Flujo de trabajo de proteómica cuantitativa sin etiquetas para interacciones host-patógenos impulsadas por el descubrimiento

Aquí, presentamos un protocolo para perfilar la interacción entre el huésped y el patógeno durante la infección por proteómica basada en espectrometría de masas. Este protocolo utiliza la cuantificación libre de etiquetas para medir los cambios en la abundancia de proteínas tanto del huésped (por ejemplo, macrófagos) como del patógeno (por ejemplo, Cryptococcus neoformans)en un solo experimento.

Nuestro protocolo investiga la infección fúngica desde la perspectiva del huésped y del patógeno para identificar las interacciones entre los sistemas biológicos que son críticos para una enfermedad. Podemos detectar proteínas fúngicas y del huésped en un solo experimento e identificar proteínas fúngicas que solo se producen durante la infección, lo que representa nuevas proteínas asociadas a la infección. Aunque nos centramos en el tratamiento de las infecciones fúngicas mediante el descubrimiento de nuevas estrategias antivirulentas para el tratamiento, nuestra cartera de productos proteómicos y bioinformáticos es universal y podría aplicarse a muchos sistemas biológicos.

Nuestro enfoque sienta las bases para estudios de diferentes patógenos y numerosas respuestas inmunitarias, y puede utilizarse para proporcionar nuevos conocimientos sobre la relación entre los criptococos y el sistema inmunitario innato. La respuesta de los macrófagos a los patógenos y la detección de suficientes proteínas fúngicas son importantes. Por lo tanto, se recomienda probar y optimizar los MOI y los puntos de tiempo para cada especie.

Dado que el cultivo de macrófagos y células fúngicas puede ser un desafío, es importante saber qué esperar después del cocultivo. La visualización proporciona al investigador confianza en la implementación del procedimiento. Para preparar las células fúngicas para una infección por macrófagos, recoja y centrifugue las células de C neoformans de un cultivo de fase media a larga, seguido de tres lavados suaves con un mililitro de PBS a temperatura ambiente en las mismas condiciones de centrífuga.

Después del último lavado, vuelva a suspender las células fúngicas a una concentración media de 1,2 veces 10 a la octava célula por mililitro de cultivo celular libre de antibióticos y agregue un mililitro de suspensión de células fúngicas a cada uno de los cuatro pocillos de una placa de cultivo de macrófagos de seis pocillos confluente del 70% al 80%. Luego, coloque la placa en la incubadora de cultivos celulares durante tres horas. Incline con cuidado la placa para permitir que cada pocillo se lave suavemente tres veces con un mililitro de PBS por pocillo por lavado.

Para medir la capacidad de infección después del último lavado, agregue un mililitro de medio libre de antibióticos a cada pocillo de la placa de seis pocillos y coloque la placa en la incubadora de cultivo celular. En los puntos de tiempo experimentales apropiados, recoja el sobrenadante de cada pocillo y mida la cantidad de LDH en cada pocillo de acuerdo con los protocolos estándar. En los mismos puntos de tiempo, lisar las células de macrófagos no infectadas para determinar el valor de citotoxicidad máxima.

A continuación, se puede calcular la citotoxicidad utilizando la fórmula indicada. Para la recolección y el cocultivo de macrófagos no infectados, agregue un mililitro de PBS frío a cada pocillo de macrófagos no infectados. Después de un minuto, golpee suavemente la placa para separar las celdas del fondo de los pocillos y agrupar las suspensiones de celdas en un solo tubo de 15 mililitros.

Recoja las células por centrifugación y elimine completamente el sobrenadante para permitir la congelación instantánea inmediata del pellet en nitrógeno líquido para un almacenamiento de menos 80 grados. El análisis de componentes principales del proceso a los conjuntos de datos revela que, como se esperaba, el mayor componente de la separación entre los datos son las muestras infectadas frente a las no infectadas. La segunda característica distintiva de las muestras es su variabilidad biológica.

La combinación de una correlación de Pearson con un agrupamiento jerárquico por distancia euclidiana muestra un agrupamiento distinto de muestras infectadas frente a no infectadas con una reproducibilidad replicada que oscila entre el 95% y el 96%. En este análisis, se identificaron 117 proteínas del huésped que demostraron un cambio significativo en la expresión tras la infección. En particular, también se observaron aumentos significativos en la abundancia de proteínas fúngicas, como se esperaba durante la infección.

Es importante manipular los macrófagos con cuidado durante la coculturización, el lavado y la recolección de muestras. Al definir cómo se adapta el patógeno al huésped y cómo el huésped se defiende de la infección, se adquieren nuevos conocimientos en los campos de la microbiología y la inmunología.