Evaluación del estrés oxidativo en muestras biológicas utilizando el ensayo de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico

Por lo tanto, el ensayo TBARS se utiliza mejor para la evaluación general dentro del laboratorio del estrés oxidativo en muestras biológicas, en la que los niveles relativos de TBARS se comparan directamente entre muestras que se almacenaron y procesaron juntas. Estos ensayos tienen un costo extremadamente bajo de aproximadamente 3 para analizar 96 muestras en comparación con los kits disponibles comercialmente, que cuestan alrededor de 400, y permiten analizar solo un lote de muestras. El método descrito aquí se puede adaptar aún más para aplicaciones específicas, incluidos los estudios de estabilidad de muestras biológicas y aquellas para las que la adición de antioxidantes u otros tipos de conservantes de la muestra antes del análisis es apropiada u obligatoria.

Para evitar resultados muy variables, prepare reactivos frescos, asegurándose de que el pH no sea superior a cuatro para los reactivos de color y elimine las burbujas en la placa de hinchamiento nidese antes de medir la absorbancia. Comience preparando una solución acuosa al 0,8% de ácido tiobarbitúrico. Prepare una solución de hidróxido de sodio de cinco molares disolviendo cuatro gramos de perlas de hidróxido de sodio en 20 mililitros de agua.

Guarde la solución en un recipiente de plástico. Debe estar recién preparado para cada lote. Agregue cuatro gramos de ácido tiobarbitúrico a 450 mililitros de agua desionizada y use una barra magnética para disolverla suavemente.

Agregue lentamente aproximadamente cuatro mililitros de la solución de hidróxido de sodio en incrementos de 100 microlitros, verificando el pH a medida que se disuelven las partículas de ácido tiobarbitúrico. Continúe agregando el hidróxido de sodio hasta que todas las partículas se disuelvan. Verifique que el pH de la solución no sea superior a cuatro con una tira de pH, luego lleve el volumen final a 500 mililitros con agua desionizada y almacene la solución acuosa de ácido bárbaro tiobarbitúrico a temperatura ambiente.

Prepare soluciones de curva estándar de MDA bis dimetil acetal en tubos de polipropileno de dos mililitros con tapa a presión. Diluyendo la solución madre de 200 micromolares en agua, como se describe en el manuscrito del texto. Vórtice las muestras.

Etiquete los tubos de vidrio para las muestras que se van a analizar, luego agregue 100 microlitros de la muestra preparada a cada tubo. Agregue 200 microlitros de SDS al 8.1% a cada muestra y agite suavemente el tubo de vidrio con movimientos circulares para mezclar. Agregue 1,5 mililitros de tampón de acetato de sodio 3,5 molar a cada muestra, luego agregue 1,5 mililitros de la solución acuosa de ácido tiobarbitúrico al 0,8%.

Lleve el final de cada tubo a cuatro mililitros agregando 700 microlitros de agua desionizada. Tape herméticamente los tubos de vidrio e incubelos en un bloque calefactor ajustado a 95 grados centígrados durante una hora. Cubra los tubos con papel de aluminio para evitar la condensación, luego retire los tubos del bloque e incube en hielo durante 30 minutos.

Después de la incubación, centrifugar las muestras y los patrones a 1.500 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera 150 microlitros de sobrenadante de cada tubo a un pocillo en una placa de 96 pocillos, eliminando las burbujas de aire con la punta de la pipeta. Mida la absorbancia de las muestras a 532 nanómetros, luego reste la lectura promedio de absorbente de las muestras en blanco de todas las demás lecturas de absorbentes.

Cree una curva estándar y utilícela para calcular concentraciones de muestras desconocidas. Se generaron curvas estándar de MDA bis dimetil acetol para determinar los límites de detección y sensibilidad del ensayo y los niveles de oxidación en tres muestras biológicas diferentes. Se realizaron un total de 9 ensayos TBARS en las tres muestras en días diferentes.

Para determinar los límites de detección, se midió la absorbancia de las muestras en blanco en tres días diferentes. La concentración mínima de la sustancia TBARS necesaria para emitir una señal detectable que no absorba el ruido es de 1,1 micromolares. Y la sensibilidad del ensayo es de aproximadamente 0,0016 unidades de absorbentes por aumento micromolar en la concentración.

El ensayo TBARS se puede utilizar para detectar cambios en la peroxidación lipídica de diversas matrices biológicas. Para demostrar esto, se utilizaron dos cloruros de cobre para inducir la oxidación in vitro de lisados de células HEPG2 séricas humanas y lipoproteínas de baja densidad. Se realizó un ensayo TBARS en muestras de LDL que contenían EDTA y los niveles de TBARS no cambiaron entre las muestras de LDL tratadas y no tratadas con cobre.

Sin embargo, después de que el EDTA se eliminó por filtración por espín, el LDL se sometió a una oxidación mediada por cobre dos. Para ilustrar el rango dinámico del ensayo TBARS en suero humano, se añadió una concentración de dos milimolares de cobre y dos iones a las muestras, lo que dio lugar a un aumento de seis a siete veces en TBARS. Al intentar este protocolo, no deje las muestras en hielo durante más de 10 minutos y déjelas a temperatura ambiente después de la centrifugación.

En el caso de lotes o subconjuntos de muestras biológicas que no se recolectaron, procesaron y almacenaron originalmente juntos, se deben evaluar estadísticamente los datos de los efectos del lote para asegurarse de que la oxidación artefactal no contribuyó a los resultados. La oxidación invitro cuantificable intencional de lipoproteínas de baja densidad permite comprender cómo la oxidación afecta su biología funcional.