Name: El análisis de la internalización celular de nanopartículas y bacterias en un Multi-espectral de Citometría de Flujo de imágenes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 7 s
Description: Aprende a analizar la internalización celular de nanopartículas y bacterias mediante citometría de flujo de imágenes multiespectral en células RAW 264.7. Este método permite distinguir partículas internalizadas de las unidas a la superficie.

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Los autores desean agradecer el Premio ONR-Muri (NN00014-06-1-1176) y el Ejército de los EE.UU. de Investigación Médica y Material de comandos (números de concesión W81XWH-09-1-0386 y W81XWH-10-1-0806) de financiera apoyar.

<ol><li>Ulery, B. D., Kumar, D., Ramer-Tait, A. E., Metzger, D. W., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+protective+single-dose+intranasal+nanoparticle-based+vaccine+platform+for+respiratory+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Design of a protective single-dose intranasal nanoparticle-based vaccine platform for respiratory infectious diseases.</a> PLoS One. 6, e17642(2011).</li>
<li>Kasturi, S. P., Skountzou, I., Albrecht, R. A., Koutsonanos, D., Hua, T., Nakaya, H. I., Ravindran, R., Stewart, S., Alam, M., Kwissa, M., Villinger, F., Murthy, N., Steel, J., Jacob, J., Hogan, R. J., García-Sastre, A., Compans, R., Pulendran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+the+magnitude+and+persistence+of+antibody+responses+with+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Programming the magnitude and persistence of antibody responses with innate immunity.</a> Nature. 470, 543-547 (2011).</li>
<li>Rice-Ficht, A. C., Arenas-Gamboa, A. M., Kahl-McDonagh, M. M., Ficht, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+particles+in+vaccine+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Polymeric particles in vaccine delivery.</a> Curr. Opin. Microbiol. 13, 106-112 (2010).</li>
<li>Jain, J. P., Chitkara, D., Kumar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyanhydrides+as+localized+drug+delivery+carrier%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Opin.+Drug.+Deliv%22%5BJournal%5D)">Polyanhydrides as localized drug delivery carrier: an update.</a> Expert. Opin. Drug. Deliv. 5, 889-907 (2008).</li>
<li>Pfeifer, B. A., Burdick, J. A., Little, S. R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ester-anhydride%29%3Apoly%28beta-amino+ester%29+micro-+and+nanospheres%3A+DNA+encapsulation+and+cellular+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Poly(ester-anhydride):poly(beta-amino ester) micro- and nanospheres: DNA encapsulation and cellular transfection.</a> Int. J. Pharm. 304, 210-219 (2005).</li>
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<li>Rieger, A. M., Hall, B. E., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+differentially+modulates+particle+binding%2C+phagocytosis+and+downstream+antimicrobial+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Comp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation differentially modulates particle binding, phagocytosis and downstream antimicrobial mechanisms.</a> Dev. Comp. Immunol. 34, 1144-1159 (2010).</li>
<li>Murphy, K. C., Campellone, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lambda+Red-mediated+recombinogenic+engineering+of+enterohemorrhagic+and+enteropathogenic+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Lambda Red-mediated recombinogenic engineering of enterohemorrhagic and enteropathogenic E. coli.</a> BMC. Mol. Biol. 4, 11(2003).</li>
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<li>Ulery, B. D., Phanse, Y., Sinha, A., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B., Bellaire, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+chemistry+influences+monocytic+uptake+of+polyanhydride+nanospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres.</a> Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).</li>
<li>Doherty, G. J., McMahon, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of endocytosis.</a> Annu. Rev. Biochem. 78, 857-902 (2009).</li>
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<li>Di Marzio, L., Marianecci, C., Cinque, B., Nazzarri, M., Cimini, A. M., Cristiano, L., Cifone, M. G., Alhaique, F., Carafa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH-sensitive+non-phospholipid+vesicle+and+macrophage-like+cells%3A+binding%2C+uptake+and+endocytotic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">pH-sensitive non-phospholipid vesicle and macrophage-like cells: binding, uptake and endocytotic pathway.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1778, 2749-2756 (2008).</li>
<li>Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+novel+polyanhydrides+with+tailored+erosion+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).</li>
</ol>

Sherree amigo L. se emplea por Amnis Corporation, que fabrica el sistema X IMAGESTREAM.

Los estudios han demostrado que las nanopartículas biodegradables a base de poli (láctico-co-ácido glicólico (PLGA) o polianhídridos pueden ser utilizados para entregar antígenos encapsulados o fármacos a células diana. Captación de estas nanopartículas por las células fagocíticas es importante para su eficacia, haciendo así cuantitativo . análisis de la internalización crítico en el diseño de nuevos sistemas de entrega de nanopartículas Mediante este método, la absorción diferencial de nanopartículas de diversos tipos ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> RAW 264.7 línea celular </td><td> American Type Culture Collection (ATCC) </td><td> TIB-71 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco Eagle modificado (DMEM) </td><td> Cellgro </td><td> 10 a 013 CV </td><td></td></tr><tr><td> Suero bovino fetal </td><td> Atlanta Productos Biológicos </td><td> S 11150 </td><td> Prima de Grado </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Gibco </td><td> 35050-061 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Gibco </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> 24-pocillos</td><td> TPP </td><td> 92024 </td><td></td></tr><tr><td> Frascos de cultivo celular </td><td> TPP </td><td> 90151 </td><td></td></tr><tr><td> Rascador de la célula </td><td> TPP </td><td> 99002 </td><td> 24 cm </td></tr><tr><td> Salmonella enterica serovar Typhimurium </td><td> ATCC </td><td> 14028 </td><td></td></tr><tr><td> BTX ECM630 Manipulador célula electroquímica </td><td> BTX Harvard Apparatus </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MOPS </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP308 </td><td></td></tr><tr><td> Tampón fosfato salino (PBS) </td><td> Cellgro </td><td> 21 a 040 CV </td><td></td></tr><tr><td> Procesador de líquidos por ultrasonidos </td><td> Misonix </td><td> S-4000 </td><td></td></tr><tr><td> Citocalasina-D </td><td> Sigma-Aldrich, </td><td> C8273 </td><td></td></tr><tr><td> Formaldehído </td><td> Polysciences </td><td> 04018 </td><td></td></tr><tr><td> El tampón de lavado </td><td> 2% de FBS inactivado por calor, 0,1% de azida sódica en PBS. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Perm / tampón de lavado </td><td> BD Biosciences </td><td> 554714 </td><td></td></tr><tr><td> Clear-ver microtubos Cap Snap </td><td> Sigma </td><td> T4816 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 660 phalloidin </td><td> Invitrogen </td><td> A22285 </td><td></td></tr><tr><td> IMAGESTREAM X </td><td> Amnis Corporación </td><td> 100200 </td><td> Opciones: 658nm láser, inyector automático </td></tr><tr><td> Azida de sodio </td><td> Fisher Scientific </td><td> S 227i-500 </td><td></td></tr></tbody></table>

el análisis de la internalización celular de nanopartículas y bacterias en un multi-espectral de citometría de flujo de imágenes

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Sistemas de nanopartículas se han convertido en herramientas valiosas en la entrega de vacunas a través de su capacidad de entregar de manera eficiente la carga, incluyendo las proteínas, las células presentadoras de antígeno 1-5. La internalización de las nanopartículas (NP) por las células presentadoras de antígenos es un paso crítico en la generación de una respuesta inmune efectiva contra el antígeno encapsulado. Para determinar cómo los cambios en la función del impacto de las nanopartículas formulación, hemos tratado de desarrollar un alto rendimiento, cuantitativa protocolo experimental que fuera compatible con la detección de nanopartículas internalizados, así como las bacterias. Hasta la fecha, dos técnicas independientes, microscopía y citometría de flujo, han sido los métodos utilizados para estudiar la fagocitosis de las nanopartículas. La naturaleza de alto rendimiento de la citometría de flujo genera datos estadísticos robustos. Sin embargo, debido a baja resolución, se produce un error de cuantificar con precisión internalizado versus celulares nanopartículas consolidados. Microscopía genera imágenes con alta resolución espacial, hin embargo, es mucho tiempo e involucra a pequeños tamaños de muestra 6-8. Multi-espectral de la citometría de flujo de imágenes (MIFC) es una nueva tecnología que incorpora aspectos tanto de la microscopía y citometría de flujo que realiza multicolor de imágenes espectrales de fluorescencia de campo y brillante al mismo tiempo a través de un núcleo laminar. Esta capacidad proporciona un análisis preciso de la intensidad de la señal fluorescente y las relaciones espaciales entre las diferentes estructuras y funciones celulares a alta velocidad. En este documento, se describe un método que utiliza MIFC para caracterizar las poblaciones celulares que han internalizado las nanopartículas polianhídrido o Salmonella enterica serovar Typhimurium. También describe la preparación de suspensiones de nanopartículas, el etiquetado de células, la adquisición de un sistema de IMAGESTREAM X y análisis de los datos mediante la aplicación de IDEAS. También demuestran la aplicación de una técnica que puede utilizarse para diferenciar la internalización pathways de las nanopartículas y las bacterias mediante el uso de citocalasina-D como un inhibidor de la fagocitosis mediada por actina.

En este artículo se describe un método que utiliza multi-espectral citometría de flujo de imágenes para cuantificar la internalización de nanopartículas polianhídrido o bacterias de las células RAW 264.7.

El análisis de la internalización celular de nanopartículas y bacterias en un Multi-espectral de Citometría de Flujo de imágenes

Los sistemas nanoparticulados han surgido como herramientas valiosas en la administración de vacunas gracias a su capacidad para transportar eficazmente carga, incluidas proteínas, a...

Para analizar los mecanismos celulares de internalización de nanopartículas y bacterias mediante citometría de flujo con imágenes multiespectrales. Primero, los macrófagos se tratan previamente con citocalasina D para inhibir la polimerización de actina. Se añaden nanopartículas o Salmonella al macrófago en monocapa y se incuba. Luego se cosechan los macrófagos, se fijan y se marcan para su análisis mediante un sistema de imágenes en flujo. Las células analizadas por citometría de flujo de imágenes multiespectrales que han internalizado nanopartículas y/o salmonela se distinguen de aquellas con nanopartículas y/o salmonela unidas a la superficie. Los datos resultantes indican que tanto la salmonela como las nanopartículas son internalizadas únicamente por células que no han sido tratadas con citocalasina.D lo que sugiere que la internalización depende de la actina. Esta técnica tiene varias ventajas sobre los métodos existentes, como la citometría de flujo y la microscopía confocal. Principalmente, proporciona una medida precisa de las intensidades de la señal fluorescente y de la resolución espacial entre diferentes características celulares a alta velocidad.Este método puede ayudar a responder preguntas clave tanto en la investigación de biomateriales para vacunas y entrega de fármacos, como en estudios sobre la interacción huésped-patógeno. Esto incluye delimitar las vías de internalización utilizadas por las nanopartículas de polianhídrido y las bacterias. Por lo general, las personas nuevas en este método suelen tener dificultades.Es importante dedicar tiempo a titular los colorantes para obtener señales de fluorescencia óptimas. Además, familiarizarse con el software y crear plantillas de análisis requiere tiempo. Tuvimos la idea inicial de este método cuando descubrimos que las nanopartículas de polihidro exhiben características que imitan patógenos mientras empleábamos microscopía y otras técnicas.Luego deseábamos un sistema de alto rendimiento para comparar los procesos de internalización utilizados por Salmonella y las nanopartículas de hidruro de polen antes de realizar el ensayo. Todas las culturas celulares bacterianas y de mamífero deben cosecharse y las suspensiones de nanopartículas deben prepararse. Comience por cosechar células RA W2 64.7 confluentes utilizando un raspador celular.Determine el número de células utilizando un hemocitómetro. A continuación, siembre las células en una placa de cultivo de 24 pocillos a una densidad de cinco por 10 a la quinta células por pocillo en 0,5 mililitros. Incube durante la noche en DMEM completo a 37 grados Celsius en un incubador con 5% CO₂.Para preparar la dilución de Salmonella Tarica, transforme Salmonella en C-D-M-E-M para obtener una multiplicidad de infección de cien por células RAW264.7 en un tubo de cultivo de vidrio de 16 por 125 milímetros con tapón de rosca y autoclave. A continuación, utilizando papel de aluminio esterilizado, pese cinco miligramos de nanopartículas de polianhídrido cargadas con FITC al 1%, generadas según lo descrito por Rean y colaboradores en su publicación de 2009 en Pharmaceutical Research, en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros. Añada las nanopartículas a 0,5 mililitros de solución salina tamponada con fosfato fría y coloque en hielo.Mantenga el tubo en hielo. Utilice un procesador ultrasónico de líquidos con una micropunta para sonicar la suspensión durante aproximadamente 25 segundos a cuatro o seis julios. Ahora que todas las células y reactivos necesarios están listos, se puede realizar el ensayo de fagocitosis.Etiquete placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos que contengan células RA W2 64.7 cultivadas, en preparación para el ensayo en la primera placa. Cada una de las siguientes muestras se ensayará por triplicado: citocalasina D con nanopartículas, citocalasina D con salmonela, medio con nanopartículas, medio con nanopartículas de salmonela únicamente, salmonela únicamente, y células teñidas solo con AF646 como controles a cuatro grados Celsius, que se ensayarán en la segunda placa e incluirán medio más nanopartículas y medio más salmonela, incubados a esta baja temperatura para ralentizar procesos celulares como la fagocitosis. Una hora antes de la inducción, agregue cinco microgramos por mililitro de citocalasina D y C-D-M-E-M a los pocillos adecuados e incube las células a 37 grados Celsius.Después de la incubación, vortexe la suspensión de nanopartículas y añada 10 microlitros a los pozos correspondientes. Luego, vortexe la salmonela y añádala a los pozos correspondientes a una MOI de 100. Toque ligeramente la placa varias veces para mezclar.Luego, coloque las placas de muestra a 37 grados Celsius y las placas de control negativo a cuatro grados Celsius durante 45 minutos. Tras la incubación, coloque las placas sobre hielo, lave las células dos veces con PBS frío sin calcio y magnesio mediante aspiración y descarte del medio antiguo para eliminar partículas no unidas, salmonela y células muertas o desprendidas. Uso de magnesio en pétalo.El prelavado con PBS en esta etapa es esencial porque facilita la separación de las células del sustrato. Para recolectar las células, agregue 250 microlitros de PBS frío con hielo y raspe suavemente las pocilas; aspire con pipeta las células recolectadas hacia tubos de microcentrífuga siliconados con tapa de rosca, y manténgalos en hielo. Lave las células añadiendo un mililitro de tampón de lavado frío, luego centrifugue a 250 × g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Después de desechar el sobrenadante, elimine el tampón residual golpeando suavemente el tubo de microcentrífuga invertido sobre papel.Resuspenda el pellet celular moviendo suavemente el tubo de microcentrifugado a través de una gradilla para tubos de ensayo. Para fijar las células, añada 100 microlitros de paraformaldehído al 4 % en PBS y deje reposar las células durante 15 minutos. A temperatura ambiente, lave las células añadiendo un mililitro de tampón de permeabilización y lavado, luego centrifugue a 250 ×g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius.Después de descartar el sobrenadante, elimine el tampón residual como antes. Luego, tiña las células RAW 264.7. Para la actina, agregue 100 microlitros de tampón de permeabilización y lavado que contenga Alexa Fluor foid en seis 60 durante 15 minutos.A temperatura ambiente, las muestras sin teñir deben incubarse con perm, tampón de lavado sin phin. Después de la tinción, lávese y centrífuguese las células nuevamente, luego resuspéndanse en 50 microlitros de PBS que contenga 1 %PFA y almacénsense en la oscuridad a cuatro grados Celsius hasta la adquisición. Encienda, image stream y lance.Seleccione inspirar e inicializar la fluidica en el menú de archivos. Elija cargar plantilla predeterminada. En la galería de imágenes, en el menú ver, seleccione todo y presione ejecutar configuración para comenzar a adquirir imágenes de las perlas; si es necesario, ajuste el seguimiento del núcleo para centrar las imágenes lateralmente.Seleccione el canal de campo claro y haga clic en establecer intensidad. Espere hasta que el coeficiente de variación de la velocidad de flujo sea consistentemente inferior al 0,2 %. En la pestaña de asistencia, haga clic en iniciar todo para ejecutar las calibraciones y pruebas, y verifique que todas se hayan completado satisfactoriamente en el software. Haga clic en cargar muestra.Luego, cuando se indique, coloque el vial que contiene la muestra más brillante. Con todos los fluorocromos en el cargador de muestras, seleccione un aumento de 40 x. Una vez establecidos los parámetros del instrumento, no los cambie durante todo el experimento.Encienda cada láser del experimento haciendo clic en los iconos de láser en el software y ajuste la potencia del láser para que cada fluorocromo tenga valores máximos de píxeles entre 104.000 cuentas, según se mide en los diagramas de dispersión. Para eliminar la recopilación de objetos no deseados, haga clic en la ventana del clasificador de células en el software. Luego, para recopilar únicamente datos de células, seleccione el canal uno del límite inferior para el campo claro y establezca el valor en 50 micrómetros; los objetos con área menor a 50 micrómetros se considerarán detritos y no serán adquiridos.Seleccione los canales que se recopilarán haciendo clic en los iconos de canal correspondientes en el software aquí. Los canales 1, 2, 3, 4, 5 y seis están seleccionados en la pestaña de configuración. Ingrese el número de archivo y la carpeta de destino.Establezca el número de secuencia en uno y el número de eventos a adquirir en 5 000. Haga clic en ejecutar, adquiera para recolectar y guardar el primer archivo de datos del experimento. Haga clic en FLL y ejecute la siguiente muestra experimental.Repita hasta que se hayan recolectado todas las muestras experimentales. A continuación, para ejecutar los controles, haga clic en configuración de compensación. Esto desactivará el campo brillante y el láser de dispersión y permitirá la recolección de todos los canales de fluorescencia en la pestaña de adquisición.Cambie el valor de entrada a 500. Luego coloque el tubo de control y haga clic en ejecutar. Adquiera para recolectar 500 células positivas en los controles teñidos individualmente.Repita el procedimiento para cada fluorocromo en el experimento con el fin de desarrollar una matriz de compensación. Una vez que se hayan adquirido todas las imágenes de la muestra, inicie el software de análisis ideas en un ordenador de análisis separado haciendo doble clic en el icono de ideas en el escritorio. Haga doble clic en el asistente de internalización y cargue uno de los archivos RIF de la muestra de prueba.Una ventana emergente proporcionará instrucciones para cargar los archivos de prueba. Siga las instrucciones y haga clic en el botón siguiente. A continuación, haga clic en nueva matriz.Esto iniciará el asistente de compensación. Cuando se solicite, seleccione los archivos de datos para los controles de color único a fin de agregarlos. Haga clic en siguiente dentro del asistente siguiendo las instrucciones hasta que el archivo de matriz de compensación se guarde y cargue en el cuadro en el paso dos del asistente de internalización.Haga clic en siguiente y siga las instrucciones hasta que se genere un archivo DAF. Establezca las propiedades de visualización de la imagen seleccionando los canales de imagen utilizados durante la adquisición. Haga clic en el canal dos para FITC y en el canal cinco para AF 606.El campo claro y la dispersión lateral se seleccionan por defecto. Seleccione el canal de campo claro O1 para delimitar el contorno celular y el canal O2 en el que se recolectaron las nanopartículas o bacterias para la sonda de internalización, con el fin de definir la población de células individuales; se genera un diagrama de dispersión del área de campo claro frente a la relación de aspecto de campo claro de todas las células. El análisis de alto rendimiento de múltiples archivos de datos requiere un archivo plantilla, por lo que es de vital importancia definir cuidadosamente las puertas al crear dicho archivo plantilla.Cada punto representa los valores de una imagen individual de célula. Haga clic en un punto de un gráfico para seleccionar la imagen de esa célula particular en la galería de imágenes.A continuación, dibuje una compuerta alrededor de las células con el área y la relación de aspecto que corresponden a eventos de célula individual. Las células individuales tienen una relación de aspecto de aproximadamente uno, y los dobletes tienen una relación de aspecto de alrededor de 0.5.Haga clic en múltiples celdas para diferenciar la región que contiene celdas individuales frente a dobletes o detritos. Para generar un histograma de la raíz cuadrada media del gradiente de la imagen de campo claro. Haga clic en el botón siguiente.Luego, en la pestaña de población, seleccione la opción de contenedor para mostrar el contenedor seleccionado. Haga clic en los contenedores para determinar la ubicación de las células y el mejor enfoque. Comience y dibuje una región lineal para guiar las células enfocadas.Cuanto mayor sea el RMS del gradiente, mejor enfocada estará la muestra; omita el siguiente paso a menos que haya otras tinciones en las que basar el análisis. Se genera un nuevo diagrama de dispersión con la intensidad del canal dos en el eje X frente al valor máximo del píxel del canal dos en el eje Y. Haga clic en los puntos y visualice las imágenes para ayudarse a determinar la región que debe dibujarse alrededor de las células positivas para nanopartículas o bacterias.Se genera un histograma de la característica de internalización con una región que comienza en cero, lo cual debe ajustarse observando las imágenes. La característica de internalización es una relación entre la intensidad dentro de la célula y la intensidad de toda la célula. Está escalada de tal manera que, en un valor de cero, la mitad de la intensidad se encuentra en el interior.El asistente ha creado una región de cada célula que designa el interior mediante la elaboración de una máscara que se utiliza, la imagen de entrada de la célula para encontrar la superficie celular y se erosionó esta en cuatro píxeles. Tenga en cuenta que esta máscara puede ajustarse manualmente para diferentes tipos de células cuando sea necesario, creando primero una máscara de objetos en la imagen de campo claro y erosionando esta en más o menos píxeles. La característica de internalización se calcula a partir de esta máscara de objetos erosionada utilizando un algoritmo en el software.Esta característica nos permite distinguir partículas y bacterias internalizadas, que tienen la mayor parte de su señal fluorescente dentro del límite de la máscara, de las partículas y bacterias unidas a la superficie, que tienen la mayor parte de su señal fluorescente fuera del límite de la máscara, como se muestra en este ejemplo. Cree un nuevo histograma con una nueva característica de internalización basada en la máscara de objeto erosionada. Dibuje una región para establecer una compuerta sobre las células internalizadas visualizando la imagen en el modo de bin seleccionado. Establezca la compuerta en 0,3 aquí.Las células con una puntuación inferior a 0,3 se consideran células positivas para partículas unidas a la superficie. Para eliminar las células con marcado de fondo e identificar nanopartículas o bacterias internizadas específicamente, seleccione características en el menú de análisis. Haga clic en el menú de análisis.Luego, haga clic en la función de recuento de colonias junto a agregar el recuento medio de colonias al informe de estadísticas. En el menú de informes, haga clic en el ícono de informes. A continuación, defina el informe de estadísticas, luego agregue columnas y finalmente seleccione la población celular adecuada.Haga clic en aceptar. El asistente de internalización agregará automáticamente estadísticas a este informe para guardar el archivo de datos como archivo de plantilla que se utilizará para el análisis por lotes de todos los archivos experimentales. Haga clic en el menú archivo y seleccione guardar como plantilla.Archivos de plantilla. Tienen la extensión dot AST para analizar múltiples archivos de datos en el software idea. Haga clic en herramientas y seleccione archivos de datos por lotes e ingrese todos los archivos RIF.Agregue el archivo de matriz de compensación y el archivo de plantilla en las secciones correspondientes para enviar el lote para su procesamiento; haga clic en enviar. Después del paso de procesamiento, se analizan todos los archivos RAF y se generan archivos DAF para cada uno de los archivos sin procesar individuales. Se genera un informe final con estadísticas para todas las muestras a fin de comparar el efecto de la inhibición de la actina y de la baja temperatura sobre la fagocitosis de salmonela y nanopartículas.Las células RA W2 64.7 se incubaron a 37 grados Celsius en medio, con o sin citocalasina D, o se incubaron en medio a cuatro grados Celsius. Tanto la temperatura como las manipulaciones del actin redujeron la internalización de ambas nanopartículas y Salmonella. Sin embargo, incubar las células con citocalasina D aumentó el porcentaje de células con nanopartículas unidas a la superficie, mientras que disminuyó el porcentaje de células con Salmonella unida a la superficie.El porcentaje de células positivas para nanopartículas unidas a la superficie aumenta de aproximadamente el 8 % a 37 grados Celsius a más del 35 % tras el tratamiento con citocalasina D o a cuatro grados Celsius. En contraste, el porcentaje de células con Salmonella unida a la superficie se redujo del 35 % al 15 % tras el tratamiento con citocalasina D. La incubación de células RAW264.7 con Salmonella a cuatro grados Celsius disminuyó la internalización sin un aumento aparente en la cantidad de bacterias unidas a la superficie en comparación con el control a 37 grados Celsius. En conjunto, estos datos demuestran que Salmonella y las nanopartículas son internalizadas mediante un proceso celular similar que requiere actina y es dependiente de la temperatura.Además, los datos indican que la unión sostenida de salmonela a los macrófagos requiere la polimerización de actina. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo examinar la internalización celular de nanopartículas y bacterias mediante citometría de flujo de imágenes multiespectrales. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que los inhibidores son citotóxicos.Por lo tanto, son necesarios experimentos previos de perfilado de citotoxicidad para determinar las concentraciones óptimas a utilizar. No olvide que trabajar con Salmonella puede ser peligroso; se deben tomar precauciones, como usar el equipo de protección personal adecuado y evitar la creación de aerosoles, al realizar este procedimiento.

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Fuente: Zhang, Y., et al. Aplicación de nanopartículas fluorescentes para estudiar la remodelación del sistema endolisosomal por bacterias intracelulares. J. Vis. Exp. (2015)Este video demuestra el uso de nanopartículas fluorescentes para visualizar la remodelación endo-lisosomal en células epiteliales humanas infectadas por bacterias intracelulares. Después de la invasión bacteriana, los patógenos manipulan el citoesqueleto del huésped y el sistema endolisosomal, formando vacuolas con...

Visualización mediada por nanopartículas de la remodelación endolisosomal en células infectadas por bacterias

En este estudio, el objetivo principal fue monitorear la absorción celular y la eventual exocitosis de los nanotubos de carbono (CNTs). Desde esta perspectiva, propusimos aquí un método único que utiliza la citometría de flujo de imágenes multiespectrales que permite la cuantificación y localización de CNTs en un número estadísticamente relevante de células.

Localización y cuantificación relativa de nanotubos de carbono en las células con multiespectral de imágenes de Citometría de Flujo

Análisis de la interacción de nanopartículas con subpoblaciones definidas de células inmunes por citometría de flujo.

La detección de nanopartículas fluorescentes Interacciones con inmunodeficiencia primaria subpoblaciones celulares por citometría de flujo

Este artículo describe métodos para la síntesis y marcaje fluorescente de nanopartículas (NPs). Los NPs se aplicaron en los experimentos de pulso-caza para etiquetar el sistema de endo-lisosomal de las células eucariotas. La manipulación del sistema de endo-lisosomal por las actividades del patógeno intracelular Salmonella enterica fueron seguidos por imágenes de células vivas y cuantificada.

Aplicación de nanopartículas fluorescentes para estudiar Remodelación del Sistema Endo-lisosomal por bacterias intracelulares

Este método demuestra una técnica para evaluar la función de los granulocitos midiendo simultáneamente la fagocitosis de las bacterias y el estallido oxidativo. La citometría de flujo basada en imágenes permitió la identificación de tres subconjuntos distintos de granulocitos activados que diferían en su capacidad funcional relativa.

Imagen basada en Citometría de Flujo Técnica para evaluar los cambios en función de los granulocitos In Vitro

Análisis cytometric del flujo ha demostrado ser valioso para investigar cultivos puros y monitoreo de la dinámica de la comunidad microbiana. Presentamos tres flujos de trabajo integrales, de muestreo para análisis de datos, para cultivos puros y comunidades complejas en medio claro, así como en matrices difíciles, respectivamente.

Caracterización dinámica de microbioma-citometría de flujo basado en flujos de trabajo de cultivos puros de las comunidades naturales

El ensayo de micronúcleos in vitro es un método bien establecido para evaluar la genotoxicidad y la citotoxicidad, pero la puntuación del ensayo mediante microscopía manual es laboriosa y sufre de subjetividad y variabilidad entre marcadores. Este documento describe el protocolo desarrollado para realizar una versión totalmente automatizada del ensayo utilizando citometría de flujo de imágenes multiespectral.

Un método automatizado para realizar el ensayo de micronúcleos In Vitro mediante citometría de flujo de imágenes multiespectral

Las curvas innovadoras (BTC) son herramientas eficientes para estudiar el transporte de bacterias en medios porosos. Aquí introducimos herramientas basadas en dispositivos fluidos en combinación con microscopía y conteo citométrico de flujo para obtener BTC.

Combinación de dispositivos fluidos con microscopía y citometría de flujo para estudiar el transporte microbiano en medios porosos a través de escalas espaciales

Este artículo presenta la integración de un módulo de enfoque espectral y un láser de pulso de doble salida, lo que permite obtener imágenes hiperespectrales rápidas de nanopartículas de oro y células cancerosas. Este trabajo tiene como objetivo demostrar los detalles de las técnicas ópticas no lineales multimodales en un microscopio de escaneo láser estándar.

Imágenes biomoleculares de la captación celular de nanopartículas mediante microscopía óptica multimodal no lineal

Este protocolo describe un enfoque cuantitativo para medir la autoagregación microbiana mediante citometría de flujo por imágenes.

Citometría de flujo por imágenes para estudiar la autoagregación microbiana

Este estudio dilucida el procesamiento fagocítico de las partículas de Godanti Bhasma (GB) en células de mamíferos, caracterizando su absorción celular, dinámica de vacuolas, acidificación y degradación. Estos hallazgos no solo avanzan en nuestra comprensión de los mecanismos fundamentales de la fagocitosis, sino que también establecen a la GB como un sistema modelo prometedor para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas.

Explorando los eventos celulares secuenciales de fagocitosis desencadenados por Godanti Bhasma en células de mamíferos

Aprende a analizar la internalización celular de nanopartículas y bacterias mediante citometría de flujo de imágenes multiespectral en células RAW 264.7. Este método permite distinguir partículas internalizadas de las unidas a la superficie.

El análisis de la internalización celular de nanopartículas y bacterias en un Multi-espectral de Citometría de Flujo de imágenes (Video) | JoVE Journal

El análisis de la internalización celular de nanopartículas y bacterias en un Multi-espectral de Citometría de Flujo de imágenes

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