Name: Caracterización de células inmunes en el tejido adiposo humano mediante el uso de citometría de flujo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Aprende a caracterizar células inmunes en tejido adiposo humano mediante citometría de flujo. Este protocolo permite identificar y cuantificar macrófagos, células T, B y NK en la fracción vascular estromal para investigar inflamación metabólica.

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Nos gustaría agradecer a J. van de Gaar y Vroomen M. (Universidad de Maastricht, los Países Bajos) por su apoyo técnico. Además, nos gustaría dar las gracias K. Verboven, D. Hansen, J. Jocken, y E. Blaak para proporcionar las biopsias de tejido y sangre se utiliza para configurar este protocolo y los experimentos subsecuentes.

Visceral y subcutáneo en las muestras fueron tomadas de sujetos incluidos en el estudio aprobado por la ética médica Comité Jessa Hospital, Hasselt y Universidad de Hasselt, Bélgica, según la declaración de Helsinki.
1. preparación de reactivos
<ol><li>Solución de colagenasa<ol>
<li>Disolver 1 g de colagenasa en 10 mL de fosfato tampón salino (PBS, sin calcio y magnesio) para hacer una solución madre de 100 mg/mL. Preparar alícuotas μl 200 y almacenar a-20 ° C.</li>
		<li>Disolver 1 g de colagenasa XI en 10 mL de PBS para hacer una solución madre de 100 mg/mL. Preparar alícuotas μl 200 y almacenar a-20 ° C.</li>
		<li>Disolver 10 mg de la ADNsa I en 10 mL de PBS para hacer una solución stock de 10 mg/mL. Preparar alícuotas μl 180 y almacenar a-20 ° C.</li>
		<li>Añadir 100 μl colagenasa I (100 mg/mL), 100 μl colagenasa XI (100 mg/mL) y 90 de μl de DNasa I (10 mg/mL) 10 mL de DMEM Ham F12. Hacen de colagenasa solución fresca para cada aislamiento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tampón de lisis de eritrocitos<ol>
<li>Disolver 0,84 g de NH4Cl en 100 mL de agua ultrapura.</li>
		<li>Ajuste el pH a 7.4 antes de su uso. Almacenar en un frasco de vidrio a 4 ° C.</li>
		<li>Coloque el buffer de lisis de eritrocitos en hielo antes de usarlo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tampón FACS<ol>
<li>Disolver 0.5 g albúmina de suero bovino (BSA) en 100 mL de PBS para obtener 0,5% BSA PBS.</li>
		<li>Disolver 65 mg de NaN3 en 100 mL 0,5% BSA PBS para obtener 10 mM NaN3 0,5% BSA PBS. Almacene la solución en un frasco de vidrio a 4 ° C.</li>
		<li>Tampón FACS lugar en hielo antes de usarlo. PRECAUCIÓN: NaN3 es altamente tóxico. Trabajar en una campana de humos y use gafas de seguridad y guantes de protección durante la manipulación de NaN3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bloque de IgG humana<ol>
<li>Disolver 10 mg de IgG humana en 10 mL de PBS para obtener 1 mg/mL. Preparar alícuotas μl 100 y almacenar a-20 ° C.</li>
		<li>Coloque el bloque de IgG humano en hielo antes de usarlo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. aislamiento de SVF de AT
<ol><li>Corte la 1 g de en la biopsia (± 2 mm2) con un bisturí y transferencia a un tubo de centrífuga de 50 mL (por ejemplo, tubo de halcón). Añadir 10 mL de solución de colagenasa a cada uno en la muestra. Nota: Cerrar completamente la tapa del tubo y gire la tapa ¼ detrás.</li>
	<li>Incubar por 60 min a 37 ° C en un baño de agua con agitación suave (60 ciclos/min).</li>
	<li>Filtrar la suspensión resultante con un filtro de 200 μm y recolectar la muestra en un tubo de centrífuga de 50 mL nuevo. Agregar 7 mL de PBS sobre el filtro para enjuagar el filtro y obtener todas las células.</li>
	<li>Centrifugar la muestra a 280 x g durante 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Eliminar la fracción flotante del adipocito por pipeteo. El pellet celular es el SVF. Nota: Retire la fracción del adipocito para obtener SVF. Evitar sumergiendo la punta entera en la muestra porque esto sólo eliminará el PBS y no los adipocitos flotantes.</li>
	<li>Resuspender el SVF en 5 mL de PBS para eliminar la colagenasa, filtrar la suspensión con un filtro de 70 μm, enjuagar el filtro con 5 mL de PBS y Centrifugue la muestra a 280 x g durante 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado en 3 mL de tampón de lisis de eritrocitos.</li>
	<li>Incubar durante 5 minutos en hielo. Agregar 7 mL de PBS después de la incubación.</li>
	<li>Centrifugar la muestra a 280 x g durante 5 min a 4 ° C.</li>
</ol>3. coloración de SVF para análisis de citometría de flujo
<ol><li>Disolver el precipitado de células en 90 μl de tampón FACS de 4 ° C y añadir 10 μl de bloque de IgG humana de 1 mg/mL. Dividir la suspensión celular en 2 pocillos de una placa bien de forma de v 96. Coloque la placa de hielo y dejar el bloque de IgG humano incubar por 15 min.</li>
	<li>Añadir 100 μl de tampón FACS a cada muestra para lavar y centrifugar la placa por 5 min con 280 x g a 4 ° C. Quite el sobrenadante inclinando la placa boca abajo en un movimiento suave sin golpeando ligeramente la placa. Nota: Asegúrese de quitar cualquier líquido restante de la parte superior de la placa con un pañuelo mientras manteniendo la placa boca abajo.</li>
	<li>Preparar cócteles de anticuerpos macrófagos y subconjuntos de DC (panel 1 de FACS) y subconjuntos de células T y B (panel de FACS 2) como se describe en la tabla 1 y tabla 2. Los volúmenes descritos en la tabla 1 y tabla 2 se seleccionan después de optimizar las concentraciones de anticuerpo y son suficientes para un IVA o muestra sAT. Nota: En el panel 1 de la FACS, use los marcadores CD303 y CD141 para confirmar que CD11C+ CD11Bbajo las células son DCs. Sin embargo, se recomienda excluir estos marcadores del panel con una coloración en vivo/muerto. Ambos panel de FACS 1 y 2 puede combinarse con la viabilidad LIVE/DEAD fijable rojo muerto celular Kit Stain tinción cuando excluyendo CD303 en panel 1 como canal PE será sin usar. Realizar viabilidad coloración según las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Resuspender el pellet en 29,5 anticuerpo μl coctel para panel de FACS 1 y 23 μl anti coctel para panel de FACS 2. Incubar por 30 min en la oscuridad en el hielo.</li>
	<li>Añadir 150 μL de tampón FACS a cada pocillo y resuspender el precipitado de células para realizar un segundo paso de lavado. Centrifugar la placa durante 5 minutos a 280 x g a 4 ° C. Quite el sobrenadante inclinando la placa boca abajo.</li>
	<li>Añadir solución de formaldehido de 1% de 150 μL a cada pocillo para fijar las células. Transferir la suspensión de células de cada pozo al tubo correspondiente de FACS mediante pipeteo con una pipeta de P200. Almacenar tubos FACS a 4 ° C en el oscuro hasta 7 días. Nota: También es posible una medición directa. Añadir 150 μL de tampón FACS a cada pocillo en vez de formaldehído al 1%, las células de transferencia mediante pipeteo con una pipeta de P200 a los tubos correspondientes de FACS y analizar las células. PRECAUCIÓN: El formaldehído es muy tóxico. Preparar soluciones de formaldehído al trabajar en una campana de humos para evitar la inhalación y utilizar guantes y gafas de seguridad para la protección.</li>
</ol>4. Análisis de citometría de flujo de
<ol><li>Antes de la primera medición, utilice un control negativo sin mancha para establecer la forward scatter (FSC) y el lado scatter (SSC). Ajustar los voltajes de la citometría de flujo según las instrucciones del fabricante para que todas las poblaciones de interés son visibles en el gráfico de FSC y SSC y puede hacerse una distinción entre residuos y células vivas.</li>
	<li>Realizar análisis de compensación de varios colores con cuentas de captura de anticuerpos siguiendo el protocolo del fabricante.</li>
	<li>Preparar fluorescencia menos uno controla (FMO) haciendo la mezcla de anticuerpos pero excluye un anticuerpo de la mezcla. Hacer esto para cada anticuerpo, creando 8 mezclas de anticuerpos para el panel 1 de la FACS y 6 mezclas de anticuerpos para el panel de FACS 2. Estas mezclas de anticuerpos FMO se utilizan para manchas SVF como se describió anteriormente en el presente Protocolo.</li>
	<li>Medir todos los controles de FMO y establezca la estrategia bloquea basada en controles FMO. Utilice los controles FMO para detectar posible auto-fluorescencia de las células. Nota: Al eliminar un anticuerpo de la mezcla, cualquier nivel de fluorescencia detectada en este canal es una señal de fondo/autofluorescent. Por lo tanto, comparando lo diferentes FMO control resultados de FACS, puertas pueden establecerse en poblaciones específicas, asegurando que el guardapolvo se basan en las células positivas y no basada en auto-fluorescencia.</li>
	<li>Tubos de vórtice la FACS a 800 rpm antes de colocarlos en el citómetro de flujo y a partir de la medición. Nota: Se recomienda un mínimo de 50.000 eventos en la puerta directo para asegurar que suficientes células miden de cada subpoblación.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no declaran conflictos de interés.

Estos métodos describen cómo aislar el SVF de IVA y se sentaban y cuantificar las cantidades relativas de las células inmunes dentro de estos tejidos. Además, los métodos indican cómo determinar la expresión de marcadores en tipos celulares específicos.
Citometría de flujo de las células inmunes del tejido es una técnica poderosa para fenotipo el estado inmunológico de los tejidos. La cuantificación de las células inmunes del tejido puede tener muchas aplicaciones. Como se describe en los resultados, es posible comparar la presencia de células inmunes específicas entre grupos de pacientes (por ejemplo, lean vs obesos). Además, realizando también citometría de flujo en la sangre de los mismos pacientes, se pueden investigar las asociaciones entre la circulación de las células y las células del tejido. Con esta aplicación hemos podido determinar que un subconjunto específico de los monocitos circulantes se asocia con pro-inflamatoria CD11C+ de los macrófagos del tejido adiposo16.
Ajustes en el protocolo descrito ampliará sus aplicaciones como numerosos anticuerpos fluorescentes disponibles citometría de flujo muy versátil. Con los diferentes anticuerpos se distinguen casi todos los tipos de la célula y puede detectarse la expresión de muchos marcadores. Además, es posible manchar marcadores intracelularmente por permeabilizing de la membrana celular para permitir la Unión intracelular de los anticuerpos fluorescentes. Estas características permiten la distinción de las poblaciones de macrófagos muy diversos más allá de los subtipos de macrófagos M1 y M2 excesivamente simplificadas. Además de medida de la expresión superficial del marcador, proteínas (es decir, citoquinas) pueden tinción intracelular facilitando información sobre funcionalidad del macrófago. Además, marcadores de proliferación como el Ki67 se utilizan para cuantificar las tasas de proliferación. Como se describe, distinción entre macrófagos y DCs se basó en niveles MFI de marcadores de DC. Un marcador de macrófagos general, tales como CD68 puede ser incorporado en el panel de macrófagos (FACS panel 1). Sin embargo, CD68 necesita teñirse intracelular que requiere permeabilización de la membrana celular que no es preferible y extendería el protocolo. Otros marcadores de macrófagos son marcadores de subconjunto como CD163 y CD206 o CD11c, este último integrado en el panel de macrófago presentado aquí.
En nuestros paneles de FACS, un marcador para distinguir las células vivas y muertas no se incluyó, que sería preferible porque permite una exclusión más precisa de las células muertas que el uso de FSC y SSC. Utilizadas es el ADN de tinción viabilidad tintes yoduro de propidio (PI) o 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) así como amina libre reaccionar tintes como el LIVE/DEAD fijable muerto celular Kit Stain, que está disponible en colorante diferentes colores. Sin embargo, DAPI y PI no pueden utilizarse cuando se fijan las células. Como se describe en el protocolo, la tinción de viabilidad LIVE/DEAD fijable muerto eritrocitos puede integrarse en dos paneles sin afectar el FACS general Estrategia que bloquean.
Además, los datos se expresan como un porcentaje de células vivas, lo que significa que todos los datos son relativos. Sólo introduciendo un exacto, conocido el número de células en el citómetro de flujo, sería posible determinar las cifras exactas de cada tipo de célula. Un número aproximado de células podría calcularse después de contar las células en la fracción SVF utilizando una cámara de conteo. Sin embargo, este número tendría que ser ajustado por la cantidad de tejido de biopsia utilizado para aislar el SVF, pero esto tiene limitaciones cuando se comparan lean a obesos en. Una masa similar de obesos en consiste en menos adipocitos ya que están llenas de lípidos y han ampliado grandemente. Esto podría conducir a una subestimación del número de células inmunes si presentado como número de células inmunes por gramo de a o por el adipocito.
En estudios en humanos, inclusión de pacientes se realiza durante un largo periodo de tiempo que la estandarización de los procedimientos experimentales de gran importancia. Para la comparación de datos de citometría de flujo entre los pacientes, hay varias opciones. Como se describe en este protocolo, las células pueden fijarse antes de medición permite el análisis de varias muestras en el mismo día. Esto puede lograrse también congelando el SVF antes les coloración, permite que el procedimiento de tinción sea igual entre todas las muestras, pero podría afectar la viabilidad de las células. Por último, también empleado en este estudio, son perlas fluorescentes para instalar los niveles de compensación y citómetro seguimiento granos fueron utilizados dos veces por semana para estandarizar mediciones diarias de la citometría. Esta última opción es la más eficiente cuando mide muestras de un estudio que abarca un largo período de tiempo.
Un factor limitante para citometría de flujo en general es el uso de la fluorescencia. El número de etiquetas fluorescentes que pueden detectarse simultáneamente es limitado debido a la superposición de espectros de emisión. Sin embargo, con smart FACS panel desarrollo y el uso de varios cócteles de anticuerpo por IVA o muestra sAT, este problema puede superarse como se describe en este protocolo. Un aspecto importante del desarrollo del panel de FACS es controles FMO. Mediante el uso de los anticuerpos del grupo excepto uno, potenciales niveles de Autofluorescencia pueden apreciarse al comparar el FMO con el panel completo. Esto permite control exacto de las poblaciones y estos procedimientos deben ser realizados cuando se configura un nuevo panel de FACS. Además, las nuevas generaciones de dispositivos FACS pueden detectar hasta 50 parámetros que permiten la detección simultánea de muchas características por la célula. Otro tema relacionado con el aspecto de la fluorescencia es la autofluorescencia de las células, especialmente macrófagos. Después de la excitación de las células con el láser de FACS (principalmente con 488 excitación de longitud de onda nm), estas células emiten una señal fluorescente (principalmente < 640 nm) que puede traslapo con los espectros de emisión del anticuerpo etiquetas17,18. Para tener en cuenta esto, las células sin manchas deben medirse para determinar la autofluorescencia en cada canal. Con este conocimiento, se deben seleccionar fluorocromos que muestran una señal que excede la señal autofluorescent. Esta señal de fondo autofluorescent debe tenerse en cuenta al determinar la estrategia bloquea de las poblaciones. Por lo tanto, por aplicación de este protocolo y diseño de panel de FACS inteligente es posible en subtipos de profundidad fenotipo macrófago. EN distintos nuevos macrófagos y su función pueden ser caracterizados.

Obesidad se caracteriza con en bajo grado inflamación1 y la infiltración de células inmunes inflamatorias en visceral y subcutáneo en (IVA, sAT). Acumulación de células inflamatorias inmunes en el IVA provoca resistencia a la insulina que es el principal factor de riesgo para desarrollar diabetes 2 de tipo2. Las células inmunes del sistema inmune innato y adaptativo se encuentran en la en obesa, como macrófagos, mastocitos, neutrófilos, CD4+ y CD8+ las células T y células B3,4,5,6 ,7. Estas células inmunitarias, junto con las células endoteliales, células estromales, progenitores de adipocitos, fibroblastos y pericitos, constituyen el SVF8 y son la principal fuente de sustancias pro-inflamatorias en el AT9.
El estado inflamatorio de AT es comúnmente investigado por técnicas como Western blot10, qPCR11, inmunohistoquímica11. Sin embargo, al utilizar estas técnicas, en todo, adipocitos y SVF, se utiliza. Esto hace difícil determinar la cantidad y subconjuntos de células inmunes presentes en el AT. Las células inmunes tienen varios marcadores de la célula para definir y categorizar, como los macrófagos. Macrófagos muestran una heterogeneidad significativa en la célula y la función de expresión de marcador superficial12. Por lo tanto, a menudo se dividen en dos poblaciones de macrófagos: M1 y M2. Los macrófagos m2 generalmente se llaman macrófagos alternativamente activados12,13 y residen en el AT de magra, metabólicamente normales seres humanos14. Sin embargo, durante la obesidad, un interruptor fenotípico ocurre de M2 macrófagos macrófagos M1. Clásicamente estos activan M1 macrófagos expresan CD11C12 y se acumulan en adipocitos muertos para formar la corona-como las estructuras13. Se ha demostrado que CD11C+ los macrófagos en la en impedir la acción de la insulina y se asocian a resistencia a la insulina en seres humanos obesos15. Para identificar los macrófagos M1 y M2 en el AT, la inmunohistoquímica es una opción. Esta técnica da información sobre la ubicación de los macrófagos en el tejido. Sin embargo, limitará el número de marcadores que pueden utilizarse en una coloración. Por otra parte, también es difícil de cuantificar. Por lo tanto, para investigar los subconjuntos diferentes de células inmunitarias en el IVA y el sAT depósitos, hemos desarrollado un método de citometría de flujo. Este enfoque nos da la oportunidad de utilizar varios marcadores por celular con citometría de un flujo análisis para definir subconjuntos de la célula y los números de cada subconjunto presente en los depósitos en la cuenta.

<table><tbody><tr><td>Centrífuga</td><td>Hettich Rotanta 460R</td><td>5660</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águila Modificada' s Medio (DMEM)-Jamón' s F12</td><td>Gibco ThermoFisher</td><td>31330-095</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa XI de Clostridium histolyticum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7657-1g</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa I de Clostridium histolyticum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0130-1g</td><td></td></tr><tr><td>ADNasa I de páncreas bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Merck</td><td>1.01145.0500</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4503-100</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Merck</td><td>1.06688.0100</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; Jeringa M Filcons</td><td>BD Biosciences</td><td>340613</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; Filtro M</td><td>Greiner Bio-one</td><td>542070</td><td></td></tr><tr><td>Bloque Fc / humano IgG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>14506</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehído</td><td>Merck</td><td>1.04003.2500</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-BV421</td><td>Biolegend</td><td>301324</td><td></td></tr><tr><td>CD19-Fitc</td><td>BD Biosciences</td><td>555412</td><td></td></tr><tr><td>CD3-Fitc</td><td>BD Biosciences</td><td>561807</td><td></td></tr><tr><td>CD66b-Fitc</td><td>BD Biosciences</td><td>555724</td><td></td></tr><tr><td>CD56-Fitc</td><td>BD Biosciences</td><td>562794</td><td></td></tr><tr><td>CD11c-APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>337218</td><td></td></tr><tr><td>CD45-PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>557748</td><td></td></tr><tr><td>CD19-BV421 Biolegend</td><td></td><td>302234</td><td></td></tr><tr><td>CD3-V500</td><td>BD Biosciences</td><td>561416</td><td></td></tr><tr><td>CD56-APC</td><td>Biolegend</td><td>318310</td><td></td></tr><tr><td>CD4-PerCP-Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>300528</td><td></td></tr><tr><td>CD8-APC-H7</td><td>BD Biosciences</td><td>641400</td><td></td></tr><tr><td>CD303-PE</td><td>Biolegend</td><td>354204</td><td></td></tr><tr><td>CD141-APC</td><td>Biolegend</td><td>344106</td><td></td></tr><tr><td>FACS-Canto II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 placa de pocillo en forma de V</td><td>Greiner Bio-one</td><td></td><td></td>651101</tr><tr><td>PBS PH 7.4</td><td>Gibco ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Tubo FACS 5 mL tubo de poliestireno de fondo redondo</td><td>Corning</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>IgG de suero humano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I4506</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rata Ig, &kappa;/Juego de Partículas de Compensación de Control Negativo</td><td>BD Biosciences</td><td>552844</td><td></td></tr><tr><td>Juego de partículas de compensación de control negativo e Ig, &kappa;/Anti-Mouse</td><td>BD Biosciences</td><td>552843</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Kit de manchas de células muertas rojas reparables</td><td>ThermoFisher</td><td>L23102</td><td></td></tr><tr><td>IKA&nbsp;MS 3 agitador básico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z645028-1EA</td><td></td></tr></tbody></table>

caracterización de células inmunes en el tejido adiposo humano mediante el uso de citometría de flujo

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Infiltración de células inmunes en el tejido adiposo subcutáneo y visceral (a) depósitos conduce a una inflamación de bajo grada que contribuye al desarrollo de complicaciones asociadas a la obesidad como diabetes tipo 2. Cuantitativa y cualitativamente investigar los subconjuntos de células inmunes en humanos en los depósitos, hemos desarrollado un método de citometría de flujo. La fracción vascular estromal (SVF), que contiene las células inmunes, se aísla de la subcutánea y visceral en biopsias por digestión de colagenasa. Adipocitos se eliminan después de la centrifugación. Se tiñen las células SVF para múltiples marcadores de membrana-limite seleccionado para distinguir entre subconjuntos de células inmunitarias y analizaron mediante citometría de flujo. Como resultado de este enfoque, pro - y antiinflamatoria macrófago subconjuntos, las células dendríticas (DCs), células B, CD4+ y CD8+ células T y células NK pueden ser detectadas y cuantificadas. Este método da información detallada sobre las células inmunes en el AT y la cantidad de cada subconjunto específico. Puesto que existen numerosos anticuerpos fluorescentes, nuestro enfoque de citometría de flujo puede ajustarse para medir varios otros marcadores celulares e intracelulares de interés.

El SVF aislado del IVA y el sAT se midió mediante citometría de flujo. Mediciones del flujo cytometry generan parcelas con diferentes poblaciones celulares basadas en marcadores celulares (figura 1A y 1B). En primer lugar, trazando forward scatter (FSC-W) de ancho y adelante celular de (FSC-A), de área de dispersión agregados pueden ser eliminados del análisis de las células que bloquean como bajo FSC-W. Siguiente, energizadas las células se seleccionan, y ruina celular es excluido por bloquear las células del tamaño correcto y la complejidad mediante FSC-lado A y el área de dispersión (SSC-A), respectivamente. Las células muertas son pequeñas y por lo tanto visible como una población distinta con un pequeño FSC-A. Las células inmunes, próximo fueron seleccionadas por el uso de la pistola de pan-leucocitos CD45 (Panel 1 y 2, figura 1A). Para analizar los macrófagos, las células de otros inmune como las células T (CD3), linfocitos B (CD19), neutrófilos (CD66b+ CD11b+), y las células NK (CD56) fueron excluidas de análisis mediante el uso de diferentes anticuerpos contra estas células, pero con el mismo fluorocromo. Otra subdivisión de las células restantes se basó en la expresión de CD11b y CD11c. Esto dio lugar a las siguientes poblaciones: CD11b+ CD11c+ los macrófagos, CD11b+ CD11c macrófagos– y CD11bbajo /- CD11c+ DCs (FACS el panel 1, figura 1B). Medición de intensidad de fluorescencia media (IFM) permitió la cuantificación de la expresión de CD303 (marcador de la C.C. del plasmacytoid) y CD141 (marcador de DC), en CD11b+ CD11c+ macrófagos y CD11bbajo /- CD11c+ DCs. Expresión de ambos estos marcadores fueron mayores en CD11bbajo /- CD11c+ células confirmando que CD11bbajo /- CD11c+ células eran DCs (figura 1).
El CD45+ las células (figura 1A) se dividieron en las células T y células B con CD3 y CD19, respectivamente. Las células T se subdividieron en las células T-helper (CD4+) y células T citotóxicas (CD8+). Por último, CD3–CD19–células se trazaron para cuantificar utilizando el marcador CD56 de células NK (FACS el panel 2, figura 1). El número de células en cada puerta se cuantifica y puede utilizarse para calcular el porcentaje de este tipo de celulares de todas las células vivas (cuadro 3).
El porcentaje de células vivas puede ser calculado para cada tema que permite el cálculo de un promedio de todos los sujetos en un grupo de por ejemplo los hombres magros u obesos mostrando la abundancia de un específico células inmunitarias, es decir, el CD11b pro-inflamatoria+ CD11c+ macrófago en AT visceral (figura 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57319/57319fig1.jpg"> Figura 1. Estrategia de tejido adiposo visceral que bloquean FACS. (A) FACS trama de todos los eventos (negro) con intensidad de anchura de forward scatter (FSC-W) y la intensidad de la zona de forward scatter (FSC-A) que contiene una puerta para seleccionar solamente las células (rojo) seguidas de una parcela de FACS basada en intensidad de dispersión lateral y FSC-A zona (SSC-A) que contiene una puerta de selección de células vivas (verde claro). Parcela junto con SSC-A y la intensidad de fluorescencia de CD45 contiene una puerta de selección CD45 todos+ (inmune) las células (azul). (B) FACS parcela de CD56, CD19, CD3 y CD66b intensidad de fluorescencia versus CD11b intensidad de fluorescencia y una puerta de seleccionar todas las celdas que son negativas CD56, CD19, CD3 y CD66b (marrón) de más división en las poblaciones. Subdivisión adicional en la trama siguiente basada en la intensidad de fluorescencia de CD11b y CD11c. Puertas se muestran con CD11b+ CD11c+ macrófagos (verde oscuro), CD11b+ CD11c macrófagos– (morados) y CD11bbajo /- CD11c+ las células dendríticas (azul). (C) cantidad de CD11b+, CD11c+, o CD11bbajo /- CD11c+ mostrando sus niveles de intensidad de fluorescencia (eje x) para CD303 y CD141 y la cuantificación correspondiente de la media de las células (eje y) intensidad de fluorescencia (IMF). (D) FACS parcela mostrando el CD45 anterior+ población (azul) basado en la intensidad de la fluorescencia del CD3 y CD19 que contienen puertas de selección de células T (magenta), las células de B (verde oscuro) y no autofluorescent células (verde) negativo para ambos CD3 y CD19. El diagrama siguiente se basa en fluorescencia CD4 y CD8 con puertas selección CD4+ (verde claro) y CD8+ (magenta) células de T. Una idéntica estrategia bloquea se utiliza para el tejido adiposo subcutáneo. Una idéntica estrategia bloquea se utiliza para el tejido adiposo subcutáneo. Esta figura ha sido modificada de Wouters et al. 16 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57319/57319fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57319/57319fig2.jpg"> Figura 2. IVA obeso contiene macrófagos pro-inflamatorias más. La cantidad de CD11b+ CD11c+ los macrófagos presentados como porcentaje de todas las células vivas en el IVA de los hombres obesos y magros. Todos los datos son medios ± SEM; n = 20 lean y n = 31 para obesos. p ≤ 0.01 vs lean. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57319/57319fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Blanco</td>
			<td>Objetivo de la definición</td>
			<td>Presentes en</td>
			<td>Fluorocromo</td>
			<td>Cantidad</td>
			<td>Clon</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11B</td>
			<td>marcador de integrina mieloide</td>
			<td>granulocitos, monocitos/macrófagos, células dendríticasbaja y las células asesinas naturales</td>
			<td>BV421</td>
			<td>2,5 ΜL</td>
			<td>ICRF44</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD19</td>
			<td>antígeno común de la célula de B</td>
			<td>Desarrollo de la célula de b de células pro-B a la célula de B del blastoid y células de B del plasma</td>
			<td>FITC</td>
			<td>3 ΜL</td>
			<td>HIB19</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3</td>
			<td>antígeno común de la célula de T</td>
			<td>Los linfocitos T, células de T naturales del asesino y timocitos</td>
			<td>FITC</td>
			<td>3 ΜL</td>
			<td>UCHT1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD66B</td>
			<td>miembro del antígeno carcinoembrionario (CEA)-como familia de glicoproteína</td>
			<td>granulocitos</td>
			<td>FITC</td>
			<td>5 ΜL</td>
			<td>G10F5</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD56</td>
			<td>pesadamente glycosylated proteínas de adherencia</td>
			<td>células de asesino naturales y células de T naturales del asesino</td>
			<td>FITC</td>
			<td>5 ΜL</td>
			<td>B159</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD303</td>
			<td>tipo Glicoproteína transmembrana II</td>
			<td>células dendríticas plasmocitoides</td>
			<td>PE</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>201A</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD141</td>
			<td>trombomodulina</td>
			<td>monocitos/macrófagosbajo, subpoblación de las células dendríticas</td>
			<td>APC</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>M80</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11C</td>
			<td>tipo I Glicoproteína transmembrana; integrina αx</td>
			<td>monocitos/macrófagos, células dendríticas, granulocitos, células de asesino naturales, subconjunto de células B y T</td>
			<td>APC-Cy7</td>
			<td>0.5 ΜL</td>
			<td>Bu15</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>antígeno leucocitario común</td>
			<td>todos los leucocitos humanos incluyendo linfocitos, monocitos, granulocitos, eosinófilos y timocitos</td>
			<td>PE-Cy7</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>HI30</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tampón FACS</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>μl de 7.5</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1. Cocktail de anticuerpos FACS panel 1 para identificar subconjuntos de macrófagos y células dendríticas poblaciones. Cantidad de anticuerpo descrito es para el análisis de una muestra.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Blanco</td>
			<td>Objetivo de la definición</td>
			<td>Presentes en</td>
			<td>Fluorocromo</td>
			<td>Cantidad</td>
			<td>Clon</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD19</td>
			<td>antígeno común de la célula de B</td>
			<td>Desarrollo de la célula de b de células pro-B a la célula de B del blastoid y células de B del plasma</td>
			<td>BV421</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>HIB19</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3</td>
			<td>antígeno común de la célula de T</td>
			<td>Los linfocitos T, células de T naturales del asesino y timocitos</td>
			<td>V500</td>
			<td>3 ΜL</td>
			<td>UCHT1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD56</td>
			<td>pesadamente glycosylated proteínas de adherencia</td>
			<td>células de asesino naturales y células de T naturales del asesino</td>
			<td>APC</td>
			<td>5 ΜL</td>
			<td>HCD56</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4</td>
			<td>Superfamilia de las Ig, Glicoproteína transmembrana de tipo I</td>
			<td>Tipo de célula del ayudante de T, timocitos, monocitos/macrófagos, células de T naturales del asesino II</td>
			<td>PerCP-Cy5.5</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>RPA-T4</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8</td>
			<td>Α-subunidad de un complejo bimolecular disulfuro-ligado</td>
			<td>células de T citotóxicas, timocitos, subconjunto de células de asesino naturales</td>
			<td>APC-H7</td>
			<td>2 ΜL</td>
			<td>SK1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>antígeno leucocitario común</td>
			<td>todos los leucocitos humanos incluyendo linfocitos, monocitos, granulocitos, eosinófilos y timocitos</td>
			<td>PE-Cy7</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>HI30</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tampón FACS</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2. Cocktail de anticuerpos FACS panel 2para identificar las poblaciones de células T y B. Cantidad de anticuerpo descrito es para el análisis de una muestra.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Panel de macrófago</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Nombre de la puerta</td>
			<td># Células</td>
			<td>% de vivo</td>
		</tr>
<tr>
<td>Células</td>
			<td>183054</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>en vivo</td>
			<td>10477</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>4100</td>
			<td>39.13</td>
		</tr>
<tr>
<td>descarga–
</td>
			<td>771</td>
			<td>7.36</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11C CD11B– +
</td>
			<td>430</td>
			<td>4.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11C+ CD11B+
</td>
			<td>104</td>
			<td>0.99</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11C+ CD11Bbajo /-
</td>
			<td>15</td>
			<td>0.14</td>
		</tr>
<tr>
<td>Panel de células T, células B, células NK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Nombre de la puerta</td>
			<td>#Cells</td>
			<td>% de vivo</td>
		</tr>
<tr>
<td>Células</td>
			<td>34616</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>En vivo</td>
			<td>3728</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45+
</td>
			<td>1589</td>
			<td>42.62</td>
		</tr>
<tr>
<td>Células NK</td>
			<td>29</td>
			<td>0,78</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3+
</td>
			<td>953</td>
			<td>25.56</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4+
</td>
			<td>601</td>
			<td>16.12</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8+
</td>
			<td>328</td>
			<td>8.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD19+
</td>
			<td>20</td>
			<td>0.54</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 3. Abundancia de células inmunes de diferentes tipos de células en el IVA. Número de células en cada puerta y el porcentaje de los diferentes tipos de células basan en la cantidad total de células vivas.

Este artículo describe un método para analizar el contenido de la célula inmune del tejido adiposo por el aislamiento de las células inmunes del tejido adiposo y posterior análisis mediante citometría de flujo.

Caracterización de células inmunes en el tejido adiposo humano mediante el uso de citometría de flujo

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

El objetivo general de este procedimiento es utilizar la citometría de flujo para aislar la fracción vascular estromal del tejido adiposo humano para el fenotipado de las diferentes poblaciones de células inmunitarias que se encuentran dentro del tejido adiposo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la investigación metabólica, como qué células inmunitarias se acumulan en el tejido adiposo de las personas obesas y en qué medida. La principal ventaja de esta técnica es que permite la medición simultánea de múltiples marcadores en las células inmunitarias y la identificación y cuantificación de estas células inmunitarias en el tejido adiposo.Aunque esta técnica puede proporcionar información crucial sobre la inflamación del tejido adiposo, también se puede aplicar a otros órganos y tejidos. Por lo general, las personas nuevas en esta técnica lucharán principalmente con la contaminación de las células vasculares estromales y la pérdida de células durante el procedimiento de tinción. Dos de mis doctorandos, Suzan Wetzels y Mitchell Bijnen, serán los encargados de ejecutar el protocolo.Comience usando un bisturí para picar un gramo de biopsia de tejido adiposo en trozos de aproximadamente dos milímetros cuadrados. Transfiera las piezas a un tubo de centrífuga de 50 mililitros y agregue 10 mililitros de solución de colagenasa a las muestras. Incubar los fragmentos de tejido durante 60 minutos en un baño de agua a 37 grados centígrados a 60 ciclos por minuto.Seguido de la filtración a través de un colador de 200 micrómetros en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros. Enjuague el filtro con siete mililitros de PBS antes de la centrifugación. A continuación, utilice una pipeta para eliminar el sobrenadante sin sumergir toda la punta de la pipeta en la solución.El pellet debe ser claramente visible y eliminar casi todo el sobrenadante para evitar la contaminación de la fracción vascular estromal con células adiposas. Suspendemos la pastilla de células vasculares estromales con cinco mililitros de PBS fresco y filtramos la fracción vascular estromal a través de un colador de 70 micrómetros en un tubo nuevo. Después de la centrifugación, suspendemos el pellet de la fracción vascular estromal lavada en tres mililitros de tampón de lisis de eritrocitos durante cinco minutos en hielo.A continuación, detenga la lisis con siete mililitros de PBS y granule las células por centrifugación. Para teñir la fracción vascular estromal para el análisis por citometría de flujo, vuelva a suspender el pellet en 90 microlitros de clasificación celular activada por fluorescencia de cuatro grados Celsius, o tampón FACS, y bloquee la tinción inespecífica con diez microlitros de IgG humana. Divida la suspensión de celdas entre dos pocillos de una placa de fondo en V de 96 pocillos y coloque las celdas en hielo durante 15 minutos.Al final de la incubación, lavar cada muestra con 100 microlitros de tampón FACS, volteando la placa con un movimiento suave sin golpear para desechar los sobrenadantes al final de la centrifugación. Asegúrese de poder ver claramente el gránulo en la parte inferior de la placa antes de darle la vuelta para evitar la pérdida de células durante el procedimiento. Vuelva a suspender el primer pellet en 29,5 microlitros de cóctel de anticuerpos para el primer panel FACS y el segundo pellet en 23 microlitros de cóctel de anticuerpos para el segundo panel FACS.Después de 30 minutos en hielo en la oscuridad, lave las celdas con 150 microlitros de tampón FACS por pocillo y fije los gránulos de celdas en 150 microlitros de solución de formaldehído al uno por ciento. Transfiera las suspensiones celulares de cada pocillo a los tubos FACS correspondientes apropiados y coloque las muestras en hielo. Antes de su análisis, cargue un control negativo sin tinción en el citómetro de flujo para establecer los parámetros de dispersión directa y dispersión lateral.A continuación, ajuste los voltajes del citómetro de flujo de acuerdo con las instrucciones del fabricante hasta que todas las poblaciones de interés sean visibles en los gráficos de dispersión directa y lateral, y se pueda hacer una distinción entre los residuos y las células vivas. Cuando se hayan establecido todos los parámetros, agite la primera muestra experimental a 800 rpm para volver a suspender completamente las celdas y cargar la muestra en el citómetro. Lea un mínimo de 50.000 eventos en la puerta en vivo, luego vórtice y cargue la segunda muestra para el análisis como se acaba de demostrar.Para permitir el análisis de las poblaciones de macrófagos del tejido adiposo en este experimento representativo, se excluyeron otras células inmunitarias, como las células T, las células B, los neutrófilos y las células asesinas naturales para revelar la presencia de macrófagos CD11b+CD11c+, macrófagos CD11B+CD11C y células dendríticas CD11B-CD11C+. La cuantificación de la intensidad de fluorescencia principal de estas células reveló la expresión de células dendríticas citoideses plasmáticas y marcadores genéricos de células dendríticas en las células CD11B+CD11C+y CD11Blow-CD11C+, con una mayor expresión de ambos marcadores observada en las células CD11Blow-CD11C+, lo que confirma que las células CD11Blow-CD11C+ eran en realidad células dendríticas. La activación de las células CD45 positivas reveló poblaciones de células T CD19 positivas para B y CD3 positivas, la última de las cuales podría subdividirse a su vez en subconjuntos de células T CD3 + CD4 + T auxiliares y CD3 + CD8 + citotóxicas y células asesinas naturales CD3-CD56 +.A continuación, se calculó el porcentaje de células inmunitarias viables para cada sujeto, revelando un aumento significativo en el porcentaje de macrófagos proinflamatorios CD11B+CD11C+ en el tejido adiposo visceral de sujetos varones adultos obesos. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cuatro horas si se ejecuta correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante mantener los tampones y las fracciones celulares en hielo, y al etiquetar las células con anticuerpos, es muy importante mantenerlas en la oscuridad.Tras su desarrollo, esta técnica permitió a los investigadores del campo de la investigación metabólica explorar las alteraciones de las células inmunitarias en el tejido adiposo de los seres humanos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar las células inmunitarias del tejido adiposo y cómo realizar la citometría de flujo en estas células. Ten en cuenta que estás trabajando con material y sustancias humanas potencialmente infecciosas, como el formaldehído, que pueden ser peligrosas.Siempre tome precauciones usando guantes y gafas de seguridad.

characterization-immune-cells-human-adipose-tissue-using-flow

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Investigación

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Medicine

Medicina

El tejido adiposo (AT) es un sitio de activación de células inmunes y la interacción intensa. Casi todas las células del sistema inmune están presentes en AT y sus proporciones se alteran por la obesidad. Aislamiento adecuado, cuantificación y caracterización de las poblaciones de células inmunes son fundamentales para la comprensión de su papel en la enfermedad immunometabolic.

Aislamiento de tejido adiposo células inmunes

Este estudio compara dos métodos diferentes de aislamiento de monocitos humanos para obtener células dendríticas (CD) in vitro. Los monocitos se seleccionan por adherencia o se enriquecen negativamente por separación magnética. Se comparará el rendimiento y la viabilidad de los monocitos junto con la viabilidad, la proliferación y la expresión de marcadores de superficie CD11c/CD14 entre ambos métodos.

Caracterización de las células dendríticas derivadas de monocitos humanos mediante imágenes de Citometría de Flujo: una comparación entre dos protocolos de aislamiento de monocitos

La diferenciación de los adipocitos blancos y beiges de tejido adiposo vascular progenitores tiene potencial para mejoramiento metabólico en obesidad. Se describen los protocolos para un CD34 + CD31 + aislamiento de células endoteliales de la grasa humana y un posterior en vitro expansión y diferenciación a adipocitos blancos y beiges. Se discuten varias aplicaciones posteriores.

Aislamiento, expansión y Adipogenic inducción de CD31 + CD34 + células endoteliales del humano omentales y subcutáneos de tejido adiposo

Aquí presentamos un protocolo para la caracterización de subconjuntos de monocitos por citometría de flujo de sangre. Esto incluye delineando cómo los subconjuntos de la puerta y evaluar su expresión de marcadores de superficie y dando un ejemplo de la evaluación de la expresión de marcadores de M2 (antiinflamatorio) y M1 (inflamatoria).

Caracterización de subconjuntos de monocitos humanos de sangre análisis de citometría de flujo

Se describe un modelo animal simple y confiable para la esteatohepatitis no alcohólica inducida por la dieta, que se logra a través de la carcasa no SPF de los animales y la administración de una dieta alta en grasas específica. Describimos la identificación de los subconjuntos de células inmunes hepáticas y adiposas para recapitular las condiciones inmunológicas humanas exponiendo ratones a gérmenes ambientales.

Un modelo murino avanzado para esteatohepatitis no alcohólica en asociación con diabetes tipo 2

Aquí, presentamos microfragmentación libre de enzimas del tejido adiposo humano utilizando un dispositivo de sistema cerrado. Este nuevo método permite la obtención de racimos submilimétricos de tejido adiposo adecuado para el trasplante in vivo, el cultivo in vitro y el aislamiento y caracterización celular adicional.

Microfragmentación de tejido adiposo humano para fenotipado celular y caracterización de secretos

Este protocolo describe el enfoque técnico para aislar subpoblaciones de células estromales adipogénicas y fibroinflamatorias de depósitos murinos de tejido adiposo blanco intraabdominal (WAT) mediante clasificación celular activada por fluorescencia o separación inmunomagnética de perlas.

Aislamiento de subpoblaciones de células estromales adipogénicas y fibroinflamatorias de depósitos adiposos intraabdominales murinos

El aislamiento de células de implantes disecados y su caracterización por citometría de flujo puede contribuir significativamente a la comprensión del patrón de respuesta inmune contra implantes. En este trabajo se describe un método preciso para el aislamiento de células de implantes disecados y su tinción para el análisis citométrico de flujo.

Citometría de flujo de alta dimensionalidad para el análisis de la función inmunitaria de tejidos de implantes disecados

Este protocolo proporciona un método eficiente de digestión de colagenasas para el aislamiento de adipocitos viables y células de la fracción vascular estromal-SVF de grasa visceral humana en un solo proceso, incluida la metodología para obtener ARN de alta calidad de los adipocitos y la fenotipificación de los macrófagos SVF mediante la tinción de múltiples marcadores unidos a la membrana para su análisis por citometría de flujo.

Aislamiento de adipocitos viables y fracción vascular estromal a partir de tejido adiposo visceral humano adecuado para análisis de ARN y fenotipado de macrófagos

En este estudio, presentamos un protocolo eficaz y reproducible para aislar las poblaciones inmunes del sistema respiratorio murino. También proporcionamos un método para la identificación de todas las células inmunes innatas y adaptativas que residen en los pulmones de ratones sanos, utilizando un panel de citometría de flujo basado en 9 colores.

Análisis citométrico de flujo para la identificación de las células inmunes innatas y adaptativas del pulmón murino

Aquí, describimos un protocolo para aislar, cultivar y fenotipar células endoteliales microvasculares a partir de tejido adiposo subcutáneo humano (hSATMVECs). Además, describimos un modelo experimental de diafonía entre hSATMVEC y adipocitos.

Estudio de la diafonía entre células endoteliales adiposas y adipocitos en el tejido adiposo subcutáneo humano

Aprende a caracterizar células inmunes en tejido adiposo humano mediante citometría de flujo. Este protocolo permite identificar y cuantificar macrófagos, células T, B y NK en la fracción vascular estromal para investigar inflamación metabólica.

Caracterización de células inmunes en el tejido adiposo humano mediante el uso de citometría de flujo

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