El análisis de la internalización celular de nanopartículas y bacterias en un Multi-espectral de Citometría de Flujo de imágenes

Analizar los mecanismos celulares de internalización de nanopartículas y bacterias mediante citometría de flujo de imagen multiespectral. Los macrófagos se tratan previamente con citoklain D para inhibir la polimerización de actina. Al macrófago se le añaden nanopartículas o salmonela, se les hace una monocapa y se incuban.

A continuación, los macrófagos se recogen, se fijan y se etiquetan para su análisis mediante un flujo de imágenes. Las células de citómetro de flujo de imágenes multiespectrales que tienen nanopartículas internalizadas o salmonela se distinguen de aquellas con nanopartículas unidas a la superficie o salmonela. Los datos resultantes indican que tanto la salmonela como las nanopartículas son internalizadas solo por células que no han sido tratadas con cyto klain.

D sugiriendo que la internalización es dependiente de la actina. Esta técnica tiene varias ventajas sobre los métodos existentes, como la citometría de flujo y la microscopía confocal. Principalmente, proporciona una medida precisa de las intensidades de la señal fluorescente y la resolución espacial entre diferentes características celulares a alta velocidad.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave tanto para la investigación de biomateriales, vacunas como para la administración de fármacos, así como para una gran cantidad de estudios de interacción de patógenos. Esto incluye la delineación de las vías de internalización utilizadas por las nanopartículas de polianhídrido y las bacterias. Generalmente, las personas nuevas en este método a menudo tienen dificultades.

Es importante dedicar tiempo a valorar los tintes para obtener señales de fluorescencia óptimas. Además, conocer el software y crear plantillas de análisis lleva tiempo. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando descubrimos que las nanopartículas polihidrométricas exhiben características que imitan a los patógenos mientras emplean microscopía y otras técnicas.

A continuación, queríamos un sistema de alto rendimiento para comparar los procesos de internalización utilizados por la salmonela y las nanopartículas de hidruro de polen antes de realizar el ensayo. Se deben recolectar todos los cultivos de células de mamíferos y bacterias y se deben preparar suspensiones de nanopartículas. Comience recolectando células confluentes RA W2 64.7 usando un raspador de células.

Determine el número de células con un hemocitómetro. A continuación, coloque las células en una placa de cultivo de 24 pocillos a una densidad de cinco veces 10 a la quinta célula por pocillo en 0,5 mililitros. Incubación completa DMEM durante la noche a 37 grados centígrados y una incubadora de 5%CO2.

Para preparar la salmonella tarica se diluyó la salmonela en C-D-M-E-M para obtener una multiplicidad de infección de cien por RA W2 64.7 células en un tubo de cultivo de vidrio con tapón de rosca de autoclave de 16 por 125 milímetros. A continuación, utilizando papel de suero esterilizado, pesa cinco miligramos de nanopartículas de polianhídrido cargadas con 1% FITC generadas según lo descrito por sus colegas en su publicación de 2009 y en su investigación farmacéutica en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Agregue las nanopartículas a 0,5 mililitros de solución salina tamponada con fosfato frío y colóquela sobre hielo.

Mantener el tubo en hielo. Utilice un procesador de líquido ultrasónico con una micropunta para sonicar la suspensión durante aproximadamente 25 segundos a cuatro o seis julios. Ahora que todas las células y reactivos necesarios están listos, se puede realizar el ensayo de fagocitosis.

Etiquete 24 placas de cultivo de tejidos de pocillos que contienen células RA W2 64.7 cultivadas en preparación para el ensayo en la primera placa. Cada una de las siguientes muestras se analizará por triplicado, citocitos y D con nanopartículas, citos y D con salmonela, medio con nanopartículas, medio con solo nanopartículas de salmonela, solo salmonela y AF seis células de tinción de 60 solo cuatro grados Celsius controles se analizarán en la segunda placa e incluirán medio más nanopartículas y medio más incubación de salmonela a esta baja temperatura, Procesos celulares lentos como la fagocitosis una hora antes de la inducción. Agregue cinco microgramos por mililitros de citocito, y D y C-D-M-E-M a los pocillos apropiados e incube las células a 37 grados centígrados.

Después de la incubación, agite la suspensión de nanopartículas y agregue 10 microlitros a los pocillos apropiados. A continuación, vórtice la salmonela y añádala a los pocillos apropiados con un MOI de 100. Golpea el plato unas cuantas veces para mezclar.

A continuación, coloque las placas de muestra a 37 grados centígrados y las placas de control negativo a cuatro grados centígrados durante 45 minutos. Después de la incubación, coloque las placas en hielo, lave las células dos veces con PBS helado sin calcio y magnesio aspirando y desechando el medio viejo para eliminar las partículas no unidas, la salmonela y las células muertas o desprendidas. Uso de pétalos de magnesio.

El pre PBS en esta etapa es esencial porque facilita el desprendimiento de las células del sustrato Para cosechar las células, agregue 250 microlitros de PBS helado y raspe suavemente los pocillos, pipetee las células recolectadas en tubos de microcentrífuga con tapa a presión siliconadas y manténgalos en hielo. Lave las celdas agregando un mililitro de tampón de lavado en frío, luego centrifugue a 250 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Después de desechar el sobrenadante, elimine el tampón residual golpeando el tubo de microcentrífuga invertido sobre el papel.

Vuelva a suspender el pellet de la célula con una toalla rastrillando suavemente el tubo de microcentrífuga a través de una rejilla de tubos de ensayo. Para fijar las células, agregue 100 microlitros de formaldehído al 4% en PBS y deje reposar las celdas durante 15 minutos. A temperatura ambiente, lave las celdas agregando un mililitro de tampón de lavado permanente, luego centrifugue a 250 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.

Después de desechar el sobrenadante, retire el tampón residual como antes. A continuación, para teñir el RA W2 64.7 celdas. Para la actina, agregue 100 microlitros de tampón de lavado permanente que contenga Alexa Fluora foid en seis 60 durante 15 minutos.

A temperatura ambiente, las muestras no teñidas deben incubarse con permanente, tampón de lavado sin phin. Después de teñir, lavar y centrifugar las células nuevamente, luego volver a suspenderlas en 50 microlitros de PBS que contienen 1% de PFA y almacenarlas en la oscuridad a cuatro grados centígrados hasta su adquisición. Encendido, transmisión de imágenes y lanzamiento.

Inspire e inicialice los fluidos en el menú de archivos. Elija cargar plantilla predeterminada. En la galería de imágenes, menú de visualización, seleccione todo y presione ejecutar configuración para comenzar a obtener imágenes de las cuentas si es necesario, ajuste el seguimiento del núcleo para centrar las imágenes lateralmente.

Seleccione el canal de campo claro y haga clic en establecer intensidad. Espere hasta que el coeficiente de variación de la velocidad del flujo sea consistentemente inferior al 0.2%En la pestaña de asistencia, haga clic en iniciar todo para ejecutar calibraciones y pruebas y verificar que todas hayan pasado en el software. Haga clic en cargar muestra.

Luego, cuando se le indique que lo haga, coloque el vial que contiene la muestra más brillante. Con todos los fluorocromos en el cargador de muestras, seleccione un aumento de 40x. Una vez establecidos los ajustes del instrumento, no los cambie durante todo el experimento.

Encienda cada láser en el experimento haciendo clic en los iconos de láser en el software y configure la potencia del láser para que cada fluorocromo tenga valores máximos de píxeles entre 104.000 recuentos medidos en los diagramas de dispersión. Para eliminar la colección de objetos no deseados, haga clic en la ventana del clasificador de celdas en el software. Luego, para recopilar solo datos de celda, seleccione el canal de límite inferior de área uno para campo claro y establezca el valor en 50 micrómetros, los objetos con un área inferior a 50 micrómetros se considerarán escombros y no se adquirirán.

Seleccione los canales que se recopilarán haciendo clic en los iconos de canal correspondientes en el software aquí. Los canales 1, 2, 3, 4, 5 y seis se seleccionan en la pestaña de configuración. Introduzca el número de archivo y la carpeta de destino.

Establezca el número de secuencia en uno y el número de eventos que se van a adquirir en 5.000. Haga clic en ejecutar, adquirir para recopilar y guardar el primer archivo de datos del experimento. Haga clic en FLL y ejecute la siguiente muestra experimental.

Repita hasta que se hayan recogido todas las muestras experimentales. A continuación, para ejecutar los controles, haga clic en configuración de composición. Esto apagará el láser de campo brillante y dispersión y permitirá la recopilación de todos los canales de fluorescencia en la pestaña de adquisición.

Cambie el valor de entrada a 500. Luego coloque el tubo de control y haga clic en ejecutar. Adquirir para recolectar 500 células positivas en controles de una sola tinción.

Repita para cada fluorocromo en el experimento para desarrollar una matriz de compensación. Una vez que se hayan adquirido todas las imágenes de muestra, inicie el software de análisis de ideas en una computadora de análisis separada haciendo doble clic en el icono de ideas en el escritorio. Haga doble clic en el asistente de internalización y cargue uno de los archivos RIF de muestra de prueba.

Una ventana emergente proporcionará instrucciones para cargar los archivos de prueba. Siga las instrucciones y haga clic en el botón siguiente. A continuación, haga clic en nueva matriz.

Esto iniciará el asistente de compensación. Cuando se le solicite, seleccione los archivos de datos para los controles de color individuales para agregarlos. Haga clic en Siguiente en el asistente, siguiendo las instrucciones hasta que el archivo de matriz de compensación se guarde y se cargue en el cuadro del paso dos del asistente de internalización.

Haga clic en siguiente y siga las instrucciones hasta que se genere un archivo DAF. Establezca las propiedades de visualización de la imagen seleccionando los canales de imagen utilizados durante la adquisición. Haga clic en el canal dos para FITC y en el canal cinco para AF six 60.

El campo claro y la dispersión lateral están seleccionados de forma predeterminada. Seleccione el canal de campo claro O uno para hacer el límite de la celda y el canal O2 en el que se recolectaron nanopartículas o bacterias para la sonda de internalización para definir la población de células individuales, se genera un diagrama de dispersión del área de campo claro frente a la relación de aspecto de campo claro de todas las celdas. El análisis de alto rendimiento de varios archivos de datos requiere un archivo de plantilla, por lo que es de vital importancia definir cuidadosamente las puertas al crear un archivo de plantilla.

Cada punto representa los valores de una imagen de celda individual. Haga clic en una sola. en un gráfico para seleccionar la imagen de esa celda en particular en la galería de imágenes.

A continuación, dibuje una puerta alrededor de las celdas con el área y la relación de aspecto que correspondan a los eventos de una sola celda. Las celdas individuales tienen una relación de aspecto de ronda uno y dobletes. Tienen una relación de aspecto de alrededor de 0,5.

Haga clic en varias celdas para diferenciar entre la región que contiene celdas individuales y las que contienen dobletes o desechos. Para generar un histograma del gradiente de campo claro, la raíz cuadrada de la imagen de campo claro es el cuadrado. Haga clic en el botón siguiente.

A continuación, en la pestaña de población, seleccione la opción de ubicación para mostrar la ubicación seleccionada. Haga clic en los contenedores para determinar dónde se enfocan mejor las celdas. Comience y dibuje una región de línea para las células enfocadas en la marcha.

Cuanto mayor sea el gradiente RMS, mejor enfocado, omita el siguiente paso a menos que haya otras manchas para bloquear. Se genera un nuevo diagrama de dispersión de la intensidad del canal dos en el eje x frente al píxel máximo del canal dos en el eje Y. Haga clic en los puntos y vea las imágenes para ayudar a determinar la región que se debe dibujar alrededor de las células que son positivas para nanopartículas o bacterias.

Se genera un histograma de la característica de internalización con una región que comienza en cero, que debe ajustarse mediante la observación de imágenes. La característica de internalización es una relación entre la intensidad dentro de la célula y la intensidad de toda la célula. Se escala de tal manera que a un valor de cero, la mitad de la intensidad está dentro.

El asistente ha creado una región de cada celda que designa el interior haciendo una máscara que se utiliza, la imagen de la celda de entrada para encontrar la superficie de la celda y erosionada esta en cuatro píxeles. Tenga en cuenta que esta máscara se puede ajustar manualmente para diferentes tipos de celda cuando sea necesario creando primero una máscara de objeto en la imagen de campo claro y erosionándola en más o menos píxeles. La característica de internalización se calcula en función de esta máscara de objeto erosionado utilizando un algoritmo en el software.

Esta característica nos permite distinguir las partículas y bacterias internalizadas que tienen la mayoría de su señal fluorescente dentro del límite de la máscara de las partículas y bacterias unidas a la superficie, que tienen la mayor parte de su señal fluorescente fuera del límite de la máscara como se muestra en este ejemplo, crear un nuevo histograma con una nueva característica de internalización basada en la máscara de objeto erosionado. Dibuje una región para la puerta en las celdas internalizadas visualizando las imágenes en el modo de bandeja seleccionado. Coloque la puerta en 0.3.Aquí.

Las celdas con una puntuación inferior a 0,3 se consideran células positivas de partículas unidas a la superficie. Para eliminar las células con etiquetado de fondo e identificar nanopartículas o bacterias internalizadas específicas, elija características en el menú de análisis. Haga clic en el menú de análisis.

A continuación, haga clic en la función de recuento de puntos junto a para añadir el recuento medio de puntos al informe de estadísticas. En el menú de informes, haga clic en el icono de informes. A continuación, defina el informe de estadísticas, agregue columnas y, a continuación, seleccione la población de celdas adecuada.

Haga clic en Aceptar. El asistente de internalización agregará automáticamente estadísticas a este informe para guardar el archivo de datos como archivo de plantilla que se utilizará para el análisis por lotes de todos los archivos experimentales. Haga clic en el menú de archivos y seleccione guardar como plantilla.

Archivos de plantilla. Tenga la extensión punto AST para analizar múltiples archivos de datos en el software de idea. Haga clic en herramientas y seleccione archivos de datos por lotes e ingrese todos los archivos RIF.

Agregue el archivo de matriz de compensación y el archivo de plantilla en las secciones correspondientes para enviar el lote para su procesamiento, haga clic en enviar. Después del paso de procesamiento, se analizan todos los archivos RAF y se generan archivos DAF para cada uno de los archivos RAW individuales. Se genera un informe final con estadísticas de todas las muestras para comparar el efecto de la inhibición de actina y la baja temperatura sobre la fagocitosis de salmonela y nanopartículas.

Las células RA W2 64.7 se incubaron a 37 grados centígrados en medio, ya sea con o sin citoklain D o se incubaron en medio a cuatro grados centígrados. Tanto la temperatura como las manipulaciones de actina redujeron la internalización tanto de las nanopartículas como de la salmonela. Sin embargo, la incubación de las células en citos y D aumenta el porcentaje de células con nanopartículas unidas a la superficie mientras disminuye el porcentaje de células con salmonela unida a la superficie.

El porcentaje de células positivas para nanopartículas unidas a la superficie aumenta de aproximadamente el 8% a 37 grados Celsius a más del 35% después del tratamiento con citocitos y D o cuatro grados Celsius. Por el contrario, el porcentaje de células con salmonela unida a la superficie se redujo del 35% al 15%Después del tratamiento con citocitos y D, la incubación de las células RA W2 64,7 con salmonela a cuatro grados centígrados, disminuyó la internalización sin un aumento aparente en la cantidad de bacterias unidas a la superficie en comparación con el control de 37 grados centígrados. En conjunto, estos datos demuestran que la salmonela y las nanopartículas se internalizan mediante un proceso celular similar que requiere actina y depende de la temperatura.

Además, los datos indican que la unión sostenida de la salmonela a los macrófagos requiere la polimerización de la actina. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo exa la internalización celular de nanopartículas y bacterias mediante citometría de flujo de imágenes multiespectrales. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que los inhibidores son citotóxicos.

Por lo tanto, son necesarios experimentos previos de perfil de citotoxicidad para determinar las concentraciones óptimas a utilizar. No olvide que trabajar con salmonella puede ser peligroso, se deben observar precauciones como usar el equipo de protección personal adecuado y evitar la creación de aerosoles al realizar este procedimiento.