Generación de organoides nerviosos motores tridimensionales

Este protocolo facilita la investigación de los mecanismos subyacentes al desarrollo y la enfermedad de los haces de axones utilizando organoides nerviosos motores derivados de las células iPS humanas fuera de los cuerpos. Simplemente cultivando esferoides neuronales y chips de microcultivo hechos a medida, se pueden generar espontáneamente haces de axones unidireccionales y utilizarlos para varios experimentos posteriores. El organoide nervioso motor puede facilitar la detección y las pruebas de los fármacos para las enfermedades de las neuronas motoras, incluida la LS, al proporcionar un modelo más fisiológico que los sistemas in vitro anteriores.

En una campana extractora, y con el EPP adecuado, dispense tres mililitros de SU-8 2100 en una oblea de silicona limpia con acetona y coloque la oblea en el centro de un recubridor giratorio. Fije la oblea al vacío y haga girar la oblea a 500 revoluciones por minuto durante 10 segundos para cubrir el SU-8 uniformemente a través de la superficie de la oblea, luego gire la oblea a 1.500 revoluciones por minuto durante 30 segundos con una aceleración de 300 revoluciones por segundo para obtener una capa de fotorresistencia de 150 micras de espesor en la oblea. Después de hornear suavemente, coloque la fotomáscara en el alineador de máscaras y exponga la oblea a la luz ultravioleta durante 60 segundos.

Después de hornear en una placa caliente, revele la oblea durante 10 a 20 minutos en revelador fotorresistente con agitación en un agitador orbital, cambiando la solución de revelado una vez durante el proceso. Para preparar la capa inferior del chip para el cultivo de tejidos, vierta PDMS recién preparado en la oblea hasta el grosor deseado y desgasifique la mezcla en una cámara de vacío. Cura el PDMS en un horno durante al menos tres horas a 60 grados centígrados.

Después de enfriar, use una cuchilla para cortar el PDMS curado de la oblea, luego use PDMS sin curar con horneado para unir un depósito mediano a la capa inferior de PDMS para obtener el chip de cultivo de tejido PDMS ensamblado. Para preparar el chip PDMS para la formación de organoides nerviosos motores, esterilice el chip y un vaso de microscopio de 76 por 52 milímetros en una placa de Petri que contenga 70% de etanol durante al menos una hora. Al final de la incubación, coloque el chip en el cristal húmedo del microscopio.

Después del secado durante la noche, el chip debe adherirse al vidrio. Coloque una gota de 30 microlitros de matriz de membrana basal diluida en DMEM/F12 en un lado de la entrada del canal y aspire la solución desde el otro lado de la entrada para cubrir la superficie del microcanal con la matriz. A continuación, incube el chip PDMS con la solución de recubrimiento en una placa de Petri durante una hora a temperatura ambiente.

Para inducir la diferenciación de células iPS 3D en neuronas motoras, siembre cuatro veces 10 a la cuarta células iPS por pocillo en el número apropiado de pocillos de una placa inferior en U de 96 pocillos en 100 microlitros de alimentador y medio de cultivo celular sin suero suplementado con 10 micromolares Y-27632. Al día siguiente, reemplace el sobrenadante en cada pocillo con 100 microlitros de medio KSR suplementado con 10 SB431542 micromolares y 100 nanomolares LDN-193189. En los días dos y tres, reemplace los sobrenadantes con 100 microlitros de medio KSR suplementado con 10 SB431542 micromolares, 100 nanomolares LDN-193189, cinco micromolares DAPT, cinco micromolares SU5402, un micromolar de ácido retinoico y un agonista suavizado de micromolares.

En los días cuatro y cinco, reemplace los sobrenadantes con una mezcla de 75% de medio KSR y 25% de medio N2 suplementado con 10 SB431542 micromolares, 100 LDN193189 nanomolares, cinco micromolares DAPT, cinco micromolares SU5402, un micromolar de ácido retinoico y un micromolar de agonistas suavizados. En los días seis y siete, reemplace los sobrenadantes con una mezcla de 50% de medio KSR y 50% de medio N2 suplementado con cinco micromolares DAPT, cinco micromolares SU5402, un micromolar de ácido retinoico y un agonista alisado de micromolares. En los días ocho y nueve, reemplace los sobrenadantes con una mezcla de 25% de medio KSR y 75% de medio N2 suplementado con cinco micromolares DAPT, cinco micromolares SU5402, un micromolar de ácido retinoico y un agonista alisado de micromolares.

En los días 10 y 11, reemplace los sobrenadantes con medio N2 suplementado con TAPT de cinco micromolares, SU5402 de cinco micromolares, un ácido retinoico micromolar y un agonista suavizado de micromolares. En el día 12, reemplace los sobrenadantes en cada pocillo con 100 microlitros de medio de maduración suplementado con 20 nanogramos por mililitro de factor neurotrófico derivado del cerebro por pocillo. Para inducir la formación de organoides nerviosos motores, reemplace la solución de recubrimiento en el chip PDMS con 150 microlitros de medio de maduración complementado con 20 nanogramos por mililitro de factor neurotrófico derivado del cerebro y use una punta de micropipeta de diámetro ancho para agregar suavemente esferoides de neuronas motoras de un pocillo de la placa de 96 pocillos a la entrada del microcanal del chip.

Coloque un pequeño depósito de agua estéril cerca del chip de cultivo de tejidos en la placa para evitar la evaporación del medio y coloque la placa en una incubadora de 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Cada dos o tres días, reemplace la mitad del medio de cultivo agotado desde el centro del depósito del medio con un medio de maduración fresco suplementado con 20 nanogramos por mililitro de factor neurotrófico derivado del cerebro. Los axones crecerán desde el esferoide de la neurona motora hasta el canal, ensamblándose espontáneamente en un solo haz durante un período de dos a tres semanas para formar un organoide nervioso motor.

Las neuronas motoras se diferencian en un plazo de 12 a 14 días en procedimientos de diferenciación 3D. Es importante destacar que más del 60% de las células expresan el marcador de neurona motora HB9 durante la diferenciación y aproximadamente el 80% de las células del esferoide de la neurona motora son positivas para SMI32. Con el microcanal sirviendo como guías físicas, los axones se alargan desde el esferoide de la neurona motora para formar un agrupamiento por interacción axo-axonal dentro de las 24 horas posteriores a la introducción al esferoide.

Los axones alcanzaron el centro del microcanal en los siguientes tres o cuatro días, extendiéndose al otro extremo del microcanal después de 10 días adicionales. Los organoides nerviosos motores se pueden recolectar del chip para su análisis biológico separando el PDMS del vidrio del microscopio. Los haces de axones y los cuerpos celulares se pueden diseccionar y aislar bajo un microscopio con un bisturí quirúrgico o pinzas.

En los haces de axones de los organoides nerviosos motores, las proteínas marcadoras dendríticas no se detectan mediante Western blot. Es importante asegurarse de que los esferoides caigan completamente al fondo dentro del chip de cultivo. Mostramos que el examen de los sitios y la parte inferior puede ayudar a determinar la ubicación del esferoide en el chip.

Los haces de axones aislados se pueden examinar para varios métodos adicionales. Se puede obtener una gran cantidad de axones y utilizarlos para ensayos bioquímicos que requieren materiales sustanciales.