Un enfoque comparativo para caracterizar el paisaje del Huésped-Patógeno interacciones proteína-proteína

El objetivo general del siguiente experimento es realizar estudios ectomicos para comparar los perfiles de interacción de proteínas de diferentes variantes de patógenos con un conjunto común de factores celulares. Esto se logra mediante el apareamiento de levaduras basadas en dos cribados híbridos de CDNA para identificar posibles socios que interactúan con proteínas de diferentes variantes de patógenos. Como segundo paso, los marcos de lectura abiertos de los socios que interactúan se secuencian y se transfieren a vectores compatibles para su posterior validación.

A continuación, se selecciona un conjunto de parejas individuales que emergen de los dos cribados híbridos y se vuelve a probar su interacción con la gama completa de cepas estudiadas. Esto se realiza mediante un ensayo ortogonal de complementación de fragmentos de proteínas basado en luciferasa realizado en células de mamíferos con el fin de proporcionar conjuntos de datos de interacción comparativa sólidos. Los resultados muestran diferentes intensidades de interacción entre las proteínas del patógeno y las proteínas celulares en función de las medidas de luciferasa obtenidas y, por lo tanto, proporcionan una visión comparativa de las interacciones entre las proteínas de la proteína del huésped patógeno.

El procesamiento de los perfiles de interacción mediante agrupamiento jerárquico correlaciona las interacciones entre patógenos específicos del huésped y los rasgos patológicos y proporciona información sobre la participación de las proteínas patógenas en la patogénesis. La principal ventaja de este enfoque sobre otros métodos de mapeo de las interacciones entre proteínas y proteínas del huésped patógeno es que proporciona un conjunto de datos de interacción comparativa estricto entre múltiples variantes de cepas. Estas técnicas proporcionan información sobre la red de interacción de una proteína patógena, pero también se puede aplicar a otros sistemas como una molécula infecciosa utilizando virus completos y genética de ríos, por ejemplo, Comience este protocolo con el apareamiento y la propagación de las células de levadura como se describe en la semilla del protocolo escrito.

30 mililitros de medio de abandono selectivo sin triptófano con pocas colonias de cepa de levadura AH 1 0 9 transformada con el plásmido P-G-B-K-T siete que expresa la proteína patógena. Incubar 30 horas a 30 grados centígrados con rotación. Siguiente semilla, 200 mililitros de medio de abandono selectivo menos triptófano con los 30 mililitros del AH 1 0 9.

Los cultivos se incuban con rotación durante 20 horas a 30 grados centígrados. Además, incubar la biblioteca CDNA transformó Y 187 en 20 mililitros de pegamento YP durante 10 minutos a 30 grados centígrados con rotación. A continuación, centrifugar un volumen de cultivo PG BK T 7 AH 109 transformado correspondiente a una cantidad equivalente de células de levadura Y 187 viables durante cinco minutos a 3.500 RPM y 20 grados Celsius.

Retirar con cuidado el sobrenadante y Resus suspender el paladar en 10 mililitros de cola YP. Mezcle la levadura AH 109 resuspendida con la biblioteca contenedora Y 187. Transfiera a un tubo de 50 mililitros antes de centrifugar durante cinco minutos a 3, 500 RPM y 20 grados Celsius.

Después de retirar con cuidado el super dat Resus, suspenda la bolita en pegamento YP para obtener un total de 1,5 mililitros. A continuación, esparce la levadura en tres placas de agar YCM, de 150 milímetros a 0,5 mililitros por placa e incuba 4,5 horas a 30 grados centígrados. Recoja la levadura apareada de las placas YCM raspando con un vaso de rastrillo 10 mililitros de medio de abandono selectivo menos leucina, triptófano e histidina.

Enjuague la placa dos veces con cinco mililitros del mismo medio y acumule después de la centrifugación durante cinco minutos a 3, 500 RPM y 20 grados centígrados. Deseche el sobrenadante y el reus. Suspender el pellet de levadura en cinco mililitros de medio de abandono selectivo menos leucina, triptófano e histidina.

A continuación, extienda la levadura apareada en 10 placas de agar de abandono selectivo sin leucina, triptófano e histamina suplementadas con la concentración adecuada de tres aminotriazol o tres al según lo determinado en la prueba de autoactivación. Calcule la tasa diploide como se describe en el protocolo escrito después de incubar a 30 grados centígrados en una atmósfera humidificada durante seis a 10 días. Elija las colonias de levadura y transfiéralas a platos preparados frescos a partir de agar de abandono selectivo menos leucina, triptófano e histidina más tres a t.

Ordene la levadura en un esquema de ocho carriles de 12 pocillos reproduciendo una placa de 96 pocillos para que luego sea más fácil de secuenciar. Deje que las colonias de levadura crezcan durante cuatro o cinco días a 30 grados centígrados en una atmósfera humidificada. El objetivo de esta sección es PCR, amplificar el CDNA contenido en el PA ct dos vectores de colonias de levadura lisada cultivadas en agar abandono selectivo menos placas de leucina, triptófano e histidina.

Comience colocando una placa de PCR de 96 pocillos en hielo para licitar las células de levadura a 50 microlitros por pocillo de solución xmal 20 T. Vuelva a suspender suavemente una colonia por pocillo. Incubar la placa 15 minutos a 37 grados centígrados y 15 minutos a 95 grados centígrados.

Después de volver a colocar la placa en hielo, agregue 50 microlitros de agua destilada por mezcla de pocillo pipeteando hacia arriba y hacia abajo, y proceda a centrifugar durante cinco minutos a 3, 500 RPM y cuatro grados Celsius. Después de preparar la mezcla de tachuelas X como se describe en el protocolo de texto, distribuya 40 microlitros de la mezcla por pocillo en la placa de PCR de 96 pocillos. Agregue 10 microlitros de la levadura lisada por pocillo y realice la amplificación como se indica en el protocolo de texto.

Ejecute tres microlitros de los productos de PCR en un gel de agros al 1,2% para detectar clones positivos para PCR. Secuenciar los fragmentos amplificados por PCR aislados de sus tres clones positivos. A continuación, realice un análisis de voladura para identificar los marcos de lectura abiertos celulares, descartando las alineaciones de baja confianza, así como el cambio de marco y el código de parada prematuro en las secuencias contenedoras antes de la transfección celular.

Transfiera la proteína patógena y la proteína celular a sus respectivos vectores para generar proteínas fusionadas a fragmentos de la luciferasa Gaia como se detalla en el protocolo de texto semilla 2 9 3 células T a 350.000 células por mililitro de DMEM con 10% de suero bovino fetal sin antibiótico. Distribuir 100 microlitros por pocillo en placas de cultivo blancas estériles antes de cultivar durante 24 horas a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono al día siguiente. Las células transfectadas que utilizan cualquier protocolo de transfección adecuado, utilizan 100 nanogramos por pocillo de construcciones de plásmido de marco de lectura abierto tanto del patógeno como del huésped, transfectan 10 nanogramos por pocillo de plásmido luciferasa de luciferasa de luciérnaga CMV para normalizar la eficiencia de la transfección.

Cada punto se prueba en una mezcla de transfección de transferencia por triplicado a las placas de células T 2 9 3 cultivadas. Tenga cuidado de depositar suavemente la mezcla de ADN en las células, ya que las células T 2 9 3 no son muy adherentes y se desprenden fácilmente del fondo del pocillo, incube en una incubadora de cultivo celular durante 24 a 30 horas a 37 grados centígrados con dióxido de carbono al 5%, lave las células con PBS a 100 microlitros por pocillo. Agregue 40 microlitros de una x lisis de vainilla, tampón e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Bajo agitación, guarde 10 microlitros de lisados celulares en otra placa blanca para la dosificación posterior de la luciferasa de luciferasa de luciérnaga almacenada a cuatro grados centígrados o, alternativamente, a menos 20 grados centígrados con techo para medir la actividad de Gaia. Coloque la placa en un luminómetro e inyecte 100 microlitros de reactivo de ensayo de luciferasa de vainilla en los lisados celulares. A continuación, cuente la luminiscencia durante 10 segundos.

La dosificación de una placa de 96 pocillos tarda aproximadamente media hora. Utilice siempre extractos frescos, ya que la congelación o el almacenamiento a largo plazo pueden afectar a la actividad de Gaia mediada por la interacción en los 10 extractos de células de microlitros restantes. Inyecte 50 microlitros de reactivo de ensayo de luciferasa de luciferasa de luciérnaga en lisados celulares utilizando un luminómetro y contando la luminiscencia durante 10 segundos.

La dosificación de una placa de 96 pocillos tarda aproximadamente media hora para cada interacción. Calcule la relación entre la actividad de la luciferasa Gaia y la actividad de la luciferasa de luciérnaga para obtener un valor de luminiscencia GAIA normalizado. Teniendo en cuenta la eficiencia de la transfección y la viabilidad celular.

Calcule la media de los triplicados para monitorizar la interacción. Estime una relación de luminiscencia normalizada o NLR para cada par de huéspedes patógenos. Para ello, divida la actividad de luminiscencia GAIA normalizada detectada en presencia de proteínas tanto del patógeno como del huésped por la suma de las actividades medidas en los pozos de control.

En un estudio anterior, se ha estimado que el valor de corte de NLR para interacciones positivas es de alrededor de 3,5. Una de las principales fortalezas de los preceptos de GIA de alto rendimiento, el ensayo de complementación de proteínas, o H-T-G-P-C-A radica en su alta sensibilidad, como lo ilustra la evaluación de las tasas de falsos positivos y falsos negativos para la proteína HPVE dos para determinar la tasa de falsos negativos. Las interacciones conocidas de E dos del VPH 16 se evaluaron mediante H-T-G-P-C-A, cuatro de las 18 interacciones no se recuperaron, lo que corresponde a una tasa de falsos negativos del 22%.

Se midió que las interacciones de falsos positivos fueron del 5,8% utilizando 12 proteínas HPVE dos contra un conjunto aleatorio de proteínas celulares. La fuerte especificidad del método se destaca en esta figura que muestra que una mutación puntual de un solo punto que se sabe que interfiere con la unión de E dos a su compañera celular BRD cuatro aniquila, la relación NLR. Este enfoque ectómico comparativo a gran escala se ha aplicado recientemente con éxito a tres proteínas tempranas de los virus del papiloma humano, E dos, E seis y E siete, originarias de diferentes genotipos, representativas de su diversidad natural en tropismos y patologías para cada una de las proteínas tempranas.

La agrupación jerárquica de los perfiles de interacción, en su mayoría, recapitula la filogenia del VPH, lo que demuestra la solidez del enfoque y la pureza de los conjuntos de datos de interacción. Se puede utilizar para correlacionar perfiles específicos de interacción del huésped del virus con rasgos patológicos, dando así pistas sobre la participación de las proteínas virales. En patogénesis, se pueden extraer interacciones específicas del genotipo, que potencialmente corresponden a tropismo o biomarcadores patógenos.

Como se ilustra aquí para E seis parejas que interactúan, los objetivos celulares se clasificaron en función de la intensidad de la interacción y se agruparon según el tipo de VPH que interactuaba. Esta representación permite la identificación de biomarcadores específicos como el fad, que interactúa solo con las seis proteínas E del VPH oncogénico. Esta focalización debe ser crucial para el rasgo cancerígeno de todos los VPH oncogénicos y, por lo tanto, constituye un buen candidato para ser utilizado como marcador sustituto de la infección por VPH o como diana terapéutica.

Siguiendo este procedimiento. El H-T-G-P-C-A se puede adaptar para ser utilizado con una tercera proteína, expresada como una fusión con una etiqueta de biotina. Esto permite la captura de tres complejos asociados en placas de color de buceo con estreptococos, y esto puede responder a la cuestión de la formación de grandes complejos proteicos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo caracterizar las interacciones entre patógenos y hostigadores. En tercer lugar, sondeando a los compañeros de interacción de múltiples variantes de cepa. En segundo lugar, comparando su interacción con todo un conjunto de tipos de patógenos utilizando una duración de proteína proteica, por ejemplo, en células de mamíferos.