Generación de uniones neuromusculares mediante un dispositivo microfluídico

Comience con un dispositivo microfluídico recubierto de polímero con pozos interconectados que llevan compartimentos espejados que están conectados a través de microranuras.

Siembra células progenitoras neurales en los pocillos de un compartimento.

Permita que migren al canal interconectado y se adhieran al polímero.

Superposición con un medio de crecimiento para promover la maduración neuronal en neuronas motoras.

En el compartimento opuesto, siembre los pozos con células progenitoras musculares, que migran y se adhieren al canal interconectado.

Reemplace el medio con un medio de diferenciación, induciendo la fusión de células progenitoras musculares y formando células musculares multinucleadas.

Agregue el medio de diferenciación neuronal que contiene factores de crecimiento al compartimento que contiene células musculares.

Mientras tanto, agregue medio volumen de medio libre de factor de crecimiento al compartimento que contiene células neurales.

Los factores de crecimiento y un mayor volumen de medio en el compartimento opuesto promueven que las neuronas motoras extiendan sus procesos a través de los microsurcos.

Estos procesos neuronales luego se conectan con las células musculares, formando uniones neuromusculares.

Para colocar las células progenitoras neurales, o NPC, en el dispositivo microfluídico, retire DPBS de dos pocillos en un lado de las microranuras del dispositivo con una pipeta de 200 microlitros. Para sembrar un total de 250,000 NPC en 60 a 100 microlitros de medio de neurona motora de día 10 por dispositivo en el pozo superior derecho, siembre la mitad de la suspensión celular cerca de la abertura del canal en un ángulo de 45 grados.

Haga una pausa durante unos segundos para permitir que la suspensión celular fluya a través del canal antes de agregar la mitad restante de la suspensión celular en el pocillo inferior. Use un bolígrafo para marcar el lado sembrado como NPC o equivalente para facilitar la orientación del dispositivo sin un microscopio e incube durante cinco minutos para la fijación celular. A continuación, rellene lentamente los dos pocillos sembrados por NPC con un medio de neurona motora adicional de día 10 hasta un volumen total de 200 microlitros por pocillo. Con una pipeta de 200 microlitros, retire los DPBS de los dos pocillos del otro lado de las microranuras opuestas a los NPC recién sembrados.

Agregue 200 microlitros de medios de neuronas motoras del día 10 por pocillo a los pocillos no sembrados. Luego, agregue 6 mililitros de DPBS por plato de 10 centímetros alrededor del dispositivo para evitar la evaporación del medio durante la incubación.

Para cambiar el medio, retire lentamente el medio en ambos pocillos con NPC colocando la punta de la pipeta de 200 microlitros en el borde inferior de la pared del pocillo opuesto a la abertura del canal. Para evitar que un flujo de medio fuerte dañe las células en el canal, agregue lentamente de 50 a 100 microlitros de medio de neurona motora fresca a cada pocillo, cambiando continuamente entre el pozo superior e inferior. Repita el proceso hasta que cada pocillo contenga 200 microlitros de medio.

El día 17 de la diferenciación de la neurona motora, retire el medio de la neurona motora en el lado no sembrado de las microranuras del dispositivo con una pipeta de 200 microlitros y lave los pocillos con DPBS. Siembre un total de 200,000 mesoangioblastos primarios humanos o MAB en 60 a 100 microlitros de medio de crecimiento por dispositivo sembrando la mitad de la suspensión celular en el pocillo superior.

Haga una pausa de unos segundos para permitir que la suspensión celular fluya a través del canal antes de sembrar la mitad restante de la suspensión celular en el pozo inferior, como se demostró anteriormente para la siembra de NPC. Incube el dispositivo durante cinco minutos para la fijación celular. Luego, rellene los dos pozos recién sembrados con MAB con un medio de crecimiento adicional e incube nuevamente como se demostró.

Para iniciar el gradiente quimiotáctico y volumétrico en el día 21 de la diferenciación de la neurona motora, agregue 200 microlitros por pocillo de medio basal de la neurona motora que contenga factores de crecimiento al compartimento del miotubo. Luego, agregue 100 microlitros por pocillo de medio basal de la neurona motora sin factores de crecimiento al compartimento de la neurona motora.