Mapeo de las relaciones estructura-función de los factores de transcripción oncogénicos desordenados utilizando el análisis transcriptómico

Es difícil realizar un análisis de la función estructural de los factores de transcripción repetitivos y desordenados. Al acoplar la transcriptómica con el contexto celular correcto, este enfoque descubre mejor importantes relaciones entre la estructura y la función. El uso de la secuenciación de ARN como resultado funcional permite la evaluación efectiva de todos los genes regulados por una sola proteína en un solo experimento, lo que hace más probable la detección de funciones parciales.

La detección de la función parcial es particularmente importante para los factores de transcripción de fusión oncogénica, ya que no sabemos cómo funcionan estas proteínas y su secuenciación puede conducir a mejores terapias en los cánceres impulsados por la fusión. Aunque nos centraremos en el dominio EWS desordenado en EWS/FLI, EWS está implicado en otras fusiones que contienen dominios desordenados con funciones poco definidas. Para una transducción de constructos de expresión de ADNc, primero descongele rápidamente el virus congelado con construcciones de ADNc en un baño de agua a 37 grados Celsius y mezcle suavemente 2,5 microlitros de ocho miligramos por mililitro de polibreno en cada vile.

A continuación, retire el medio de una placa de cultivo celular de 10 centímetros con un 50 a 70% de confluencia por construcción de vial y evite suavemente todo el volumen de dos mililitros de construcción por el costado de la placa. Agite la placa para propagar el virus de manera uniforme a través de las células y coloque la placa en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados Celsius durante dos horas, meciendo la placa cada 30 minutos para evitar que cualquier área de la placa se seque. Al final de la incubación, agregue cinco mililitros de medio suplementado con suero fetal bovino, antibióticos, piruvato de sodio y polibreno.

Después de la incubación nocturna en la incubadora de cultivo celular, reemplace el sobrenadante con medio de selección y regrese las células a la incubadora de cultivo celular durante siete a 10 días adicionales para permitir la selección y la expresión de la construcción de ADNc. Al final del período de selección, recoja las células en un tubo cónico de 15 mililitros para contar y asigne de cinco a 10 veces 10 a la quinta célula en un nuevo tubo para la secuenciación del ARN y dos veces 10 a las seis células en otro tubo nuevo para la extracción de proteínas. Sedimentar las células por centrifugación y resuspender los gránulos en un mililitro de PBS frío o en una centrifugación de cinco minutos.

A continuación, congele rápidamente tanto los gránulos como el nitrógeno líquido y almacene las células a menos 80 grados centígrados. Para validar la eliminación de las proteínas de interés y la expresión del panel de constructos, se secaron las muestras de lisado de proteínas con los anticuerpos primarios y secundarios apropiados de acuerdo con los protocolos estándar de análisis de Western blot. Para evaluar la calidad y cantidad de ARN, utilice el tampón de lisis de un kit de extracción basado en columna de centrifugación de sílice para lisar las muestras de células de secuenciación de ARN y aplique los lisados a una columna de eliminación de ADN genómico a más de 13.000 revoluciones por minuto durante 30 a 60 segundos.

A continuación, proceda con la purificación de la columna de centrifugación de sílice y lave el ARN en la columna de acuerdo con las instrucciones del kit. A continuación, eluir el ARN en 30 microlitros de tampón de elución y analizar al menos 2,5 microgramos de ARN en un espectrofotómetro en una proporción de 260 a 280 nanómetros para evaluar la cantidad de ARN y la calidad de la muestra. Para el análisis de archivos fastq, use Putty para abrir el terminal al entorno de computación de alto rendimiento y crear un directorio de análisis llamado project.

Navegue hasta la ruta de acceso al directorio del proyecto y cree un directorio para los archivos de fastq. gz sin procesar comprimidos llamado fastq y un segundo directorio llamado trimmed. Utilice un programa de transferencia de archivos seguro adecuado para transferir el fastq sin procesar comprimido.

gz del almacenamiento local a la ruta al directorio fastq del proyecto y compruebe que haya un archivo R1 y un archivo R2 para cada muestra. Navegue hasta la ruta para proyectar fastq y use el comando en trim galore como se indica para recortar las lecturas de baja calidad del fastq. gz.

Navegue hasta la ruta al directorio del proyecto y cree un nuevo directorio llamado STAR output. Navegue hasta la ruta al directorio de recorte del proyecto y use el comando como se indica para ejecutar STAR para alinear el fastq recortado. gz.

Localice la salida necesaria para los siguientes pasos, que contiene los recuentos por transcripción en la ubicación indicada y utilice el comando para leer en cada archivo de pestañas de lecturas por gen de salida. Para la primera columna, use solo los caracteres antes del punto en la columna de ID de gen ENSEMBL para facilitar el procesamiento posterior. A continuación, utilice el comando para compilar los recuentos de todas las muestras en el marco de datos llamado totcts y guarde esta nueva tabla de datos de recuento sin procesar como un archivo de texto delimitado por tabulaciones.

Para definir el perfil de expresión diferencial para cada constructo mediante DESeq2, introduzca el diseño experimental de DESeq2 y utilice el conjunto de datos DESeq de la función de matriz para construir un conjunto de datos DESeq para estimar los factores de tamaño y ejecutar DESeq2. Para evaluar la calidad del análisis, utilice DESeq2 para extraer los recuentos normalizados de registros regularizados. Al extraer los resultados de cada perfil transcripcional de los resultados de DESeq2, realice comparaciones por pares en referencia a la condición de derribo o al vector vacío de referencia.

Modifique aún más estos resultados con los símbolos del gen HGNC y extraiga los datos de los datos de DESeq2 como un solo archivo con el ID del gen ENSEMBL, el símbolo HENGC, la expresión baseMean y los datos de expresión diferencial para todos los constructos con cambio logarítmico doble y valores P brutos y ajustados. Evalúe la normalización correcta de lotes y la similitud de la muestra de interés, y use el código para usar los recuentos normalizados de registro regularizados para verificar la agrupación de muestras con análisis de componentes principales y gráficos de distancia de muestra a muestra. Utilice los recuentos logarítmicos normalizados regularizados para extraer los 1.000 genes más variables en una matriz y utilice un mapa de calor para realizar un agrupamiento jerárquico no supervisado de las muestras basadas en estos genes.

Para extraer los clústeres de intereses del dendrograma, decida qué nivel del dendrograma aparecen los clústeres de intereses y establezca K igual al número de clústeres en ese nivel. Para determinar qué clústeres son de interés, vuelva a trazar el mapa de calor ordenado por grupo y exporte la lista de genes asociados con cada grupo en una tabla, luego use una herramienta bioinformática adecuada para identificar las funciones biológicas de los diferentes grupos de genes identificados y comparados entre las clases. En este análisis representativo se puede observar un derribo y rescate efectivo con los constructos positivo y negativo.

Hay que tener en cuenta que las células rescatadas por DAF no lograron formar colonias, lo que sugiere una transformación oncogénica alterada. Una vez completada la validación del replicante, se pueden obtener ensayos fenotípicos y recuentos de genes de procesamiento de datos de secuenciación inicial de ARN para todas las muestras para la normalización y el análisis de lotes. DESeq2 sin normalización de lotes puede dar lugar a defectos de confusión en los lotes, probablemente debidos a la variabilidad biológica introducida por el paso de células en cultivo y a las diferencias en el procesamiento de cada lote.

Después de la normalización por lotes, DESeq2 se puede utilizar para generar perfiles transcripcionales para los constructos de interés, en relación con la línea de base. El análisis de componentes principales de estos datos sugiere que el perfil transcripcional de DAF es intermedio, entre EWS/FLI de tipo salvaje y Delta 22, lo que confirma la función parcial. Además, la agrupación jerárquica de los 1.000 genes más variables en las muestras muestra que DAF no logra reprimir los genes objetivo de EWS/FLI y solo conserva parcialmente la actividad de activación génica.

El análisis de genes Top sugiere que las clases de genes que activa DAF son funcionalmente distintas de las dianas activadas por EWS/FLI en las que DAF no es funcional. Curiosamente, DAF es más capaz de rescatar genes activados por microsatélites GGAA, pero no puede rescatar genes activados cerca de un sitio de alta afinidad. El emparejamiento de la salida transcriptómica con los ensayos fenotípicos relevantes completa el análisis de la función estructural.

Los investigadores también pueden utilizar otras técnicas para estudiar los impulsores mecanicistas de diferentes funciones transcripcionales.