Un enfoque comparativo para caracterizar el paisaje del Huésped-Patógeno interacciones proteína-proteína

El objetivo general del siguiente experimento consiste en realizar estudios ectómicos para comparar los perfiles de interacción de proteínas procedentes de diferentes variantes de patógenos frente a un conjunto común de factores celulares. Esto se logra mediante cribados basados en levadura de dos híbridos, utilizando ADNc, para identificar posibles socios de interacción de proteínas de diferentes variantes de patógenos. Como segundo paso, las marcos abiertos de lectura de los socios de interacción se secuencian y transfieren a vectores compatibles para su posterior validación.

A continuación, se selecciona un conjunto de socios individuales resultantes de todas las pruebas de doble híbrido y se vuelven a evaluar para determinar su interacción con el rango completo de cepas estudiadas. Esto se realiza mediante un ensayo ortogonal de complementación de fragmentos proteicos basado en luciferasa, llevado a cabo en células de mamífero, con el fin de obtener conjuntos de datos comparativos robustos sobre las interacciones. Los resultados muestran diferentes intensidades de interacción entre las proteínas del patógeno y las proteínas celulares según las mediciones de luciferasa obtenidas, proporcionando así una visión comparativa de las interacciones entre proteínas del huésped y proteínas del patógeno.

El procesamiento de los perfiles de interacción mediante agrupamiento jerárquico correlaciona interacciones específicas huésped-patógeno con rasgos patológicos y proporciona información sobre la participación de proteínas del patógeno en la patogénesis. La principal ventaja de este enfoque frente a otros métodos que mapean interacciones proteína-proteína huésped-patógeno es que ofrece un conjunto de datos comparativos riguroso entre múltiples variantes de cepas. Estas técnicas proporcionan información sobre la red de interacciones de una proteína del patógeno, pero también pueden aplicarse a otros sistemas como molécula infecciosa utilizando virus completos y la genética de ríos, por ejemplo. Comience este protocolo con el apareamiento y la siembra de las células de levadura tal como se describe en el protocolo escrito para la siembra.

30 mililitros de medio selectivo de deprivación sin triptófano con pocas colonias de la cepa de levadura AH 1 0 9 transformada con el plásmido P-G-B-K-T siete que expresa la proteína del patógeno. Incubar durante 30 horas a 30 grados Celsius con agitación. A continuación, sembrar 200 mililitros de medio selectivo de deprivación menos triptófano con los 30 mililitros de AH 1 0 9.

Los cultivos se incuban con rotación durante 20 horas a 30 grados Celsius. Asimismo, incubar el ADNc transformado en la cepa Y 187 en 20 mililitros de medio YP durante 10 minutos a 30 grados Celsius con rotación. Luego, centrifugar un volumen del cultivo AH 109 transformado con PG BK T siete, correspondiente a una cantidad equivalente de células de levadura Y 187 viables, durante cinco minutos a 3.500 RPM y 20 grados Celsius.

Retire cuidadosamente el sobrenadante y resuspenda el paladar en 10 mililitros de pegamento YP. Mezcle la levadura AH 109 resuspendida con la biblioteca que contiene Y 187. Transfiera a un tubo de 50 mililitros antes de centrifugar durante cinco minutos a 3.500 RPM y 20 grados Celsius.

Después de retirar cuidadosamente el sobrenadante de Resus, suspenda el precipitado en pegamento YP para obtener un volumen total de 1,5 mililitros. A continuación, distribuya la levadura sobre tres placas de agar YCM de 150 milímetros, con 0,5 mililitros por placa, e incube durante 4,5 horas a 30 grados Celsius. Recoja la levadura apareada de las placas YCM raspando con un rastrillo de vidrio en 10 mililitros de medio selectivo de privación sin leucina, triptofano e histidina.

Lave la placa dos veces con cinco mililitros del mismo medio y reúna tras la centrifugación durante cinco minutos a 3.500 RPM y 20 grados Celsius. Descarte el sobrenadante y reutilice. Suspenda el botón de levadura en cinco mililitros de medio selectivo de exclusión deficiente en leucina, triptófano e histidina.

Luego, extienda la levadura apareada sobre 10 placas de agar selectivo de depleción sin leucina, triptófano e histamina, suplementadas con la concentración adecuada de tres amino triazol o tres a t, según se determinó en la prueba de autoactivación. Calcule la tasa de diploides según se describe en el protocolo escrito, tras incubar a 30 grados Celsius en una atmósfera humedecida durante seis a 10 días. Seleccione colonias de levadura y transfiéralas a placas preparadas recientemente con agar selectivo de depleción sin leucina, triptófano e histidina, más tres a t.

Pedir la levadura en un esquema de ocho filas de 12 pocillos que reproduzca una placa de 96 pocillos para facilitar posteriormente la secuenciación. Deje que las colonias de levadura crezcan durante cuatro o cinco días a 30 grados Celsius en una atmósfera humedecida. El objetivo de esta sección es amplificar por PCR el ADNc contenido en los vectores PA ct dos de colonias de levadura lisadas cultivadas en agar selectivo de descarte sin leucina, triptófano e histidina.

Comience colocando una placa PCR de 96 pocillos sobre hielo para lisar las células de levadura con 50 microlitros por pocillo de solución xmal 20 T. Suspender suavemente una colonia por pocillo. Incubar la placa 15 minutos a 37 grados Celsius y 15 minutos a 95 grados Celsius.

Después de colocar la placa nuevamente sobre hielo, agregue 50 microlitros de agua destilada por pocillo mezclando mediante pipeteo arriba y abajo, y proceda a centrifugar durante cinco minutos a 3.500 RPM y cuatro grados Celsius. Después de preparar la mezcla X tack según se describe en el protocolo escrito, distribuya 40 microlitros de la mezcla por pocillo en la placa PCR de 96 pocillos. Agregue 10 microlitros del levadura lisada por pocillo y realice la amplificación según se indica en el protocolo escrito.

Corra tres microlitros de los productos de PCR en un gel de agarosa al 1,2 % para detectar los clones positivos por PCR. Secuencie los fragmentos amplificados por PCR aislados de estos tres clones positivos. Luego, realice un análisis BLAST para identificar marcos de lectura abiertos celulares, descartando alineamientos de baja confianza, así como secuencias que contengan corrimientos del marco de lectura y códigos de paro prematuros antes de la transfección celular.

Transfiera las marcos de lectura abierta de proteínas patógenas y proteínas celulares a sus respectivos vectores para generar proteínas fusionadas a fragmentos de la luciferasa Gaia según se describe en el protocolo de texto. Siembre células 293T a 350.000 células por mililitro de DMEM con 10 % de suero bovino fetal sin antibiótico. Distribuya 100 microlitros por pocillo en placas de cultivo blancas estériles antes de cultivar durante 24 horas a 37 grados Celsius con 5 % de dióxido de carbono al día siguiente. Transfecte las células utilizando cualquier protocolo de transfección adecuado; utilice 100 nanogramos por pocillo de ambos constructos plasmídicos de marco de lectura abierta del patógeno y del huésped, y transfecte 10 nanogramos por pocillo del plásmido de luciferasa CMV de luciérnaga para normalizar la eficiencia de transfección.

Cada punto se prueba en tres réplicas en la mezcla de transfección transferida a las placas de células 293T cultivadas. Tenga cuidado de depositar suavemente la mezcla de ADN sobre las células, ya que las células 293T no son fuertemente adherentes y se desprenden fácilmente del fondo del pocillo. Incube en una incubadora de cultivo celular durante 24 a 30 horas a 37 grados Celsius con 5 % de dióxido de carbono. Lave las células con PBS usando 100 microlitros por pocillo. Añada 40 microlitros de tampón de lisis 1 x, y luego incube durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Bajo agitación, guarde 10 microlitros de lisados celulares en otra placa blanca para la posterior cuantificación de la luciferasa de luciérnaga, almacenados a cuatro grados Celsius o alternativamente a menos veinte grados Celsius como máximo, para medir la actividad Gaia. Coloque la placa en un luminómetro e inyecte 100 microlitros de reactivo de ensayo de luciferasa vainilla sobre los lisados celulares. Luego, cuente la luminiscencia durante 10 segundos.

La dosificación en una placa de 96 pocillos toma aproximadamente media hora. Utilice siempre extractos frescos, ya que la congelación o el almacenamiento prolongado podrían afectar la actividad de Gaia mediada por interacciones en los extractos celulares restantes de 10 microlitros. Inyecte 50 microlitros de reactivo de ensayo de luciferasa de luciérnaga sobre los lisados celulares utilizando un luminómetro y mida la luminiscencia durante 10 segundos.

La dosificación de una placa de 96 pocillos toma aproximadamente media hora para cada interacción. Calcule la relación entre la actividad de la luciferasa Gaia y la actividad de la luciferasa de luciérnaga para obtener un valor de luminiscencia GAIA normalizado, teniendo en cuenta la eficiencia de transfección y la viabilidad celular.

Calcule el valor medio de los tres replicados para monitorear la interacción. Estime una razón de luminiscencia normalizada o NLR para cada par patógeno-huésped. Para ello, divida la actividad de luminiscencia GAIA normalizada detectada en presencia de ambas proteínas, patógeno y huésped, por la suma de las actividades medidas en los pocillos de control.

El valor umbral del NLR para interacciones positivas se ha estimado en un estudio previo en aproximadamente 3,5. Una ventaja importante de los principios del ensayo de COMPLEMENTACIÓN de proteínas de alto rendimiento, o H-T-G-P-C-A, radica en su alta sensibilidad, como se ilustra mediante la evaluación de las tasas de falsos positivos y falsos negativos para las dos proteínas de HPVE, a fin de determinar la tasa de falsos negativos. Se evaluaron mediante H-T-G-P-C-A interacciones conocidas de la proteína E2 del VPH 16; de 18 interacciones, cuatro no se recuperaron, lo que corresponde a una tasa de falsos negativos del 22 %.

Las interacciones falsas positivas se midieron en un 5,8 % utilizando 12 proteínas E2 del VPH frente a un conjunto aleatorio de proteínas celulares. La alta especificidad del método queda resaltada en esta figura, que muestra cómo una única mutación puntual conocida por interferir con la unión de E2 a su pareja celular BRD4 anula la relación NLR. Este enfoque ectómico comparativo a gran escala se ha aplicado recientemente con éxito a tres proteínas tempranas de los virus del papiloma humano, E2, E6 y E7, procedentes de diferentes genotipos, representativos de su diversidad natural en tropismos y patologías para cada una de las proteínas tempranas.

La agrupación jerárquica de los perfiles de interacción recapitula en su mayor parte la filogenia del VPH, demostrando la solidez del enfoque y el alcance de los conjuntos de datos de interacciones. Puede utilizarse para correlacionar perfiles específicos de interacción virus-huésped con características patológicas, proporcionando así pistas sobre la participación de proteínas virales. En la patogénesis, pueden extraerse interacciones específicas de genotipo, que potencialmente corresponden a biomarcadores de tropismo o patogenicidad.

Como se ilustra aquí para seis socios de interacción de E, los objetivos celulares se ordenaron según la intensidad de la interacción y se agruparon de acuerdo con el tipo de VPH que interactúa. Esta representación permite la identificación de biomarcadores específicos, como fad, que solo interactúa con las proteínas E seis de VPH oncogénicos. Dicha diana debe ser crucial para el rasgo carcinogénico de todos los VPH oncogénicos y, por lo tanto, constituye un buen candidato para utilizarse ya sea como marcador sustituto de la infección por VPH o como diana terapéutica.

Tras seguir este procedimiento, la H-T-G-P-C-A puede adaptarse para utilizarse con una tercera proteína expresada como una fusión con una etiqueta de biotina. Esto permite la captura de tres complejos de proteínas asociadas en placas de colorante de estreptavidina, lo que puede responder a la pregunta sobre la formación de complejos proteicos grandes.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo caracterizar las interacciones entre patógenos y hospedadores. En tercer lugar, analizando los socios de interacción de múltiples variantes de cepas. En segundo lugar, comparando sus interacciones con un conjunto completo de tipos de patógenos mediante una duración proteína-proteína, por ejemplo, en células de mamífero.