el lugar preciso donde se va a entregar el ADN. Usando 200 voltios en seis pulsos de 50 milisegundos de duración cada uno, electroporó el embrión con un intervalo de un segundo entre cada pulso. Transfiera inmediatamente el embrión a un medio de cultivo preequilibrado antes de repetir la electroporación para el siguiente embrión.

Detecte células vivas o muertas electroporadas dos horas después de la electroporación. De acuerdo con el protocolo de texto que se muestra aquí, se trata de un embrión con epi PSCs que expresan EGFP de forma ubicua, injertado en E 7.5 y cultivado ex vivo durante 24 horas. Cuando se injertaron de 10 a 16 fscs en embriones E 7.5, se incorporaron y proliferaron bien dentro del embrión huésped.

Sin embargo, injertar más células no da como resultado un mejor quimerismo y, de hecho, da como resultado grupos no incorporados, como se demuestra aquí. Como se muestra en esta electroporación de plásmidos que expresan GFP. Las células positivas para GFP se detectaron una o dos horas después de la electroporación.

Cuando las células de éblasto distal en el embrión de la etapa de raya primitiva tardía fueron electroporadas, las células marcadas contribuyeron a la dermis neural después de 24 horas en cultivo, lo que corresponde a los mapas de destino conocidos de las células de episto en embriones en etapa gastro. Esta figura muestra que, de manera similar al uso de otros tipos de electrodos para la electroporación, el electrodo capilar también causó cierto grado de muerte celular en la región objetivo. Como esta región parecía de color más oscuro en comparación con las regiones vecinas, marcando los núcleos de las células muertas con una membrana impermeable, la fluorescencia roja lejana muere.

Se confirmó que la técnica de electroporación capilar da como resultado solo un pequeño número de células muertas cerca del sitio de electroporación. Al intentar estos procedimientos, es importante comenzar a cultivar los embriones dentro de las dos horas. Después de aislar el útero de los ratones al final del cultivo, se pueden fijar los embriones.

Se pueden realizar otros métodos, como la tinción de corte, para responder a preguntas adicionales, como la contribución de un donante o células electrotrenzadas a los embriones del huésped. Después de ver este video, deberíamos tener una buena comprensión de cómo transferir con precisión las células, nuestro ADN, a embriones de ratón tempranos después de la implantación.