Flujo de trabajo de proteómica cuantitativa sin etiquetas para interacciones host-patógenos impulsadas por el descubrimiento
October 20th, 2020
Aquí, presentamos un protocolo para perfilar la interacción entre el huésped y el patógeno durante la infección por proteómica basada en espectrometría de masas. Este protocolo utiliza la cuantificación libre de etiquetas para medir los cambios en la abundancia de proteínas tanto del huésped (por ejemplo, macrófagos) como del patógeno (por ejemplo, Cryptococcus neoformans)en un solo experimento.
Nuestro protocolo investiga la infección fúngica desde la perspectiva del huésped y del patógeno para identificar las interacciones entre los sistemas biológicos que son críticos para una enfermedad. Podemos detectar proteínas fúngicas y del huésped en un solo experimento e identificar proteínas fúngicas que solo se producen durante la infección, lo que representa nuevas proteínas asociadas a la infección. Aunque nos centramos en el tratamiento de las infecciones fúngicas mediante el descubrimiento de nuevas estrategias antivirulentas para el tratamiento, nuestra cartera de productos proteómicos y bioinformáticos es universal y podría aplicarse a muchos sistemas biológicos.
Nuestro enfoque sienta las bases para estudios de diferentes patógenos y numerosas respuestas inmunitarias, y puede utilizarse para proporcionar nuevos conocimientos sobre la relación entre los criptococos y el sistema inmunitario innato. La respuesta de los macrófagos a los patógenos y la detección de suficientes proteínas fúngicas son importantes. Por lo tanto, se recomienda probar y optimizar los MOI y los puntos de tiempo para cada especie.
Dado que el cultivo de macrófagos y células fúngicas puede ser un desafío, es importante saber qué esperar después del cocultivo. La visualización proporciona al investigador confianza en la implementación del procedimiento. Para preparar las células fúngicas para una infección por macrófagos, recoja y centrifugue las células de C neoformans de un cultivo de fase media a larga, seguido de tres lavados suaves con un mililitro de PBS a temperatura ambiente en las mismas condiciones de centrífuga.
Después del último lavado, vuelva a suspender las células fúngicas a una concentración media de 1,2 veces 10 a la octava célula por mililitro de cultivo celular libre de antibióticos y agregue un mililitro de suspensión de células fúngicas a cada uno de los cuatro pocillos de una placa de cultivo de macrófagos de seis pocillos confluente del 70% al 80%. Luego, coloque la placa en la incubadora de cultivos celulares durante tres horas. Incline con cuidado la placa para permitir que cada pocillo se lave suavemente tres veces con un mililitro de PBS por pocillo por lavado.
Para medir la capacidad de infección después del último lavado, agregue un mililitro de medio libre de antibióticos a cada pocillo de la placa de seis pocillos y coloque la placa en la incubadora de cultivo celular. En los puntos de tiempo experimentales apropiados, recoja el sobrenadante de cada pocillo y mida la cantidad de LDH en cada pocillo de acuerdo con los protocolos estándar. En los mismos puntos de tiempo, lisar las células de macrófagos no infectadas para determinar el valor de citotoxicidad máxima.
A continuación, se puede calcular la citotoxicidad utilizando la fórmula indicada. Para la recolección y el cocultivo de macrófagos no infectados, agregue un mililitro de PBS frío a cada pocillo de macrófagos no infectados. Después de un minuto, golpee suavemente la placa para separar las celdas del fondo de los pocillos y agrupar las suspensiones de celdas en un solo tubo de 15 mililitros.
Recoja las células por centrifugación y elimine completamente el sobrenadante para permitir la congelación instantánea inmediata del pellet en nitrógeno líquido para un almacenamiento de menos 80 grados. El análisis de componentes principales del proceso a los conjuntos de datos revela que, como se esperaba, el mayor componente de la separación entre los datos son las muestras infectadas frente a las no infectadas. La segunda característica distintiva de las muestras es su variabilidad biológica.
La combinación de una correlación de Pearson con un agrupamiento jerárquico por distancia euclidiana muestra un agrupamiento distinto de muestras infectadas frente a no infectadas con una reproducibilidad replicada que oscila entre el 95% y el 96%. En este análisis, se identificaron 117 proteínas del huésped que demostraron un cambio significativo en la expresión tras la infección. En particular, también se observaron aumentos significativos en la abundancia de proteínas fúngicas, como se esperaba durante la infección.
Es importante manipular los macrófagos con cuidado durante la coculturización, el lavado y la recolección de muestras. Al definir cómo se adapta el patógeno al huésped y cómo el huésped se defiende de la infección, se adquieren nuevos conocimientos en los campos de la microbiología y la inmunología.
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Visión general
Este protocolo investiga la interacción entre el huésped y el patógeno durante la infección fúngica utilizando proteómica basada en espectrometría de masas. Permite la detección de proteínas tanto del huésped como del patógeno en un solo experimento, proporcionando información sobre las proteínas asociadas a la infección.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Enfermedad infecciosa
- Proteómica
Antecedentes
- Entender las interacciones huésped-patógeno es crucial para la investigación de enfermedades.
- Las infecciones fúngicas representan riesgos significativos para la salud, lo que requiere nuevas estrategias de tratamiento.
- La proteómica puede revelar cambios en la abundancia de proteínas durante la infección.
- Los macrófagos juegan un papel clave en la respuesta inmune a los patógenos.
Propósito del estudio
- Perfilizar las interacciones entre los macrófagos del huésped y el patógeno Cryptococcus neoformans.
- Identificar nuevas proteínas asociadas a la infección producidas durante la infección fúngica.
- Establecer un pipeline de proteómica y bioinformática universal aplicable a varios sistemas biológicos.
Métodos utilizados
- Proteómica basada en espectrometría de masas para la detección de proteínas.
- Cuantificación sin etiqueta para medir los cambios en la abundancia de proteínas.
- Optimización de la multiplicidad de infección (MOI) y los puntos temporales para obtener resultados precisos.
- Análisis bioinformático para interpretar los datos proteómicos.
Principales resultados
- Identificación de proteínas fúngicas producidas específicamente durante la infección.
- Insitios sobre la respuesta macrofágica a Cryptococcus neoformans.
- Establecimiento de un marco para estudiar varios patógenos y respuestas inmunes.
- Demostración de la aplicabilidad del protocolo a diferentes sistemas biológicos.
Conclusiones
- El protocolo proporciona un enfoque integral para estudiar las interacciones huésped-patógeno.
- Senta las bases para futuras investigaciones sobre infecciones fúngicas y respuestas inmunes.
- Se recomienda una mayor optimización de las condiciones experimentales para diferentes especies.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This label-free quantitative proteomics workflow enables simultaneous profiling of host and pathogen proteomes during infection, providing unbiased protein abundance data critical for target validation in infectious disease research. By identifying infection-associated fungal proteins and host response signatures, the method supports mechanistic de-risking of anti-virulence strategies and informs preclinical target selection. Its transferability across host-pathogen systems enhances portfolio-wide applicability for antifungal and immunomodulatory discovery programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by identifying pathogen proteins exclusively produced during infection, representing novel virulence-associated targets.
- Scientific Value: Clarifies host-pathogen interaction pathways through correlated abundance changes in both proteomes, supporting functional target validation.
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing quantitative, reproducible infection-state proteomic profiles for de-risking target hypotheses.
Screening & Assay Development
- Operational Value: Prepares validated biological systems (infected macrophages) for downstream assay development with standardized infection conditions and MOI optimization.
- Operational Value: Generates quantitative, label-free proteomic outputs suitable for assay standardization and reproducibility assessment in screening campaigns.
- Operational Value: Supports scalable platform reuse across diverse pathogens due to the universal proteomics and bioinformatics pipeline design.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Identifies disease-relevant host proteins responding to microbial invasion, enabling biomarker alignment for preclinical validation.
- Translational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical work by linking infection-state proteomic shifts to pathogenic mechanisms.
- Translational Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by highlighting proteins essential for virulence and host defense mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
The workflow integrates into early discovery biology through host-pathogen interaction profiling, supports screening readiness via standardized infection models, and enables translational research by connecting proteomic changes to virulence and immune response mechanisms.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying infection-induced changes in both pathogen and host proteomes.
- Screening: Delivers assay-ready biological systems with optimized MOI and time points, ensuring reproducible infection models for compound evaluation.
- Analytics: Provides label-free quantitative measurements and statistical outputs (e.g., Benjamini-Hochberg corrected t-tests) to compare conditions and identify significantly altered proteins.
- Translational Research: Links proteomic signatures to pathogenic mechanisms and host defense responses, supporting biomarker discovery and preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable proteomics and bioinformatics pipeline applicable to multiple pathogens and immune systems, reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation through unbiased, quantitative infection-state proteomic profiling.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via optimized coculture, washing, and lysis protocols with validated QC metrics (PCA, clustering, 95-96% replicate reproducibility).
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by revealing critical virulence factors and host response networks, reducing late-stage biological risk in antifungal programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on infection-specific protein expression and pathway involvement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian and fungal cell culture, proteomics sample preparation, and mass spectrometry data analysis.
- Dependent on access to LC-MS/MS instrumentation, label-free quantification software, and bioinformatics tools for PCA, clustering, and differential expression analysis.
- Necessitates cross-team standardization of infection parameters (MOI, time points) and sample handling to ensure reproducibility across studies.
- Involves adaptation considerations for different pathogen-host systems, including optimization of fungal cell preparation and macrophage confluency.
- Practical limitations include the technical challenge of detecting low-abundance fungal proteins amid high background host signals, requiring sufficient infection depth and sensitivity.
