Protocolo para tridimensional confocal morfométrico Análisis de astrocitos
11 de diciembre de 2015
Los astrocitos en el SNC cambian sus propiedades funcionales y estructurales en respuesta a estímulos dañinos. Este informe presenta un protocolo para la evaluación de la morfología tridimensional de los astrocitos en condiciones de enfermedad o después de intervenciones terapéuticas.
El objetivo general de este procedimiento es evaluar la morfología de los astrocitos mediante el análisis de imágenes tridimensionales de astrocitos adquiridas mediante microscopía confocal. Este método puede utilizarse para evaluar los cambios morfológicos que pueden aparecer en diversos tipos celulares, ya sea en condiciones patológicas o como efecto de una estrategia de intervención. La principal ventaja de esta técnica es que muchos parámetros asociados con la arquitectura celular pueden estudiarse simultáneamente.
La Dra. Mariam Bodel demostrará este procedimiento siguiendo la preparación de portaobjetos para tinción inmunohistoquímica desparafinando los cortes mediante su inmersión en xilol dos veces durante 10 minutos. Incubar los portaobjetos durante 10 minutos en cada una de las siguientes soluciones de etanol: 99,8 %, 95 % y 70 %, para rehidratar los cortes tras el lavado. Incubar los portaobjetos en una dilución 1:1500 de la solución de anticuerpo primario contra la proteína ácida fibrilar de la glía o GFAP en PBS a cuatro grados Celsius durante la noche.
Después de la incubación, lave los cortes en PBS tres veces durante cinco minutos. A continuación, incube los portaobjetos con una solución de anticuerpo secundario conjugado a fosfatasa alcalina al 1:100 durante una hora a temperatura ambiente. Nuevamente, lave los cortes en PBS tres veces durante cinco minutos, menos de 30 minutos antes de su uso.
Agregue una gota de solución cromógena roja a tres mililitros de tampón de sustrato. Incube cada portaobjetos en 100 microlitros de esta solución durante 15 a 20 minutos en la oscuridad. Luego lave los portaobjetos en PBS 3 veces durante cinco minutos.
Finalmente, tiña los núcleos con DPI diluido uno a 500 en PBS. Aplique una a dos gotas de medio Antifa sobre la sección e inmediatamente selle con un cubreobjetos. Incube las preparaciones a cuatro grados Celsius durante 24 a 48 horas antes de la microscopía para asegurar el sellado.
Para comenzar la microscopía confocal, coloque un portaobjetos sobre la platina del microscopio y seleccione el objetivo de 63 x. Después de abrir el software de adquisición, haga clic en configuración rápida en la pestaña de adquisición y seleccione el piso adecuado de fours. Aquí se utilizan dappy y Alexa, piso 5 55.
A continuación, haga clic en mejor señal, seguido de aplicar. Luego, haga clic en establecer exposición para permitir que la computadora determine los parámetros óptimos de exposición. Para optimizar la imagen, abra la ventana de canales y cambie la imagen a directa. Ajuste el enfoque si es necesario.
Luego, haga clic en un au para optimizar el diafragma, ajuste la ganancia para obtener la mejor intensidad. Finalmente, establezca la ganancia digital entre dos y tres. Después de esta optimización, detenga la imagen en vivo y abra la ventana del modo de adquisición.
Ajuste el tamaño del marco haciendo clic en X por Y y seleccione 10 24 por 10 24. También elija una velocidad lenta. A continuación, abra la pestaña de promedio y seleccione un número mayor o igual a cuatro.
Luego haga clic en el botón de captura y guarde la imagen 2D capturada. Para configurar la imagen 3D, abra la pestaña de configuración rápida y marque el elemento de pila ZS, lo que hará que se abra la ventana de pila Zs. Para establecer las posiciones inicial y final del Zack, haga clic nuevamente en vivo y ajuste el enfoque a la posición más alta del astrocito.
Haga clic en establecer primero. A continuación, ajuste el enfoque a la posición más baja del astrocito y haga clic en establecer último, luego detenga la vista en vivo. A continuación, elija el intervalo haciendo clic en óptimo.
Para establecer el número de cortes aquí, el intervalo es de 1,01 micrómetros. Finalmente, haga clic en inicio, experimento, y guarde las imágenes una vez completada la exploración. Asimismo, adquiera una imagen 2D utilizando un objetivo de 10 x o 20 x.
Para mediciones de intensidad de fluorescencia, seleccione la herramienta de rectángulo o círculo en la ventana de imagen y resalte un área para medición con el fin de cuantificar el volumen y el área superficial del cuerpo celular del soma nuclear del astrocito y su territorio. Transfiera las imágenes 3D a un programa de software de análisis adecuado, como Velocity 6.1 en el software de análisis. Cree una nueva biblioteca y arrastre todas las imágenes a la columna gris izquierda.
Seleccione una imagen 3D y active uno de los canales adquiridos de interés, como dapi. Para mediciones nucleares, ajuste manualmente el brillo para optimizar el contraste. Ahora seleccione el menú de herramientas.
Seleccione crear volumen y genere una única imagen 3D a partir de las imágenes de Zack. Abra el menú de edición y haga clic en propiedades. Asegúrese de que las propiedades X, Y y Z estén visibles.
A continuación, seleccione la herramienta de ROI de mano alzada desde la barra de herramientas. Con la herramienta seleccionada, trace una línea alrededor del núcleo etiquetado como DPI para medir el volumen y el área superficial del núcleo del astrocito. Nuevamente, utilizando la herramienta de ROI de mano alzada, mida el volumen y el área superficial del astrocito completo trazando una línea alrededor del soma, siguiendo la superficie de todas las ramas.
Haga clic en el menú de mediciones en la parte superior de la ventana de la imagen, arrastre encontrar objetos hasta la parte superior de la ventana y asigne un nombre descriptivo a la población uno, seleccione el color asociado y haga clic en medir, lo que abrirá una nueva ventana. En esta nueva ventana, elija volumen o área de superficie como el parámetro y haga clic en aceptar.
Para guardar los datos, haga clic en el menú de mediciones y seleccione crear elemento de medición. Seleccione un nuevo elemento de medición en la ventana. Ingrese un nombre de archivo para los datos y haga clic en aceptar.
Finalmente, exporte los datos de medición a un paquete de software adecuado para realizar el análisis estadístico y generar gráficos de datos. Aquí, los investigadores compararon astrocitos en tejido cerebral fijado de ratas tratadas con amiloide beta uno 40 o con amiloide beta uno 40 e Ian. La inyección del tratamiento con la proteína amiloide produjo astrocitos con ramas más gruesas y largas.
Estos astrocitos de animales tratados con Ian exhibieron una forma estrellada con ramas cortas y delgadas. Las ratas tratadas con Ian también mostraron una reducción en la fluorescencia positiva para GFAP de astrocitos en cortes cerebrales. El análisis morfométrico de volúmenes específicos de astrocitos reveló que el volumen del núcleo celular del astrocito, del cuerpo celular completo del astrocito y del territorio del astrocito disminuyó con el tratamiento con Ian en comparación con el tratamiento con amiloide solo.
Una vez dominada esta imagen, la técnica de análisis puede completarse en unos pocos minutos por célula si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante marcar la estructura con alta precisión. Es recomendable practicar el marcado manual de la estructura de interés antes de comenzar el experimento tras su desarrollo.
Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología celular, la histología y la patología exploraran la estructura de una célula en condiciones sanas o patológicas. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo medir 12 parámetros diferentes para una sola célula utilizando imágenes tridimensionales.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Descripción general
Este informe presenta un protocolo para evaluar la morfología de astrocitos en tres dimensiones mediante microscopía confocal. El método evalúa los cambios morfológicos en astrocitos bajo condiciones patológicas o tras intervenciones terapéuticas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Patología
Antecedentes
- Los astrocitos en el SNC presentan cambios en respuesta a estímulos dañinos.
- Comprender la morfología de los astrocitos es fundamental para estudiar diversas afecciones neurológicas.
- Este protocolo permite el análisis simultáneo de múltiples parámetros de arquitectura celular.
- La microscopía confocal proporciona imágenes tridimensionales de alta resolución.
Objetivo del estudio
- Evaluar la morfología de los astrocitos en condiciones patológicas.
- Evaluar los efectos de intervenciones terapéuticas sobre la estructura de los astrocitos.
- Desarrollar un protocolo confiable para el análisis morfológico.
Métodos Utilizados
- Preparación de láminas para tinción inmunohistoquímica.
- Desparafinización de cortes mediante xilol.
- Rehidratación de cortes mediante soluciones de etanol graduadas.
- Incubación con anticuerpo primario contra GFAP para la identificación de astrocitos.
Resultados principales
- Demostración de cambios morfológicos en astrocitos.
- Identificación de alteraciones estructurales en respuesta a intervenciones.
- Validación del protocolo para estudios futuros.
Conclusiones
- El protocolo evalúa eficazmente la morfología de los astrocitos.
- Los hallazgos contribuyen a comprender los roles de los astrocitos en la patología del sistema nervioso central.
- Las aplicaciones futuras podrían mejorar las estrategias terapéuticas para enfermedades neurológicas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La evaluación cuantitativa de la morfología de los astrocitos permite reducir riesgos mecanicistas en la validación de dianas neurodegenerativas al vincular cambios estructurales con intervenciones terapéuticas. Este enfoque morfométrico confocal en 3D respalda la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento al proporcionar lecturas multiparamétricas que reflejan respuestas gliales específicas de la vía. El método mejora la continuidad traslacional desde modelos in vitro o in vivo hasta la toma de decisiones preclínicas mediante flujos de trabajo de imagen estandarizados y reproducibles.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Interroga la hipótesis terapéutica mediante la cuantificación del remodelado estructural de los astrocitos en respuesta al beta-amiloide y a estrategias de intervención.
- Valor operativo: Permite la validación funcional del objetivo mediante un análisis multiparamétrico de la reactividad glial, reduciendo la ambigüedad mecanicista en la interacción con el objetivo en el sistema nervioso central.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para flujos de trabajo posteriores mediante el establecimiento de fenotipos morfológicos basales e inducidos por intervenciones.
- Valor operativo: Aborda la estandarización y reproducibilidad del ensayo mediante salidas morfométricas cuantitativas de 12 parámetros adecuadas para la adaptación a cribado de alto contenido.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Analiza la relevancia de la enfermedad mediante la modelización de la astrogliosis reactiva en tejido cerebral de rata expuesto a amiloide, alineándose con las vías de biomarcadores traslacionales en la neurodegeneración.
- Valor operativo: Describe la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al permitir el seguimiento longitudinal de los cambios estructurales en astrocitos a través de diferentes condiciones de tratamiento.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento, desde la prueba de hipótesis hasta la identificación de compuestos activos, al proporcionar datos cuantitativos sobre la morfología glial que orientan la selección de dianas y la reducción de riesgos en las vías.
- Biología del Descubrimiento: Explica cómo el método respalda la prueba de hipótesis, la aclaración de vías o la reducción de riesgos biológicos mediante la fenotipificación estructural de astrocitos en contextos patológicos y de intervención.
- Selección: Describe la preparación del ensayo, la reproducibilidad o las salidas cuantitativas cuando el artículo lo respalda mediante imágenes 3D estandarizadas y análisis multiparamétrico.
- Análisis: Destaca las mediciones, lecturas o salidas estadísticas que ayudan a los equipos a comparar condiciones, incluyendo volumen, área superficial, longitud de ramas, número, intensidad de fluorescencia y densidad.
- Investigación Traducional: Relaciona el método con la continuidad preclínica o la alineación de biomarcadores solo cuando la fuente lo respalda mediante modelos de reactividad de astrocitos relevantes para enfermedades.
- Reutilización Empresarial: Presenta el método como una capacidad reutilizable en lugar de una técnica de uso único, mediante protocolos estandarizados de imagen y análisis aplicables a diversos tipos celulares y condiciones.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva, validación de objetivos y reducción de ambigüedad mecanicista.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción, eficiencia del capital y reducción del riesgo biológico en fases avanzadas.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo y decisiones de avance.
Consideraciones de Implementación
- Conocimientos científicos especializados en microscopía confocal, tinción inmunohistoquímica y análisis de imágenes 3D.
- Requisitos de instrumentación e infraestructura analítica, incluido un microscopio confocal con capacidad de adquisición de cortes Z y software de análisis 3D como Volocity.
- Requisitos de estandarización entre equipos para protocolos de tinción, parámetros de imagen y consistencia en las mediciones morfométricas.
- Consideraciones de adaptación entre sistemas modelo, incluyendo preparaciones de astrocitos in vivo e in vitro de diversas especies.
- Limitaciones prácticas respaldadas por la documentación original, incluyendo la necesidad de marcado manual preciso de estructuras y la optimización de los parámetros de imagen para la relación señal-ruido.
