Caracterización de células inmunes en el tejido adiposo humano mediante el uso de citometría de flujo

El objetivo general de este procedimiento es utilizar la citometría de flujo para aislar la fracción vascular estromal del tejido adiposo humano para el fenotipado de las diferentes poblaciones de células inmunitarias que se encuentran dentro del tejido adiposo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la investigación metabólica, como qué células inmunitarias se acumulan en el tejido adiposo de las personas obesas y en qué medida. La principal ventaja de esta técnica es que permite la medición simultánea de múltiples marcadores en las células inmunitarias y la identificación y cuantificación de estas células inmunitarias en el tejido adiposo.

Aunque esta técnica puede proporcionar información crucial sobre la inflamación del tejido adiposo, también se puede aplicar a otros órganos y tejidos. Por lo general, las personas nuevas en esta técnica lucharán principalmente con la contaminación de las células vasculares estromales y la pérdida de células durante el procedimiento de tinción. Dos de mis doctorandos, Suzan Wetzels y Mitchell Bijnen, serán los encargados de ejecutar el protocolo.

Comience usando un bisturí para picar un gramo de biopsia de tejido adiposo en trozos de aproximadamente dos milímetros cuadrados. Transfiera las piezas a un tubo de centrífuga de 50 mililitros y agregue 10 mililitros de solución de colagenasa a las muestras. Incubar los fragmentos de tejido durante 60 minutos en un baño de agua a 37 grados centígrados a 60 ciclos por minuto.

Seguido de la filtración a través de un colador de 200 micrómetros en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros. Enjuague el filtro con siete mililitros de PBS antes de la centrifugación. A continuación, utilice una pipeta para eliminar el sobrenadante sin sumergir toda la punta de la pipeta en la solución.

El pellet debe ser claramente visible y eliminar casi todo el sobrenadante para evitar la contaminación de la fracción vascular estromal con células adiposas. Suspendemos la pastilla de células vasculares estromales con cinco mililitros de PBS fresco y filtramos la fracción vascular estromal a través de un colador de 70 micrómetros en un tubo nuevo. Después de la centrifugación, suspendemos el pellet de la fracción vascular estromal lavada en tres mililitros de tampón de lisis de eritrocitos durante cinco minutos en hielo.

A continuación, detenga la lisis con siete mililitros de PBS y granule las células por centrifugación. Para teñir la fracción vascular estromal para el análisis por citometría de flujo, vuelva a suspender el pellet en 90 microlitros de clasificación celular activada por fluorescencia de cuatro grados Celsius, o tampón FACS, y bloquee la tinción inespecífica con diez microlitros de IgG humana. Divida la suspensión de celdas entre dos pocillos de una placa de fondo en V de 96 pocillos y coloque las celdas en hielo durante 15 minutos.

Al final de la incubación, lavar cada muestra con 100 microlitros de tampón FACS, volteando la placa con un movimiento suave sin golpear para desechar los sobrenadantes al final de la centrifugación. Asegúrese de poder ver claramente el gránulo en la parte inferior de la placa antes de darle la vuelta para evitar la pérdida de células durante el procedimiento. Vuelva a suspender el primer pellet en 29,5 microlitros de cóctel de anticuerpos para el primer panel FACS y el segundo pellet en 23 microlitros de cóctel de anticuerpos para el segundo panel FACS.

Después de 30 minutos en hielo en la oscuridad, lave las celdas con 150 microlitros de tampón FACS por pocillo y fije los gránulos de celdas en 150 microlitros de solución de formaldehído al uno por ciento. Transfiera las suspensiones celulares de cada pocillo a los tubos FACS correspondientes apropiados y coloque las muestras en hielo. Antes de su análisis, cargue un control negativo sin tinción en el citómetro de flujo para establecer los parámetros de dispersión directa y dispersión lateral.

A continuación, ajuste los voltajes del citómetro de flujo de acuerdo con las instrucciones del fabricante hasta que todas las poblaciones de interés sean visibles en los gráficos de dispersión directa y lateral, y se pueda hacer una distinción entre los residuos y las células vivas. Cuando se hayan establecido todos los parámetros, agite la primera muestra experimental a 800 rpm para volver a suspender completamente las celdas y cargar la muestra en el citómetro. Lea un mínimo de 50.000 eventos en la puerta en vivo, luego vórtice y cargue la segunda muestra para el análisis como se acaba de demostrar.

Para permitir el análisis de las poblaciones de macrófagos del tejido adiposo en este experimento representativo, se excluyeron otras células inmunitarias, como las células T, las células B, los neutrófilos y las células asesinas naturales para revelar la presencia de macrófagos CD11b+CD11c+, macrófagos CD11B+CD11C y células dendríticas CD11B-CD11C+. La cuantificación de la intensidad de fluorescencia principal de estas células reveló la expresión de células dendríticas citoideses plasmáticas y marcadores genéricos de células dendríticas en las células CD11B+CD11C+y CD11Blow-CD11C+, con una mayor expresión de ambos marcadores observada en las células CD11Blow-CD11C+, lo que confirma que las células CD11Blow-CD11C+ eran en realidad células dendríticas. La activación de las células CD45 positivas reveló poblaciones de células T CD19 positivas para B y CD3 positivas, la última de las cuales podría subdividirse a su vez en subconjuntos de células T CD3 + CD4 + T auxiliares y CD3 + CD8 + citotóxicas y células asesinas naturales CD3-CD56 +.

A continuación, se calculó el porcentaje de células inmunitarias viables para cada sujeto, revelando un aumento significativo en el porcentaje de macrófagos proinflamatorios CD11B+CD11C+ en el tejido adiposo visceral de sujetos varones adultos obesos. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cuatro horas si se ejecuta correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante mantener los tampones y las fracciones celulares en hielo, y al etiquetar las células con anticuerpos, es muy importante mantenerlas en la oscuridad.

Tras su desarrollo, esta técnica permitió a los investigadores del campo de la investigación metabólica explorar las alteraciones de las células inmunitarias en el tejido adiposo de los seres humanos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar las células inmunitarias del tejido adiposo y cómo realizar la citometría de flujo en estas células. Ten en cuenta que estás trabajando con material y sustancias humanas potencialmente infecciosas, como el formaldehído, que pueden ser peligrosas.

Siempre tome precauciones usando guantes y gafas de seguridad.