Name: El análisis de la internalización celular de nanopartículas y bacterias en un Multi-espectral de Citometría de Flujo de imágenes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 7 s
Description: Aprende a analizar la internalización celular de nanopartículas y bacterias mediante citometría de flujo de imágenes multiespectral en células RAW 264.7. Este método permite distinguir partículas internalizadas de las unidas a la superficie.

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Los autores desean agradecer el Premio ONR-Muri (NN00014-06-1-1176) y el Ejército de los EE.UU. de Investigación Médica y Material de comandos (números de concesión W81XWH-09-1-0386 y W81XWH-10-1-0806) de financiera apoyar.

<ol><li>Ulery, B. D., Kumar, D., Ramer-Tait, A. E., Metzger, D. W., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+protective+single-dose+intranasal+nanoparticle-based+vaccine+platform+for+respiratory+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Design of a protective single-dose intranasal nanoparticle-based vaccine platform for respiratory infectious diseases.</a> PLoS One. 6, e17642(2011).</li>
<li>Kasturi, S. P., Skountzou, I., Albrecht, R. A., Koutsonanos, D., Hua, T., Nakaya, H. I., Ravindran, R., Stewart, S., Alam, M., Kwissa, M., Villinger, F., Murthy, N., Steel, J., Jacob, J., Hogan, R. J., García-Sastre, A., Compans, R., Pulendran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+the+magnitude+and+persistence+of+antibody+responses+with+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Programming the magnitude and persistence of antibody responses with innate immunity.</a> Nature. 470, 543-547 (2011).</li>
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<li>Pfeifer, B. A., Burdick, J. A., Little, S. R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ester-anhydride%29%3Apoly%28beta-amino+ester%29+micro-+and+nanospheres%3A+DNA+encapsulation+and+cellular+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Poly(ester-anhydride):poly(beta-amino ester) micro- and nanospheres: DNA encapsulation and cellular transfection.</a> Int. J. Pharm. 304, 210-219 (2005).</li>
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<li>Rieger, A. M., Hall, B. E., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+differentially+modulates+particle+binding%2C+phagocytosis+and+downstream+antimicrobial+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Comp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation differentially modulates particle binding, phagocytosis and downstream antimicrobial mechanisms.</a> Dev. Comp. Immunol. 34, 1144-1159 (2010).</li>
<li>Murphy, K. C., Campellone, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lambda+Red-mediated+recombinogenic+engineering+of+enterohemorrhagic+and+enteropathogenic+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Lambda Red-mediated recombinogenic engineering of enterohemorrhagic and enteropathogenic E. coli.</a> BMC. Mol. Biol. 4, 11(2003).</li>
<li>Karsi, A., Lawrence, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+host+range+fluorescence+and+bioluminescence+expression+vectors+for+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">Broad host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for Gram-negative bacteria.</a> Plasmid. 57, 286-295 (2007).</li>
<li>Ulery, B. D., Phanse, Y., Sinha, A., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B., Bellaire, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+chemistry+influences+monocytic+uptake+of+polyanhydride+nanospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres.</a> Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).</li>
<li>Doherty, G. J., McMahon, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of endocytosis.</a> Annu. Rev. Biochem. 78, 857-902 (2009).</li>
<li>Vercauteren, D., Vandenbroucke, R. E., Jones, A. T., Rejman, J., Demeester, J., De Smedt, S. C., Sanders, N. N., Braeckmans, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+inhibitors+to+study+endocytic+pathways+of+gene+carriers%3A+optimization+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls.</a> Mol. Ther. 18, 561-569 (2010).</li>
<li>Di Marzio, L., Marianecci, C., Cinque, B., Nazzarri, M., Cimini, A. M., Cristiano, L., Cifone, M. G., Alhaique, F., Carafa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH-sensitive+non-phospholipid+vesicle+and+macrophage-like+cells%3A+binding%2C+uptake+and+endocytotic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">pH-sensitive non-phospholipid vesicle and macrophage-like cells: binding, uptake and endocytotic pathway.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1778, 2749-2756 (2008).</li>
<li>Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+novel+polyanhydrides+with+tailored+erosion+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).</li>
</ol>

Sherree amigo L. se emplea por Amnis Corporation, que fabrica el sistema X IMAGESTREAM.

Los estudios han demostrado que las nanopartículas biodegradables a base de poli (láctico-co-ácido glicólico (PLGA) o polianhídridos pueden ser utilizados para entregar antígenos encapsulados o fármacos a células diana. Captación de estas nanopartículas por las células fagocíticas es importante para su eficacia, haciendo así cuantitativo . análisis de la internalización crítico en el diseño de nuevos sistemas de entrega de nanopartículas Mediante este método, la absorción diferencial de nanopartículas de diversos tipos ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> RAW 264.7 línea celular </td><td> American Type Culture Collection (ATCC) </td><td> TIB-71 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco Eagle modificado (DMEM) </td><td> Cellgro </td><td> 10 a 013 CV </td><td></td></tr><tr><td> Suero bovino fetal </td><td> Atlanta Productos Biológicos </td><td> S 11150 </td><td> Prima de Grado </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Gibco </td><td> 35050-061 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Gibco </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> 24-pocillos</td><td> TPP </td><td> 92024 </td><td></td></tr><tr><td> Frascos de cultivo celular </td><td> TPP </td><td> 90151 </td><td></td></tr><tr><td> Rascador de la célula </td><td> TPP </td><td> 99002 </td><td> 24 cm </td></tr><tr><td> Salmonella enterica serovar Typhimurium </td><td> ATCC </td><td> 14028 </td><td></td></tr><tr><td> BTX ECM630 Manipulador célula electroquímica </td><td> BTX Harvard Apparatus </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MOPS </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP308 </td><td></td></tr><tr><td> Tampón fosfato salino (PBS) </td><td> Cellgro </td><td> 21 a 040 CV </td><td></td></tr><tr><td> Procesador de líquidos por ultrasonidos </td><td> Misonix </td><td> S-4000 </td><td></td></tr><tr><td> Citocalasina-D </td><td> Sigma-Aldrich, </td><td> C8273 </td><td></td></tr><tr><td> Formaldehído </td><td> Polysciences </td><td> 04018 </td><td></td></tr><tr><td> El tampón de lavado </td><td> 2% de FBS inactivado por calor, 0,1% de azida sódica en PBS. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Perm / tampón de lavado </td><td> BD Biosciences </td><td> 554714 </td><td></td></tr><tr><td> Clear-ver microtubos Cap Snap </td><td> Sigma </td><td> T4816 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 660 phalloidin </td><td> Invitrogen </td><td> A22285 </td><td></td></tr><tr><td> IMAGESTREAM X </td><td> Amnis Corporación </td><td> 100200 </td><td> Opciones: 658nm láser, inyector automático </td></tr><tr><td> Azida de sodio </td><td> Fisher Scientific </td><td> S 227i-500 </td><td></td></tr></tbody></table>

el análisis de la internalización celular de nanopartículas y bacterias en un multi-espectral de citometría de flujo de imágenes

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Sistemas de nanopartículas se han convertido en herramientas valiosas en la entrega de vacunas a través de su capacidad de entregar de manera eficiente la carga, incluyendo las proteínas, las células presentadoras de antígeno 1-5. La internalización de las nanopartículas (NP) por las células presentadoras de antígenos es un paso crítico en la generación de una respuesta inmune efectiva contra el antígeno encapsulado. Para determinar cómo los cambios en la función del impacto de las nanopartículas formulación, hemos tratado de desarrollar un alto rendimiento, cuantitativa protocolo experimental que fuera compatible con la detección de nanopartículas internalizados, así como las bacterias. Hasta la fecha, dos técnicas independientes, microscopía y citometría de flujo, han sido los métodos utilizados para estudiar la fagocitosis de las nanopartículas. La naturaleza de alto rendimiento de la citometría de flujo genera datos estadísticos robustos. Sin embargo, debido a baja resolución, se produce un error de cuantificar con precisión internalizado versus celulares nanopartículas consolidados. Microscopía genera imágenes con alta resolución espacial, hin embargo, es mucho tiempo e involucra a pequeños tamaños de muestra 6-8. Multi-espectral de la citometría de flujo de imágenes (MIFC) es una nueva tecnología que incorpora aspectos tanto de la microscopía y citometría de flujo que realiza multicolor de imágenes espectrales de fluorescencia de campo y brillante al mismo tiempo a través de un núcleo laminar. Esta capacidad proporciona un análisis preciso de la intensidad de la señal fluorescente y las relaciones espaciales entre las diferentes estructuras y funciones celulares a alta velocidad. En este documento, se describe un método que utiliza MIFC para caracterizar las poblaciones celulares que han internalizado las nanopartículas polianhídrido o Salmonella enterica serovar Typhimurium. También describe la preparación de suspensiones de nanopartículas, el etiquetado de células, la adquisición de un sistema de IMAGESTREAM X y análisis de los datos mediante la aplicación de IDEAS. También demuestran la aplicación de una técnica que puede utilizarse para diferenciar la internalización pathways de las nanopartículas y las bacterias mediante el uso de citocalasina-D como un inhibidor de la fagocitosis mediada por actina.

En este artículo se describe un método que utiliza multi-espectral citometría de flujo de imágenes para cuantificar la internalización de nanopartículas polianhídrido o bacterias de las células RAW 264.7.

El análisis de la internalización celular de nanopartículas y bacterias en un Multi-espectral de Citometría de Flujo de imágenes

Los sistemas nanoparticulados han surgido como herramientas valiosas en la administración de vacunas gracias a su capacidad para transportar eficazmente carga, incluidas proteínas, a...

Para analizar los mecanismos celulares de internalización de nanopartículas y bacterias mediante citometría de flujo con imágenes multiespectrales. Primero, los macrófagos se tratan previamente con citocalasina D para inhibir la polimerización de actina. Se añaden nanopartículas o Salmonella al macrófago en monocapa y se incuba. Luego se cosechan los macrófagos, se fijan y se marcan para su análisis mediante un sistema de imágenes en flujo. Las células analizadas por citometría de flujo de imágenes multiespectrales que han internalizado nanopartículas y/o salmonela se distinguen de aquellas con nanopartículas y/o salmonela unidas a la superficie. Los datos resultantes indican que tanto la salmonela como las nanopartículas son internalizadas únicamente por células que no han sido tratadas con citocalasina.D lo que sugiere que la internalización depende de la actina. Esta técnica tiene varias ventajas sobre los métodos existentes, como la citometría de flujo y la microscopía confocal. Principalmente, proporciona una medida precisa de las intensidades de la señal fluorescente y de la resolución espacial entre diferentes características celulares a alta velocidad.Este método puede ayud

analyzing-cellular-internalization-nanoparticles-bacteria-multi

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Fuente: Zhang, Y., et al. Aplicación de nanopartículas fluorescentes para estudiar la remodelación del sistema endolisosomal por bacterias intracelulares. J. Vis. Exp. (2015)Este video demuestra el uso de nanopartículas fluorescentes para visualizar la remodelación endo-lisosomal en células epiteliales humanas infectadas por bacterias intracelulares. Después de la invasión bacteriana, los patógenos manipulan el citoesqueleto del huésped y el sistema endolisosomal, formando vacuolas con...

Visualización mediada por nanopartículas de la remodelación endolisosomal en células infectadas por bacterias

Nosotros revisamos nuestros resultados recientes sobre la integración de la microscopía fluorescente y herramientas de imágenes de citometría de flujo en un teléfono celular usando compactas y económicas-opto-fluídicos archivos adjuntos. Estos teléfono móvil basado micro-análisis de dispositivos podría ser útil para el análisis de citometría, tal como realizar diversas tareas de recuento de células, así como para el cribado de alto rendimiento de muestras de agua, por ejemplo, en entornos con...

Wide-field microscopía de fluorescencia y citometría de flujo fluorescente de imágenes en un teléfono móvil

En este estudio, el objetivo principal fue monitorear la absorción celular y la eventual exocitosis de los nanotubos de carbono (CNTs). Desde esta perspectiva, propusimos aquí un método único que utiliza la citometría de flujo de imágenes multiespectrales que permite la cuantificación y localización de CNTs en un número estadísticamente relevante de células.

Localización y cuantificación relativa de nanotubos de carbono en las células con multiespectral de imágenes de Citometría de Flujo

Análisis de la interacción de nanopartículas con subpoblaciones definidas de células inmunes por citometría de flujo.

La detección de nanopartículas fluorescentes Interacciones con inmunodeficiencia primaria subpoblaciones celulares por citometría de flujo

Este artículo describe métodos para la síntesis y marcaje fluorescente de nanopartículas (NPs). Los NPs se aplicaron en los experimentos de pulso-caza para etiquetar el sistema de endo-lisosomal de las células eucariotas. La manipulación del sistema de endo-lisosomal por las actividades del patógeno intracelular Salmonella enterica fueron seguidos por imágenes de células vivas y cuantificada.

Aplicación de nanopartículas fluorescentes para estudiar Remodelación del Sistema Endo-lisosomal por bacterias intracelulares

Este método demuestra una técnica para evaluar la función de los granulocitos midiendo simultáneamente la fagocitosis de las bacterias y el estallido oxidativo. La citometría de flujo basada en imágenes permitió la identificación de tres subconjuntos distintos de granulocitos activados que diferían en su capacidad funcional relativa.

Imagen basada en Citometría de Flujo Técnica para evaluar los cambios en función de los granulocitos In Vitro

Análisis cytometric del flujo ha demostrado ser valioso para investigar cultivos puros y monitoreo de la dinámica de la comunidad microbiana. Presentamos tres flujos de trabajo integrales, de muestreo para análisis de datos, para cultivos puros y comunidades complejas en medio claro, así como en matrices difíciles, respectivamente.

Caracterización dinámica de microbioma-citometría de flujo basado en flujos de trabajo de cultivos puros de las comunidades naturales

El ensayo de micronúcleos in vitro es un método bien establecido para evaluar la genotoxicidad y la citotoxicidad, pero la puntuación del ensayo mediante microscopía manual es laboriosa y sufre de subjetividad y variabilidad entre marcadores. Este documento describe el protocolo desarrollado para realizar una versión totalmente automatizada del ensayo utilizando citometría de flujo de imágenes multiespectral.

Un método automatizado para realizar el ensayo de micronúcleos In Vitro mediante citometría de flujo de imágenes multiespectral

Este artículo presenta la integración de un módulo de enfoque espectral y un láser de pulso de doble salida, lo que permite obtener imágenes hiperespectrales rápidas de nanopartículas de oro y células cancerosas. Este trabajo tiene como objetivo demostrar los detalles de las técnicas ópticas no lineales multimodales en un microscopio de escaneo láser estándar.

Imágenes biomoleculares de la captación celular de nanopartículas mediante microscopía óptica multimodal no lineal

Este protocolo describe un enfoque cuantitativo para medir la autoagregación microbiana mediante citometría de flujo por imágenes.

Citometría de flujo por imágenes para estudiar la autoagregación microbiana

Este estudio dilucida el procesamiento fagocítico de las partículas de Godanti Bhasma (GB) en células de mamíferos, caracterizando su absorción celular, dinámica de vacuolas, acidificación y degradación. Estos hallazgos no solo avanzan en nuestra comprensión de los mecanismos fundamentales de la fagocitosis, sino que también establecen a la GB como un sistema modelo prometedor para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas.

Explorando los eventos celulares secuenciales de fagocitosis desencadenados por Godanti Bhasma en células de mamíferos

Aprende a analizar la internalización celular de nanopartículas y bacterias mediante citometría de flujo de imágenes multiespectral en células RAW 264.7. Este método permite distinguir partículas internalizadas de las unidas a la superficie.

El análisis de la internalización celular de nanopartículas y bacterias en un Multi-espectral de Citometría de Flujo de imágenes (Video) | JoVE Journal

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