Protocolo para tridimensional confocal morfométrico Análisis de astrocitos

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la morfología de los astrocitos mediante el análisis de imágenes tridimensionales de astrocitos que se adquirieron mediante microscopía confocal. Este método se puede utilizar para evaluar los cambios morfológicos que pueden aparecer en varios tipos de células, ya sea en condiciones patológicas o como efecto de una estrategia de intervención. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden estudiar simultáneamente muchos parámetros asociados a la arquitectura celular.

La Dra. Mariam Bodel demostrará este procedimiento: Después de la preparación de los portaobjetos para la tinción inmunohistoquímica, deparice las secciones sumergiéndolas en xileno dos veces durante 10 minutos. Incube los portaobjetos durante 10 minutos en etanol al 99,8 %, 95 % y 70 % para rehidratar las secciones después del lavado. PBS: incube los portaobjetos en una dilución de uno a 1500 de proteína ácida fibrilar glial o solución de anticuerpos primarios GFAP a cuatro grados centígrados durante la noche.

Después de la incubación, lavar las secciones en PB S3 varias veces durante cinco minutos. A continuación, incubar los portaobjetos con una solución de anticuerpos secundarios conjugados de fosfatasa alcalina de uno a 100 durante una hora a temperatura ambiente. Nuevamente, lave la sección en PB S3 veces durante cinco minutos, menos de 30 minutos antes de usarla.

Agregue una gota de solución de cromógeno rojo a tres mililitros de tampón de sustrato. Incuba cada portaobjetos en 100 microlitros de esta solución durante 15 a 20 minutos en la oscuridad. A continuación, lave los portaobjetos en PB S3 varias veces durante cinco minutos.

Finalmente, tiñe los núcleos con DPI diluido de uno a 500 en PBS. Aplique una o dos gotas de medio Antifa en la sección e inmediatamente selle con un cubreobjetos. Incubar los portaobjetos a cuatro grados centígrados durante 24 a 48 horas antes de la microscopía para asegurar el sellado.

Para comenzar la microscopía confocal, coloque un portaobjetos en la platina del microscopio y seleccione el objetivo de 63 x. Después de abrir el software de adquisición, haga clic en configuración inteligente en la pestaña de adquisición y seleccione el piso de cuatro adecuados. Aquí, dappy y Alexa, piso 5 55 se utilizan.

A continuación, haga clic en mejor señal, seguido de aplicar. Luego haga clic en establecer exposición para permitir que la computadora determine los parámetros de exposición óptimos Para optimizar la imagen, abra la ventana de canales y cambie la imagen a en vivo. Ajuste el enfoque si es necesario.

Luego haga clic en una au para optimizar el agujero de alfiler, ajuste la ganancia para obtener la mejor intensidad. Por último, ajuste la ganancia digital entre dos y tres. Después de esta optimización, detenga la imagen en vivo y abra la ventana del modo de adquisición.

Ajuste el tamaño del marco haciendo clic en X por Y y seleccione 10 24 por 10 24. También elija una velocidad lenta. A continuación, abra la pestaña de promedio y seleccione un número mayor o igual que cuatro.

A continuación, haga clic en el botón de ajuste y guarde la imagen 2D capturada. Para configurar imágenes 3D, abra la pestaña de configuración inteligente y marque el elemento de la pila ZS, lo que hará que se abra la ventana de la pila Zs. Para establecer la primera y la última posición del Zack, de nuevo, haga clic en vivo y ajuste el enfoque a la posición más alta del astrocito.

Haga clic en establecer primero. Ahora ajuste el enfoque a la posición más baja del astrocito y haga clic en establecer el último, luego detenga la vista en vivo. A continuación, elija el intervalo haciendo clic en óptimo.

Para establecer el número de cortes aquí, el intervalo es de 1,01 micrómetros. Finalmente, haga clic en iniciar, experimente y guarde las imágenes una vez que se complete el escaneo. Además, adquiera una imagen 2D utilizando un objetivo de 10 x o 20 x.

Para las mediciones de la intensidad de fluorescencia, seleccione la herramienta rectángulo o círculo en la ventana de la imagen y resalte un área de medición para cuantificar el volumen y el área de superficie del cuerpo y el territorio de la célula del soma del núcleo del astrocito. Transfiera las imágenes 3D a un programa de software de análisis adecuado, como Velocity 6.1 en el software de análisis. Crea una nueva biblioteca y arrastra todas las imágenes a la columna gris de la izquierda.

Seleccione una imagen 3D y active uno de los canales de interés adquiridos, como dapi. Para mediciones nucleares, ajuste manualmente el brillo para optimizar el contraste. Ahora seleccione el menú de herramientas.

Elija crear volumen y produzca una sola imagen 3D a partir de las imágenes de Zack. Abra el menú de edición y haga clic en propiedades. Asegúrese de que se muestren las propiedades X, Y y Z.

A continuación, elija la herramienta ROI a mano alzada de la barra de herramientas. Con la herramienta seleccionada, dibuje una línea alrededor del núcleo marcado con DPI para medir el volumen y el área de superficie del núcleo del astrocito. De nuevo, utilizando la herramienta ROI a mano alzada, mida el volumen y la superficie de todo el astrocito dibujando una línea alrededor del soma siguiendo la superficie de todas las ramas.

Haga clic en el menú de medidas en la parte superior de la ventana de la imagen, arrastre buscar objetos a la parte superior de la ventana y asigne un nombre descriptivo a la población uno, seleccione el color asociado y haga clic en medir, lo que abrirá una nueva ventana. En esta nueva ventana. Elija volumen o área de superficie como parámetro y haga clic en Aceptar.

Para guardar los datos, haga clic en el menú de medición y seleccione hacer elemento de medición. Seleccione un nuevo elemento de medición llamado desde la ventana. Introduzca un nombre de archivo para los datos y haga clic en Aceptar.

Por último, exporte los datos de medición a un paquete de software adecuado para realizar análisis estadísticos y generar gráficos de datos. Aquí, los investigadores compararon astrocitos en tejido cerebral fijo de ratas tratadas con beta amiloide uno 40 o con beta amiloide uno 40 e Ian. La inyección del tratamiento con la proteína amiloide dio como resultado astrocitos con ramas más gruesas y largas.

Estos astrocitos de los animales tratados con Ian exhibían una forma estrellada con ramas cortas y delgadas. Las ratas tratadas con Ian también demostraron una reducción de la fluorescencia positiva de GFAP en los astrocitos en los cortes de cerebro. El análisis morfométrico de los volúmenes específicos de astrocitos reveló que el volumen del núcleo del astrocito, el cuerpo celular, todo el astrocito y el territorio de los astrocitos disminuyeron con el tratamiento con Ian en comparación con el tratamiento con amiloide solo.

Una vez dominada esta imagen, la técnica de análisis puede completarse en unos pocos minutos por celda si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante marcar la estructura con alta precisión. Lo mejor es practicar marcando la estructura de interés manualmente antes de comenzar el experimento después de su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología celular, la histología y la patología exploraran la estructura de una célula en un entorno sano o enfermo. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo medir 12 parámetros diferentes para una sola celda usando imágenes en 3D.