Flujo de trabajo de proteómica cuantitativa sin etiquetas para interacciones host-patógenos impulsadas por el descubrimiento
20 de octubre de 2020
Aquí, presentamos un protocolo para perfilar la interacción entre el huésped y el patógeno durante la infección por proteómica basada en espectrometría de masas. Este protocolo utiliza la cuantificación libre de etiquetas para medir los cambios en la abundancia de proteínas tanto del huésped (por ejemplo, macrófagos) como del patógeno (por ejemplo, Cryptococcus neoformans)en un solo experimento.
Nuestro protocolo investiga la infección fúngica desde la perspectiva del huésped y del patógeno para identificar las interacciones entre los sistemas biológicos que son críticos para una enfermedad. Podemos detectar proteínas fúngicas y del huésped en un solo experimento e identificar proteínas fúngicas que solo se producen durante la infección, lo que representa nuevas proteínas asociadas a la infección. Aunque nos centramos en el tratamiento de las infecciones fúngicas mediante el descubrimiento de nuevas estrategias antivirulentas para el tratamiento, nuestra cartera de productos proteómicos y bioinformáticos es universal y podría aplicarse a muchos sistemas biológicos.
Nuestro enfoque sienta las bases para estudios de diferentes patógenos y numerosas respuestas inmunitarias, y puede utilizarse para proporcionar nuevos conocimientos sobre la relación entre los criptococos y el sistema inmunitario innato. La respuesta de los macrófagos a los patógenos y la detección de suficientes proteínas fúngicas son importantes. Por lo tanto, se recomienda probar y optimizar los MOI y los puntos de tiempo para cada especie.
Dado que el cultivo de macrófagos y células fúngicas puede ser un desafío, es importante saber qué esperar después del cocultivo. La visualización proporciona al investigador confianza en la implementación del procedimiento. Para preparar las células fúngicas para una infección por macrófagos, recoja y centrifugue las células de C neoformans de un cultivo de fase media a larga, seguido de tres lavados suaves con un mililitro de PBS a temperatura ambiente en las mismas condiciones de centrífuga.
Después del último lavado, vuelva a suspender las células fúngicas a una concentración media de 1,2 veces 10 a la octava célula por mililitro de cultivo celular libre de antibióticos y agregue un mililitro de suspensión de células fúngicas a cada uno de los cuatro pocillos de una placa de cultivo de macrófagos de seis pocillos confluente del 70% al 80%. Luego, coloque la placa en la incubadora de cultivos celulares durante tres horas. Incline con cuidado la placa para permitir que cada pocillo se lave suavemente tres veces con un mililitro de PBS por pocillo por lavado.
Para medir la capacidad de infección después del último lavado, agregue un mililitro de medio libre de antibióticos a cada pocillo de la placa de seis pocillos y coloque la placa en la incubadora de cultivo celular. En los puntos de tiempo experimentales apropiados, recoja el sobrenadante de cada pocillo y mida la cantidad de LDH en cada pocillo de acuerdo con los protocolos estándar. En los mismos puntos de tiempo, lisar las células de macrófagos no infectadas para determinar el valor de citotoxicidad máxima.
A continuación, se puede calcular la citotoxicidad utilizando la fórmula indicada. Para la recolección y el cocultivo de macrófagos no infectados, agregue un mililitro de PBS frío a cada pocillo de macrófagos no infectados. Después de un minuto, golpee suavemente la placa para separar las celdas del fondo de los pocillos y agrupar las suspensiones de celdas en un solo tubo de 15 mililitros.
Recoja las células por centrifugación y elimine completamente el sobrenadante para permitir la congelación instantánea inmediata del pellet en nitrógeno líquido para un almacenamiento de menos 80 grados. El análisis de componentes principales del proceso a los conjuntos de datos revela que, como se esperaba, el mayor componente de la separación entre los datos son las muestras infectadas frente a las no infectadas. La segunda característica distintiva de las muestras es su variabilidad biológica.
La combinación de una correlación de Pearson con un agrupamiento jerárquico por distancia euclidiana muestra un agrupamiento distinto de muestras infectadas frente a no infectadas con una reproducibilidad replicada que oscila entre el 95% y el 96%. En este análisis, se identificaron 117 proteínas del huésped que demostraron un cambio significativo en la expresión tras la infección. En particular, también se observaron aumentos significativos en la abundancia de proteínas fúngicas, como se esperaba durante la infección.
Es importante manipular los macrófagos con cuidado durante la coculturización, el lavado y la recolección de muestras. Al definir cómo se adapta el patógeno al huésped y cómo el huésped se defiende de la infección, se adquieren nuevos conocimientos en los campos de la microbiología y la inmunología.
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Descripción general
Este protocolo investiga la interacción entre el huésped y el patógeno durante la infección fúngica mediante proteómica basada en espectrometría de masas. Permite la detección de proteínas tanto del huésped como del patógeno en un único experimento, proporcionando información sobre las proteínas asociadas a la infección.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Enfermedad infecciosa
- Proteómica
Antecedentes
- Comprender las interacciones entre el huésped y el patógeno es fundamental para la investigación de enfermedades.
- Las infecciones fúngicas representan riesgos significativos para la salud, lo que requiere estrategias novedosas de tratamiento.
- La proteómica puede revelar cambios en la abundancia de proteínas durante la infección.
- Los macrófagos desempeñan un papel clave en la respuesta inmunitaria frente a los patógenos.
Objetivo del estudio
- Caracterizar las interacciones entre los macrófagos del huésped y el patógeno Cryptococcus neoformans.
- Identificar nuevas proteínas asociadas a la infección producidas durante la infección fúngica.
- Establecer una metodología universal de proteómica y bioinformática aplicable a diversos sistemas biológicos.
Métodos Utilizados
- Proteómica basada en espectrometría de masas para la detección de proteínas.
- Cuantificación sin marca para medir cambios en la abundancia de proteínas.
- Optimización de la multiplicidad de infección (MOI) y puntos temporales para obtener resultados precisos.
- Análisis bioinformático para interpretar los datos proteómicos.
Resultados principales
- Identificación de proteínas fúngicas producidas específicamente durante la infección.
- Conocimientos sobre la respuesta del macrófago a Cryptococcus neoformans.
- Establecimiento de un marco para estudiar diversos patógenos y respuestas inmunitarias.
- Demuestra la aplicabilidad del protocolo a diferentes sistemas biológicos.
Conclusiones
- El protocolo proporciona un enfoque integral para estudiar las interacciones entre el huésped y el patógeno.
- Establece las bases para futuras investigaciones sobre infecciones fúngicas y respuestas inmunitarias.
- Se recomienda una mayor optimización de las condiciones experimentales para diferentes especies.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este flujo de trabajo de proteómica cuantitativa sin marcado permite el perfilado simultáneo de los proteomas del huésped y del patógeno durante la infección, proporcionando datos imparciales sobre la abundancia de proteínas, cruciales para la validación de dianas en la investigación de enfermedades infecciosas. Al identificar proteínas fúngicas asociadas a la infección y firmas de la respuesta del huésped, el método apoya la reducción mecanicista de riesgos en estrategias anti-virulencia e informa la selección preclínica de dianas. Su transferibilidad entre sistemas huésped-patógeno mejora la aplicabilidad general en programas de descubrimiento de antifúngicos y moduladores inmunitarios.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la identificación de proteínas del patógeno producidas exclusivamente durante la infección, que representan dianas novedosas asociadas a la virulencia.
- Valor científico: Clarifica las vías de interacción entre huésped y patógeno mediante cambios correlacionados en la abundancia de ambas proteomas, lo que apoya la validación funcional de dianas.
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al proporcionar perfiles proteómicos cuantitativos y reproducibles del estado de infección, para disminuir el riesgo en las hipótesis sobre dianas.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor Operativo: Prepara sistemas biológicos validados (macrófagos infectados) para el desarrollo de ensayos posteriores, con condiciones de infección estandarizadas y optimización de la MOI.
- Valor Operativo: Genera resultados proteómicos cuantitativos y libres de marcadores, adecuados para la estandarización de ensayos y la evaluación de la reproducibilidad en campañas de cribado.
- Valor Operativo: Permite la reutilización escalable de la plataforma en distintos patógenos gracias al diseño universal de la tubería proteómica y bioinformática.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor traslacional: Identifica proteínas del huésped relevantes para la enfermedad que responden a la invasión microbiana, permitiendo la alineación de biomarcadores para la validación preclínica.
- Valor traslacional: Asegura la continuidad desde el descubrimiento hasta el trabajo preclínico al vincular los cambios proteómicos asociados al estado de infección con los mecanismos patogénicos.
- Valor traslacional: Orienta decisiones de avance ajustadas al riesgo al destacar las proteínas esenciales para la virulencia y los mecanismos de defensa del huésped.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El flujo de trabajo se integra en la biología de descubrimiento temprano mediante el perfilado de interacciones huésped-patógeno, apoya la preparación para cribados a través de modelos de infección estandarizados y posibilita la investigación traslacional al conectar los cambios proteómicos con mecanismos de virulencia y respuesta inmunitaria.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la verificación de hipótesis y la aclaración de vías al cuantificar los cambios inducidos por la infección en los proteomas del patógeno y del huésped.
- Selección: Ofrece sistemas biológicos listos para ensayos con una MOI y puntos temporales optimizados, asegurando modelos de infección reproducibles para la evaluación de compuestos.
- Análisis: Proporciona mediciones cuantitativas sin marcadores y resultados estadísticos (por ejemplo, pruebas t corregidas por Benjamini-Hochberg) para comparar condiciones e identificar proteínas significativamente alteradas.
- Investigación Traducional: Relaciona las firmas proteómicas con mecanismos patógenos y respuestas de defensa del huésped, apoyando el descubrimiento de biomarcadores y la continuidad preclínica.
- Reutilización Empresarial: Establece una tubería reutilizable de proteómica y bioinformática aplicable a múltiples patógenos y sistemas inmunitarios, reduciendo el desarrollo metodológico redundante.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos mediante un perfilado proteómico cuantitativo e imparcial según el estado de infección.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y la estandarización mediante protocolos optimizados de cocultivo, lavado y lisis, con métricas de control de calidad validadas (ACP, agrupamiento, reproducibilidad del 95-96 % en réplicas).
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al revelar factores de virulencia críticos y redes de respuesta del huésped, reduciendo el riesgo biológico en fases avanzadas de los programas antifúngicos.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de objetivos basada en la expresión proteica específica de la infección y en la participación en vías metabólicas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo celular de mamíferos y hongos, preparación de muestras para proteómica y análisis de datos de espectrometría de masas.
- Depende del acceso a instrumentación LC-MS/MS, software de cuantificación sin marcaje y herramientas bioinformáticas para análisis de PCA, agrupamiento y expresión diferencial.
- Necesita estandarización entre equipos de los parámetros de infección (MOI, puntos de tiempo) y manejo de muestras para garantizar la reproducibilidad entre estudios.
- Implica consideraciones de adaptación para distintos sistemas patógeno-huésped, incluida la optimización de la preparación de células fúngicas y la confluencia de macrófagos.
- Las limitaciones prácticas incluyen la dificultad técnica para detectar proteínas fúngicas de baja abundancia en medio de señales de fondo altas del huésped, lo que requiere una profundidad de infección y sensibilidad suficientes.
